一种甘露聚糖酶及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，具体提供了一种来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因及其应用。本发明通过将枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因导入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达甘露聚糖酶，摇瓶发酵酶活达912U/mL。重组甘露聚糖酶的最适作用pH为4，最适作用温度为58℃，可广泛用于饲料添加剂领域。
【专利说明】一种甘露聚糖酶及其应用
[0001]【技术领域】
本发明属于微生物工程【技术领域】，具体涉及一种甘露聚糖酶及其应用。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β -1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β_甘露聚糖等。它不仅能够降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼柏尤其是豆柏的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有所提闻。
[0003]甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其它植物性饲料原料中含量也很高，如豆柏、小麦、菜籽柏、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量分别为22.7%、11.9%、19.6%和33.7%。
[0004]我国猪、鸡的主要日粮是玉米-豆柏型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆柏的能量利用率仅为50%~60%。单胃动物对豆柏能量的利用率如此低的原因可能是豆柏中含有的22.7%的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖，降低消化道内容物粘度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。因此，目前对甘露聚糖酶的研究是热点内容。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种新型甘露聚糖酶及其应用。本发明通过将来源于枯草芽孢杆菌subtilis)的甘露聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到了高效重组表达甘露聚糖酶的工程菌株，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明一方面提供了一种来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶，其特征在于:
(a)其氨基酸序列为SEQID NO: 1的甘露聚糖酶；
(b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。
[0007]用于编码上述甘露聚糖酶的基因，其中一种编码核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
[0008]本发明的另一方面涉及上述甘露聚糖酶在饲料中的应用。
[0009]本发明通过将枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因导入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达甘露聚糖酶，摇瓶发酵酶活达912U/mL。重组甘露聚糖酶的最适作用pH为4，最适作用温度为58°C。在减少日粮能量值的条件下，通过在日粮中添加本发明的甘露聚糖酶，实验组肉鸡日增重、育肥指数比正对照组分别高2%、2.6%，料肉比比正对照组降低了 5.6%，说明本发明的甘露聚糖酶能显著提高饲料的利用率，提高肉鸡的日增重和育肥指数，降低料重比，从而可以减少畜禽养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。【具体实施方式】
[0010]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0011]实施例1甘露聚糖酶基因的克隆
挑取新鲜的枯草芽孢杆菌CGMCC1.897 (购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)单菌落于5mL LB液体培养基中，37°C摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)的说明提取染色体。
[0012]根据NCBI上甘露聚糖酶同源序列设计引物，以枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸60s，30个循环后，72°C延伸lOmin。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将该产物命名为#a/7-7。
[0013]洛Man-Ι克隆至pMD18_T载体，构建得到质粒pT-Man_l，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得#細-7基因序列为SEQ ID NO: 1，其编码氨基酸序列为SEQ ID N0:2。将该序列进行NCBI同源序列比对，确定ife/7-2基因为一新的甘露聚糖酶基因，与现有公开序列相似性最高为88%。
[0014]实施例2表达载体的构建
以质粒ρΤ-Man-l为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是95°C 4min ；94°C30S ；55°C 40S,72°C 1.2min 30 个循环；72°C 7min。凝胶回收扩增产物；RI 和 Not I双酶切。对表达质粒PPIC9K 也进行RI和Not I双酶切；用T4连接酶把上述双酶切产物4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Man-1。
[0015]实施例3毕赤酵母工程菌的构建
将表达质粒pPIC-Man-Ι用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3yg/μ L浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(含ImM MgCl2,10mM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在80yL感受态细胞中加入5yL线性化重组质粒；电转化(条件为1500V、200 Ω、25 μ F);最后涂布于丽平板(丽培养基组分:1.34%YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，挑选一个重组菌株，命名为毕赤酵母 Man-1 {Pi chi a pas tori s Man_l)。
[0016]实施例4发酵和酶学性质测定
将毕赤酵母工程菌Man-1接种于5ml BMGY ( 1 %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 %YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(1%酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小时补加50 μ L甲醇，诱导培养5天，200rpm,离心5分钟，取发酵液上清液，进行酶学性质和耐受性分析。
[0017]甘露聚糖酶酶活测定方法如下所述:
以0.6%槐豆胶甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)为底物，以0.1M醋酸-醋酸钠(pH5.5)为缓冲液，将甘露聚糖底物37°C平衡20min，将待测酶液37°C平衡lOmin。取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml DNS溶液，在37°C ±0.5°C水浴30分钟。然后三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn处测吸光度。
[0018]甘露聚糖酶酶活定义:在37°C、pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生Iymol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。
[0019]按照上述测定方法测定发酵液上清的酶活为912U/mL，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效重组表达甘露聚糖酶。
[0020]1、最适pH分析
用 pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的缓冲液进行稀释测定，在温度55°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组甘露聚糖酶的最适PH值为4.0。
[0021]2、最适温度分析
分别在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C，ρΗ5.5 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组甘露聚糖酶的最适温度为58°C。
[0022]实施例5本发明的甘露聚糖酶在畜禽养殖中的应用
本实验在肉鸡商品日粮基础上降低150kcal/kg的代谢能，然后在日粮中添加本发明的重组甘露聚糖酶。通过对肉鸡生产性能的评价，探讨甘露聚糖酶对低能日粮能量利用率的改善幅度。
[0023]采购I日龄罗氏308白羽肉公鸡，分为正负对照组和实验组，每个处理组16个重
复，每个重复8羽鸡，生产试验期为35天；正对照组:正常商品日粮处理组；负对照组:在对
照日粮基础上降低150kcal/kg代谢能；试验组:在负对照日粮基础上添加100-200克/吨
本发明的重组甘露聚糖酶(50000U/g)，试验结果如下表所示:
【权利要求】
1.一种甘露聚糖酶，其特征在于: Ca)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的甘露聚糖酶； (b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。
2.用于编码权利要求1所述甘露聚糖酶的基因。
3.权利要求2所述基因，其一种核苷酸序列为SEQID N0:2。
4.权利要求1所述甘露聚糖酶在饲料中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK103667216SQ201310606719
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】李佩佩, 程斯达, 王华明, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司