一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，公开了一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法，利用超声和搅拌将层状膨润土剥离成单片的纳米胶体溶液，通过调节酶和膨润土薄片端面的表面电荷，使酶分子吸附在带负电的膨润土纳米片层表面，同时利用膨润土带负电的片层表面和带正电的端面之间的静电吸引，组装成“卡片屋”型的固定化酶。本发明利用酶分子与膨润土纳米片层表面的阳离子之间的离子交换，使酶分子分散的固定在原有的阳离子点位上，有效避免了酶固定化过程中的聚集问题，大大提高了酶分子的负载量，本方法得到的固定化酶的催化活性得到显著提高，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低于游离酶的缺点，同时实现了生物酶的多批次稳定化操作。
【专利说明】一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及了一种膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法。
【背景技术】 [0002]生物酶是一种高效专一的催化剂，具有反应条件温和、能耗低、副产物少等优点，广泛应用于化学产品(中间体)的制备、纺织印染、环境修复等领域。但是由于酶容易失活、稳定性差、难以回收利用等致命弱点，再加上酶制剂高昂的价格，极大的限制了其在工业化生产中的应用。酶的固定化是一种提高催化稳定性、实现酶循环利用行之有效的方法。但生物酶在固定化过程中，由于载体对酶空间构象产生影响，以及包括空间位阻和传质阻力等影响，其催化活性往往会有所下降。近年来研究发现，在合适的条件下，以水滑石、磷酸锆等层状无机材料为载体负载生物酶蛋白分子可以制备得到高效稳定、具有层状结构的固定化酶。如An等先将层间插入乳酸分子的水滑石剥离，然后将脂肪酶结合到剥离的水滑石片层上，利用水滑石的“记忆功能”，组装成具有层状结构的固定化脂肪酶(AICHE J.2010，56:2677-2686)。中国专利CN1884515A公开了一种纳米片状氧化钛组装酶的方法，该方法利用有机胺剥离层状钛酸盐，得到的纳米片吸附血红蛋白，然后自组装成具有层状结构的固定化酶。另外，氧化还原酶、肌红蛋白等也能通过类似的方法插入到磷酸锆等层状结构中，制备得到催化活性较高、具有层状结构的固定化酶(J.Am.Chem.Soc.2000，122:830-837;J.Am.Chem.Soc.2004，126:14346-14347;Langmuir, 2004，20:10231-10237; J.Mater.Chem.2005，15:3838-3843)。但是上述制备过程中，都加入了诸如有机胺、乳酸、氨丙基三乙氧基硅烷等有机化合物，有些还加入强酸强碱，这些对酶蛋白和环境都会产生不利影响。
[0003]膨润土作为一种无机层状矿物材料，具有储量丰富、价格低廉、机械强度高、比表面积大、生物相容性好、结构和功能可调等特点，其层状结构由长、宽和高分别约为lOOnm、IOOnm和Inm的纳米薄片堆积排列而成，片层之间的层间距约为1.2nm左右。中国专利CN1286719C、CN101823722A和CN101049941A等公开了几种将膨润土层状结构剥离制备无机凝胶的方法，这些方法大都分为离心分离、制浆、改性和胶化等步骤，制备工艺相对比较复杂，主要用于制备应用在石油化工、涂料、造纸和纺织等行业，具有高纯度、高粘度的膨润土无机凝胶。迄今为止，将膨润土剥离用于负载生物酶大分子还未有报道。
[0004]目前，膨润土负载生物酶的方法主要有层间插入和外表面吸附两种。Lin等利用聚氧丙烯二胺(POP)等高分子化合物插入到钠基膨润土将其层间距撑开，然后将牛血清白蛋白、a -糜蛋白酶等生物大分子插入层间制备固定化酶(Langmuir，2007, 23:1995-1999; J.Phys.Chem.B, 2007, 111:10275-10280;Bioconjugate Chem.2008，19:138-144)。由于该方法加入了大量的聚合物，对酶蛋白在负载过程中容易产生挤压、干扰以及空间位阻，从而导致酶催化活性的下降。而且，该方法由于无法实现酶分子在载体层间和外表面的可控结合，部分结合在膨润土外表面的酶蛋白很容易脱落，影响酶的催化稳定性。其他已报道的以膨润土为载体制备固定化酶的方法主要是将酶分子直接吸附在膨润土外表面(如图1所不)(Process Biochem.2005，40:2155_2159;Appl.Clay Sc1.2008, 43:289-295;Appl.Clay Sc1.2008,43:308-316;Mater.Sc1.Eng.B-Adv.2009, 165:173-177;Bioresour.Technol.2010, 101:1587-1594)。在此过程中，有部分生物酶的氨基酸残基通过静电吸引、疏水和氢键作用力进入了膨润土层间，但是整个酶分子由于体积太大，无论是钠基膨润土还是有机改性膨润土的层间都无法容纳酶分子进入层间。利用这些方法制备得到的固定化酶，其酶分子大部分吸附在膨润土外表面，直接暴露在反应介质中，而且生物酶与载体之间的疏水、氢键等作用力相对较弱，酶分子之间容易发生聚集和重叠吸附，因此固定化酶催化性能的提高也非常有限。此外，由于生物酶基本没有接触到表面积更大的膨润土片层表面，因此载体对酶的负载量也比较低，造成载体使用效率的低下。本发明人也曾对膨润土及改性膨润土外表面吸附脂肪酶进行了研究，发现该固定化酶的载酶量不高(最大负载量约为80mg/g载体)，在水相中的催化活性也远低于游离酶，而且随着负载量的增加固定化酶的催化活性也急剧下 降。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种载酶量和稳定性高，同时也能保持高催化活性的膨润土单层剥离纳米片组装酶及其制备方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决:
[0007]—种膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，包括以下步骤:
[0008]步骤(1):在pH4_6的缓冲液中加入电解质，然后加入膨润土制成膨润土悬浮液，室温下，将膨润土悬浮液置于超声仪中超声处理，同时搅拌l_5h，制得膨润土单层纳米薄片胶体溶液；
[0009]步骤(2):取步骤(1)制得的胶体溶液，加入生物酶与胶体溶液进行混合，在25°C下振荡10-24h，反应结束后进行离心得到沉淀，该沉淀用去离子水润洗至中性，冷冻干燥后得到产物固定化酶。本发明方法通过超声和搅拌将膨润土层状材料剥离成比表面积大的单层纳米薄片，分散在含有一定量的电解质的缓冲体系中制成胶体溶液，通过控制纳米片层的表面和端面电荷、酶分子的表面电荷，使酶分子通过离子交换吸附在带负电的单层纳米片表面，凭借纳米片层带正电的端面和带负电的表面之间的静电吸引组装成固定化酶。上述制备过程中没有加入任何有机溶剂和有机化合物，条件温和，真正实现了固定化酶的绿色制备。
[0010]作为优选，所述的步骤(1)中的电解质选取NaCl、Na2C03、Na2S04中任一种，电解质的加入能够减弱膨润土层间正负离子之间的吸引，使原来致密的层间结构变得蓬松，从而促进膨润土的剥离。
[0011 ] 作为优选，所述的步骤(1)中的膨润土采用钠基膨润土、钙基膨润土中任一种。膨润土片层较高的机械强度，以及片层端面与表面之间的静电吸引使大部分的酶分子被保护在载体中，有效的减少了催化过程中酶分子的脱落问题，提高了固定化酶的催化稳定性。
[0012]作为优选，所述的步骤(1)超声处理频率为20-60KHZ，经合适频率的超声波冲击和空化作用，有效破坏膨润土的层间结合力，使膨润土单层薄片易于剥离。
[0013]作为优选，所述的步骤(2)中生物酶的加入量为膨润土质量的1-5倍(生物酶/膨润土为1:1-1:5, w/w)0生物酶分子与单层薄片上的钠离子的离子交换使酶分子能分散的固定在片层表面原来的钠离子点位上，既实现了目标酶蛋白分子的浓缩(去除了酶制剂中电负性不同、或带电量弱的杂蛋白)，同时又有效的避免了酶分子在催化过程中的聚集，使酶催化活性得到显著增强。
[0014]作为优选，所述的步骤(2)中离心速率为10000-15000rpm。由于是纳米型固定化酶，离心速率过低的话，离心效果较差，离心速率过高的话，对设备和能耗的要求过大。
[0015]作为优选，所述的膨润土的浓度为0.1%-1.0%。
[0016]作为优选，所述的电解质的浓度为0.1%-1.0%。电解质浓度过大会影响材料的结构和性能，以及固定化酶的催化活性。
[0017]作为优选，所述的生物酶为蛋白酶、脂肪酶、酯酶等酶催化剂中的其中一种。不同的酶负载后，负载量和催化活性有所差别，但都有不同程度的提高。
[0018]本发明利用酶分子与膨润土纳米片层表面的阳离子(Na+、Ca2+)之间的离子交换，使酶分子分散的固定在原有的阳离子点位上，不仅有效避免了酶固定化过程中的聚集问题，而且大大提高了酶分子的负载量(可以实现每g载体3.5g酶蛋白的最高负载量)。
[0019]本发明还提供了一种利用上述方法制得的膨润土单层剥离纳米片组装酶(如图2所示)。
[0020]本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果:
[0021](1)制备过程中没有加入任何有机溶剂和有机化合物，条件温和，真正实现固定化酶的绿色制备。
[0022](2)剥离出来的膨润土单层纳米薄片较大的比表面积能实现Ig载体负载最高达
3.5g生物酶的载酶量，提高了载体的利用效率。
[0023](3)生物酶分子与单层薄片上的钠离子的离子交换使酶分子能分散的固定在片层表面原来的钠离子点位上，既实现了目标酶蛋白分子的浓缩(去除了酶制剂中电负性不同、或带电量弱的杂蛋白)，同时又有效的避免了酶分子在催化过程中的聚集，使酶催化活性得到显著增强。
[0024](4)膨润土片层较高的机械强度，以及片层端面与表面之间的静电吸引使大部分的酶分子被保护在载体中，有效的减少了催化过程中酶分子的脱落问题，提高了固定化酶的催化稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1生物酶负载在膨润土外表面的结构示意图。
[0026]图2生物酶负载在膨润土纳米薄片组装酶的结构示意图。
[0027]图3膨润土纳米片组装酶的制备工艺流程图。
[0028]图4实施例1中膨润土未负载脂肪酶(a)的X-射线衍射图。
[0029]图5实施例1中负载脂肪酶后(b)的X-射线衍射图。
[0030]图6实施例2中固定化脂肪酶的TEM图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图1至附 图6与实施例对本发明作进一步详细描述:[0032]实施例1
[0033]称取NaC14.5g溶于500mLpH4.0的醋酸盐缓冲溶液中，加入钠基膨润土 5g制成浓度为1%的膨润土悬液。室温下，将该悬液置于超声仪中超声处理(频率为40KHz)，同时开启搅拌机在3000rpm下搅拌,每超声Ih后停止20min。连续处理4h后，3000rpm下离心IOmin弃去沉淀，加PH4.0醋酸盐缓冲液稀释得到lmg/mL的膨润土剥离纳米薄片胶体溶液。取IOOmL该胶体溶液，加入IOOmg牛胰脂肪酶混合，混合液在25°C、200rpm下振荡20h。结束后，将该混合液在15000rpm下离心lOmin，得到沉淀。用去离子水洗涤沉淀数次至中性，冷冻干燥12h后得到固定化脂肪酶固体。将上清液和洗涤液合并，利用Bradford法测定合并溶液中的剩余蛋白量为Omg，得到脂肪酶在载体上的负载量为lOOmg，负载的脂肪酶蛋白与载体的质量比为1:1。以脂肪酶水解对硝基苯棕榈酸酯为模式反应，测定不同脂肪酶负载量下固定化脂肪酶的催化活性，发现固定化酶最高催化活性为游离酶的5倍。每批反应结束，将固定化酶离心后用于下一批反应，考察固定化酶的重复利用性能。发现反应10批之后，固定化酶的催化活性仍保持为初始活性的85%以上，显示出良好的操作稳定性。
[0034]利用XRD测定膨润土单层薄片负载和未负载脂肪酶情况下的层间距变化，发现未负载脂肪酶的膨润土薄片经干燥后，在原来的位置上仍然出现了晶体衍射峰，说明该载体恢复成一定的层间结构；而单层薄片负载脂肪酶后，其晶体衍射峰完全消失，说明膨润土单层纳米薄片经脂肪酶负载后变成了无定型的结构。由于在PH4.0条件下，膨润土纳米薄片的端面带正电，表面带负电，通过静电吸引将端面和表面连接起来，使固定化酶形成了“卡片屋”式的结构。
[0035]实施例2
[0036]称取Na2S043g溶于500mLpH4.0的醋酸盐缓冲溶液中，加入钠基膨润土 5g制成浓度为1%的膨润土悬液。室温下，将该悬液置于超声仪中超声处理(频率为50KHz)，同时开启搅拌机在2500rpm下搅 拌,每超声Ih后停止20min。连续处理3h后,3000rpm下离心IOmin弃去沉淀,加pH4.0醋酸盐缓冲液稀释得到2mg/mL的膨润土剥离纳米薄片胶体溶液。取该溶液 IOOmL,加入脂肪酶 YLL (Yarrawia lipolytica lipase) 400mg,混合后在 25°C、200rpm下振荡24h。结束后,将混合液在15000rpm下离心IOmin,得到沉淀。用去离子水洗涤沉淀数次至中性，冷冻干燥12h后得到固定化脂肪酶固体。合并上清液和洗涤液，利用Bradford法测定合并溶液中的蛋白量为42mg，得到脂肪酶在载体上的负载量为358mg，负载的脂肪酶蛋白与载体的质量比为3.58:1。以脂肪酶水解对硝基苯棕榈酸酯为模式反应，测定不同脂肪酶负载量下固定化脂肪酶的催化活性，发现固定化酶最高催化活性为游离酶的3.5倍。每批反应结束，将固定化酶离心后用于下一批反应，考察固定化酶的重复利用性能。发现反应10批之后，固定化酶的催化活性仍保持为初始活性的90%以上，显示出良好的操作稳定性。利用XRD测定发现，固定化脂肪酶固体也没有出现相应的衍射峰(图略)，说明膨润土载体原有的层间结构不复存在，推测固定化酶形成了“卡片屋”式的结构。同时，该固定化酶的TEM (磷钨酸负染法)图(如图6所示)显示，酶蛋白负载量得到提高的同时，酶分子都很分散的固定在载体材料上，因此能保持高催化活性。
[0037]实施例3
[0038]称取NaC14.5g溶于500mLpH6.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入钙基膨润土 2.5g制成浓度为0.5%的膨润土悬液。室温下，将该悬液置于超声仪中超声处理(频率为60KHz)，同时开启搅拌机在3000rpm下搅拌,每超声Ih后停止20min。连续处理5h后,3000rpm下离心IOmin弃去沉淀,加入pH6.0磷酸盐缓冲液稀释得到0.5mg/mL的膨润土剥离纳米薄片胶体溶液。取该溶液IOOmL,加入180mg胰蛋白酶，在25°C、200rpm下振荡24h。结束后，将该反应液在15000rpm下离心IOmin,得到沉淀。用去离子水洗漆沉淀数次至中性,冷冻干燥12h后得到固定化胰蛋白酶固体。合并上清液和洗涤液，利用Bradford法测定合并溶液中的蛋白量为30mg，得到蛋白酶在载体上的负载量为150mg，负载的胰蛋白酶与载体的质量比为3:1。以蛋白酶水解BAEE为模式反应，测定不同蛋白酶负载量下固定化胰蛋白酶的催化活性，发现固定化酶最高催化活性为游离酶的2.8倍。每批反应结束，将固定化酶离心后用于下一批反应，考察固定化酶的重复利用性能。发现反应6批之后，固定化酶的催化活性仍保持为初始活性的85%以上，显示出良好的操作稳定性。利用XRD测定发现，固定化胰蛋白酶固体没有出现相应的衍射峰(图略)，说明膨润土载体原有的层间结构不复存在，推测固定化酶形成了 “卡片屋”式的结构。
[0039]实施例4
[0040]称取Na2C032.5g溶于500mLpH5.0的醋酸盐缓冲溶液中，加入钙基膨润土 3g制成浓度为0.6%的膨润土悬液。室温下，将该悬液置于超声仪中超声处理(频率为40KHz)，同时开启搅拌机在3000rpm下搅拌,每超声Ih后停止20min。连续处理5h后,3000rpm下离心IOmin弃去沉淀,加入pH5.0醋酸盐缓冲液稀释得到lmg/mL的膨润土剥离纳米薄片胶体溶液。取IOOmL该胶体溶液，加入200mg糜蛋白酶，在25°C、200rpm下振荡24h。结束后，将该反应液在15000rpm下离心IOmin,得到沉淀。用去离子水洗漆沉淀数次至中性,冷冻干燥12h后得到固定化糜蛋白酶固体。合并上清液和洗涤液，利用Bradford法测定合并溶液中的蛋白量为35mg，得到蛋白酶在载体上的负载量为165mg，负载的糜蛋白酶与载体的质量比为1.65:1。以蛋白酶水解BAEE为模式反应，测定不同糜蛋白酶负载量下固定化糜蛋白酶的催化活性，发现固定化酶最高催化活性为游离酶的5倍。利用XRD测定发现，固定化糜蛋白酶固体没有相应的衍射峰( 图略)，说明膨润土载体原有层间结构不复存在，推测固定化酶形成了“卡片屋”式的结构。
[0041]实施例5
[0042]称取NaC13g溶于500mLpH4.0的醋酸盐缓冲溶液中，加入钠基膨润土 5g制成浓度为1%的膨润土悬液。室温下，将该悬液置于超声仪中超声处理(频率为40KHz)，同时开启搅拌机在3000rpm下搅拌,每超声Ih后停止20min。连续处理4h后，3000rpm下离心IOmin弃去沉淀，加入PH4.0醋酸盐缓冲液稀释得到0.5mg/mL的膨润土剥离纳米薄片胶体溶液。取IOOmL该胶体溶液，加入200mg牛血清白蛋白，在25°C、200rpm下振荡24h。结束后，将该反应液在15000rpm下离心IOmin,得到沉淀。用去离子水洗漆沉淀数次至中性,冷冻干燥12h后得到固定化牛血清白蛋白固体。合并上清液和洗涤液，利用Bradford法测定合并溶液中的蛋白量为25mg，得到蛋白酶在载体上的负载量为175mg，负载的牛血清白蛋白与载体的质量比为3.5:1。利用XRD测定发现，固定化牛血清白蛋白固体没有出现相应的衍射峰(图略)，说明膨润土载体原有层间结构不复存在，推测固定化牛血清白蛋白形成了“卡片屋”式的结构。
[0043]本发明利用酶分子与膨润土纳米片层表面的阳离子(Na+、Ca2+)之间的离子交换，使酶分子分散的固定在原有的阳离子点位上，不仅有效避免了酶固定化过程中的聚集问题，而且大大提高了酶分子的负载量(可以实现每g载体3.5g酶蛋白的最高负载量)。该制备方法无需加入任何有机溶剂和有机化合物，与大部分酶固定化过程中要加入有机溶剂和有机化合物相比，本方法真正实现了酶催化剂的绿色制备。本发明制备得到的固定化酶的催化活性得到显著提高(水相中的催化活性最高为游离酶的5倍)，克服了一般固定化酶在水相中的催化活性要低于游离酶的缺点，同时实现了生物酶的多批次稳定化操作。
[0044]总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤(1):在PH4-6的缓冲液中加入电解质，然后加入膨润土制成膨润土悬浮液，室温下，将膨润土悬浮液置于超声仪中超声处理，同时搅拌l_5h，制得膨润土单层纳米薄片胶体溶液；步骤(2):取步骤(1)制得的胶体溶液，加入生物酶与胶体溶液进行混合，在25°C下振荡10-24h，反应结束后进行离心得到沉淀，该沉淀用去离子水润洗至中性，冷冻干燥后得到产物固定化酶。
2.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的步骤(1)中的电解质选取NaCl、Na2CO3^ Na2SO4中任一种。
3.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的步骤(1)中的膨润土采用钠基膨润土、钙基膨润土中任一种。
4.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的步骤(1)超声处理频率为20-60KHZ。
5.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的步骤(2)中生物酶的加入量为膨润土质量的1-5倍。
6.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的步骤(2)中离心速率为10000-15000rpm。
7.根据权利要求1所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的膨润土的浓度为0.1%-1.0%。
8.根据权利要求1所述`的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的电解质的浓度为0.1%-1.0%。
9.根据权利要求1或5所述的膨润土单层剥离纳米片组装酶的制备方法，其特征在于:所述的生物酶为蛋白酶或脂肪酶。
10.一种利用所述权利要求1-9任一方法制得的膨润土单层剥离纳米片组装酶。
【文档编号】C12N11/14GK103627694SQ201310606938
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】董华平, 李益民, 李建法, 盛国栋, 吴梦琪, 徐丹红 申请人:绍兴文理学院