一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法。该分离方法包括：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。上述培养方法包括：对培养皿进行包被处理，弃去明胶，用PBS缓冲液进行洗涤；将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于培养皿中；待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。
【专利说明】—种胳带间充质干细胞的分罔方法和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是广泛存在于结缔组织和器官间质中的多能干细胞，具有良好增殖能力和多向分化潜能，在特定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞等功能性细胞分化。因为MSCs来源方便，易于分离、体外扩增和纯化，且在传代扩增后仍可保持干性，因此是组织工程、基因工程和细胞治疗的理想种子细胞来源。此外，MSCs具有强大的免疫调节功能，在移植中具有低免疫原性的特点，在终末期肝病等终末期疾病以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景。
[0003]目前已经进行的临床试验研究证实，在终末期肝病治疗中，MSCs移植能够明显改善患者的肝功能；而将皮肤角质细胞与MSCs混合后进行移植，可有效延长移植皮肤的存活时间并减少异体移植物抗免疫疾病(graft versus host disease, GVHD)。对于MSCs免疫调节机制的研究认为，MSCs主要通过旁分泌作用，产生多种免疫调节因子，作用于免疫细胞后，诱导免疫耐受，从而发挥调控机体的免疫的作用。
[0004]此外，通过将MSCs进行基因修饰，把IFN β、EPO等基因导入其基因组中，可获得能够在体内长时间稳定表达该蛋白或细胞因子的功能性细胞。吴祖泽等人把HGF的基因导入MSCs中，体内外实验证实HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持原有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，因此在组织器官移植中存在更大的潜在应用价值(边莉，郭子宽，艾辉胜，王 华，孟二红，吴祖泽，王立生；HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用；军事医学科学院院刊；2006，30(4):323-328)。正因如此，目前各国均投入大量人力物力经费进行广泛和深入的研究。但所有的研究或治疗方案都必须建立在足够量MSCs获取的基础上，因此建立稳定有效快速的MSCs分离、扩增、质量控制的技术体系具有重要的意义。
[0005]在人体组织中，骨髓中存在大量的MSCs，然而随着年龄老化，自体骨髓中的MSCs的数目会显著降低、且增殖能力也会大幅衰退。同时，为保证自体或供体安全，对骨髓MSCs的采集技术要求严格，配套仪器精密、成本高，不宜应用推广。因此，对于骨髓以外来源的研究越来越被重视。目前，不同的研究已经从围产期的胎盘、脐带、脐带血，抽脂术来源的脂肪以及流产胎儿中分离获得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而这些组织中，脐带属于医疗废弃物，具有易于获得、来源稳定可控、无伦理争议问题的特点，具有良好的研究价值和应用前景。
[0006]目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求最低，是最易于推广的方式。然而，获得原代细胞周期长、不可避免混杂部分内皮细胞，需后期通过酶消化法进一步进行筛选，因此仍有待于进一步改进。而酶消化法获得较高纯度的MSCs，但获取的效率较低、单细胞贴壁能力弱、生长速度较慢。
[0007]除了分离培养方法，MSCs培养基同样对细胞获得效率以及细胞质量至关重要。在目前已知来源中，MSCs含量极低，因此为获得足够数量的MSCs，不但需要对分离方法进行优化，增加细胞得率，同时需要对获得的MSCs进行体外培养和传代扩增。含血清培养基虽然可以在较短时间内大量扩增MSCs，但动物血清所带来的异源性污染可为临床MSCs的应用带来风险。因此，无血清培养基越来越受到关注。相比起来，无血清培养基成分确定，批次稳定，更容易实现细胞应用中的安全性和可控性。但目前无血清培养基存在的普遍问题在于对原代细胞的贴壁和生长支持能力不足。
【发明内容】
[0008]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞(Umbilicalcord mesenchymal stem cells,MSCs)的高效分离方法和培养方法,具有简单易行、易于推广实践等优点，可在最短的时间内获得足够基础和临床研究用的脐带间充质干细胞。
[0009]为达到上述目的，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离方法，其是在贴壁法的基础上结合MSCs培养基的培养，其包括以下步骤:
[0010]用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
[0011]将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，得到华通氏胶组织块；
[0012]用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶组织块，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
[0013]根据本发明的具体实施方案，优选地，上述脐带间充质干细胞的分离方法可以是在贴壁法的基础上结合酶消化法和MSCs培养基的培养，包括以下具体步骤:
[0014](1)用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
[0015](2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理；
[0016](3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
[0017](4)加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液；
[0018](5)用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
[0019]在上述分离方法中，优选地，在含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素和链霉素的总质量百分比浓度为2-5%。
[0020]在上述分离方法中，优选地，在含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.01g/100mL。
[0021]在上述分离方法中，优选地，在步骤(2)中，胶原酶A的浓度为lmg/mL-3mg/mL，胶原酶A的添加量为每根10-15cm脐带添加15mL，消化处理的时间为2_4小时。
[0022]在上述分离方法中，优选地，在步骤(2)中，胶原酶A与中性蛋白酶的混合液是由浓度为lmg/mL的胶原酶A和浓度为lmg/mL的中性蛋白酶混合得到的,胶原酶A与中性蛋白酶的体积比为1:2_1:4。
[0023]在上述分离方法中，优选地，在步骤(4)中，胰酶的浓度为0.05%-0.25%，添加量为每10-15cm脐带添加15mL，消化时间为10-15分钟。
[0024]在上述分离方法中，优选地，胰酶中添加有0.02wt%的EDTA，以胰酶的总量计。
[0025]在上述分离方法中，优选地，各个步骤中，离心分离的转速为1300rpm-2000rpm,时间为5-10分钟。
[0026]在上述分离方法中，优选地，各个步骤中，CO2培养箱的条件为37°C、5%C02。
[0027]在上述分离方法中，优选地，在步骤(5)中，MSCs培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基(BPS-SFM培养基)，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成:
[0028]α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氢钠 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、H印esl_5mM、β-巯基乙醇50ηΜ、脂质0.Ι-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松l-50ng/mL、维生素PP20_50mg/L、维生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黄体酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素1-lOIU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-lOng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
[0029]
【权利要求】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤: 用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污； 将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，将剥离的华通氏胶均匀剪碎，得到华通氏胶组织块； 用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶组织块，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其包括以下步骤: (1)用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污； (2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理； (3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液； (4)加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液； (5)用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其中，在所述含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，所述青霉素和链霉素的总质量百分比浓度为2-5%。
4.根据权利要求1-3任一项所述的分离方法，其中，在所述含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.01g/100mL。
5.根据权利要求2所述的分离方法，其中，在步骤(2)中，所述胶原酶A的浓度为Img/mL-3mg/mL，胶原酶A的添加量为每根10-15cm脐带添加15mL，消化处理的时间为2_4小时。
6.根据权利要求2所述的分离方法，其中，在步骤(2)中，胶原酶A与中性蛋白酶的混合液是由浓度为lmg/mL的胶原酶A和浓度为lmg/mL的中性蛋白酶混合得到的,所述胶原酶A与所述中性蛋白酶的体积比为1:2-1:4。
7.根据权利要求2所述的分离方法，其中，在步骤(4)中，所述胰酶的浓度为0.05%-0.25%，添加量为每10-15cm脐带添加15mL，消化时间为10-15分钟。
8.根据权利要求2或7所述的分离方法，其中，所述胰酶中添加有0.02wt%的EDTA，以所述胰酶的总量计。
9.根据权利要求1或2所述的分离方法，其中，所述MSCs培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以所述用于培养间充质干细胞的无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氢钠 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、H印esl_5mM、β -巯基乙醇50nM、脂质0.1-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松l-50ng/mL、维生素PP20_50mg/L、维生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黄体酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素l-10IU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-10ng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
10.根据权利要求9所述的分离方法，其中，所述脂质包括胆固醇、花生四烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或几种的组合； 所述微量元素包括 Cu、Zn、Se、Fe、Sn、N1、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn 和Ba中的一种或几种的组合。
11.根据权利要求9或10所述的分离方法，其中，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸 0.28mg/L、亚油酸 0.28mg/L、亚麻酸 0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、ZnlmM、Ga0.3mM、Cr5 μ M> Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽lmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C20mg/L、式I所示的化合物10 μ M、式II所示的化合物20 μ Μ、黄体酮15ng/mL、腐胺 10mg/L、肝素 10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGFIOng/mL0
12.根据权利要求9或11所述的分离方法，其中，以该无血清培养基的体积计，其还包括:原儿茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFl-lOng/mL、TGF-β l-10ng/mL ;优选地，以该无血清培养基的体积计，其还包括:原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-110ng/mL、GM-CSF10ng/mL、TGF-β 10ng/mL。
13.一种脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤: a、采用明胶对培养皿进行包被处理，接种细胞前弃去明胶，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗漆; b、将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于步骤a处理后的培养皿中； C、待细胞生长融合至80%_90%时进行消化传代； 优选地，在步骤a中，采用0.1%-0.2%的明胶对培养皿进行包被，然后在37°C、5%C02的培养箱中孵育I小时或4°C孵育8-12小时。
14.一种脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤:采用权利要求1-12任一项所述的脐带间充质干细胞的分离方法对健康的新生儿脐带组织进行分离获得组织块和细胞重悬液； 采用权利要求13所述的脐带间充质干细胞的培养方法对分离获得的组织块进行培养。
【文档编号】C12N5/0775GK103589683SQ201310585147
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】赵侃, 王春有, 赵宇, 刘湘连, 李莉莉 申请人:北京东方华辉生物医药科技有限公司