用于空肠弯曲菌pcr-elisa检测的引物组、探针和试剂盒及试剂盒的使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的引物组、探针和试剂盒及试剂盒的使用方法。本发明建立了空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒，本试剂盒根据空肠弯曲杆菌hipO基因保守区域设计了引物和探针。对比单纯的PCR检测，PCR-ELISA加入了杂交探针，使得此方法能够准确检测到样品中目的基因片段，而不是单纯检测扩增产物分子量的大小，从而增加了检测的特异性，使得此方法能够准确鉴定样品。本方法采用了链霉素-亲和素-地高辛-抗地高辛抗体系统，对比单纯的PCR和ELISA检测，由于双标记物的存在此检测法在敏感性上有了提高；在结果的判定上，此法采用ELISA的显色反应，使结果的判定更加直接。
【专利说明】用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的弓|物组、探针和试剂盒及试剂盒的使用方法
【技术领域】
[0001]空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)是近年来国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要引起人类发热、急性肠炎、急性感染性多发性神经病，即格林巴利综合征。该菌分布广泛，多种动物上都分离到该菌，尤其是广泛存在于家禽类动物的肠道中，鸡的带菌率占首位，次为猪。人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染的食品、饮用水以及环境引起，根据美国疾病预防控制中心公布的美国食源性病原微生物导致疾病人数统计数据，空肠弯曲菌所导致的发病人数居第2位。因此国内外对空肠弯曲杆菌的监测都非常重视。
[0002]由于空肠弯曲杆菌培养条件苛刻，在25°C不生长，42°C生长良好，但容易进入VBNC状态，使得常规的分离培养和生化鉴定耗时费力、灵敏度不高，所需时间长，而不利于爆发疫情时的快速诊断，也不符合临床病原菌检测所要求的快速、准确的原则。此外，在经典的空肠弯曲杆菌鉴定中，马尿酸盐水解实验是区分空肠弯曲菌与其它弯曲菌的重要指标，但是这种表型鉴定准确性并不稳定。此项区分菌株的生化鉴定的主要缺点在于有时结果的一致性不好或存在个别的非典型菌株，可能会造成分离菌株的假阴性。近年来随着分子生物学技术的发展，国内外已经先后开展了一些针对空肠弯曲菌的基因检测研究，针对的靶基因主要包括16SrDNA、23SrDNA、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等。马尿酸水解酶基因为空肠弯曲菌独有的基因，因此可用于空肠弯曲杆菌的定性检测。
[0003]目前，空肠弯曲杆菌的分子生物学方法以普通PCR和荧光定量PCR方法为主。普通PCR方法因其简便快速，被广泛应用于各病原体的检测。但该方法电泳上样个数受凝胶大小限制，不适于大量样品的诊断，结果以对条带的直观观察为准，影响敏感度。荧光定量PCR需要昂贵的仪器设备，而且检测样品费用能够高，不能满足大规模样品检测的要求。随着人们对食品安全的高度重视，建立一种快速、准确、特异、灵敏的空肠弯曲菌检测方法十分必要。
【发明内容】
[0004]本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种具有灵敏度、特异性强、方便快捷的用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的引物组、探针和试剂盒及试剂盒的使用方法。
[0005]为此本发明采用的技术方案是:所述上游引物和下游引物以及探针的核苷酸序列如下:
上游引物:hip0 F: 5’ -GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；
下游引物:hip0 R: 5’ -Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；
探针:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；
所述的下游引物5’端为生物素标记，探针的3’端为地高辛标记 。
[0006]本发明还包括有:PCR(DNA)模板、PCR反应液和ELISA反应液。
[0007]所述PCR (DNA)模板由增菌培养液培养而成。
[0008]所述PCR反应液包括PCR buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超纯水。[0009]一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，按照以下步骤进行:
1)以包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5)稀释链霉亲和素，包被酶标板，100 μ L/孔，终浓度为20 μ g/L, 37°C过夜，甩干后以含0.5mL/L吐温20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次静置5min,思干；
2)以含40mg/L脱脂乳的PBS稀释鱼精DNA，封闭酶标板，200μ L/孔，37°C lh,同上法洗板3次，
3)以PBS将PCR产物做1:50稀释，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；
4)以1/6体积SSC和0.1%浓度SDS溶液稀释探针(浓度为50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含杂交探针的杂交液，55-60°C反应lh，洗板5次；
5)加入100μ L以PBS稀释的ΑΚΡ标记的抗地高辛抗体，37°C lh,洗板5次；
6)加入100μ L临时配制的ρΝΡΡ显色液，置37°C避光显色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH终止液； 7)可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，hipO基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17为阳性，小于0.17为阴性；
生成PCR产物的反应步骤如下:
PCR 扩增反应体系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超纯水14.25 μ L，反应条件:95°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30个循环；72°C延伸5min。
[0010]所述模板的制备步骤如下:取0.5 mL增菌培养液于1.5mL EP管中，10000 r/min离心5min,弃上清，加入100 μ L超纯水，镟润混匀，100°C水浴20min,立即冰浴lOmin,12000r/min 离心 5min,取上清。
[0011]本发明的优点是:本发明建立了空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒，本试剂盒根据空肠弯曲杆菌hipO基因保守区域设计了引物和探针。对比单纯的PCR检测，PCR-ELISA加入了杂交探针，使得此方法能够准确检测到样品中目的基因片段，而不是单纯检测扩增产物分子量的大小，从而增加了检测的特异性，使得此方法能够准确鉴定样品。本方法采用了链霉素-亲和素-地高辛-抗地高辛抗体系统，对比单纯的PCR和ELISA检测，由于双标记物的存在此检测法在敏感性上有了提高；在结果的判定上，此法采用ELISA的显色反应，使结果的判定更加直接。
[0012]本发明所建立的检测方法具有灵敏度、特异性强、方便快捷、使用范围广的优点。所需要的仪器为PCR仪和酶标仪，普通实验室就有配置，试剂和耗材已有商品化的成品，容易购买，利于推广。本发明在96孔酶标板中进行，成本低廉，适用于对空肠弯曲菌进行大规模、高通量的检测。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实例进一步阐述本发明
如利用本发明空肠弯曲菌PCR-ELISA检测技术检测20份家禽泄殖腔棉拭子。
[0014][1] PCR模板的制备将棉拭子置于含500ul灭菌PBS中，充分浸透20min，将浸液加至含9.5ml布氏肉汤的试管中，在微需氧条件下120rpm 42°C培养24h。取0.5 mL增菌培养液于1.5mL EP管中，10000 r/min离心5min，弃上清，加入100 μ L超纯水，漩涡混匀，100°C水浴20min，立即冰浴 lOmin, 12000r/min 离心 5min,取上清。
[0015][2] PCR 反应
PCR 扩增反应体系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgC12 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、Taq酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超纯水14.25 μ L。反应条件:95°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30个循环；72°C延伸5min。
[0016] [3] ELISA 反应
a以包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5)稀释链霉亲和素，包被酶标板，100 μ L/孔，终浓度为20 μ g/L, 37°C过夜。甩干后以含0.5mL/L吐温20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次静置5min,思干。
[0017]b以含40mg/L脱脂乳的PBS稀释鱼精DNA，封闭酶标板，200yL/孔，37°C lh，同上法洗板3次。
[0018]c以PBS将PCR产物做1:50稀释，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次。
[0019]d以1/6体积SSC和0.1%浓度SDS溶液稀释探针(浓度为50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含杂交探针的杂交液，55-60°C反应lh，洗板5次。
[0020]e加入100 μ L以PBS稀释的ΑΚΡ标记的抗地高辛抗体，37°C lh,洗板5次。
[0021]f加入lOOyL临时配制的ρΝΡΡ显色液，置37°C避光显色，最后加入50yL 2mol/L NaOH终止液。
[0022][4]结果检测
可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，hipO基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，0D405nm大于0.17为阳性，小于0.17为阴性。
【权利要求】
1.用于空肠弯曲菌PCR-ELISA检测的引物组和探针，其特征在于，所述上游引物和下游引物以及探针的核苷酸序列如下:上游引物:hipOF: 5’-GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；下游引物:hipOR: 5’-Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；探针:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；所述的下游引物5’端为生物素标记，探针的3’端为地高辛标记 。
2.一种含有权利要求1引物组和探针的检测试剂盒，其特征在于，还包括有:PCR(DNA)模板、PCR反应液和ELISA反应液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR(DNA)模板由增菌培养液培养而成。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCRbuffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超纯水。
5.一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行:1)以包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5)稀释链霉亲和素，包被酶标板，100 μ L/孔，终浓度为20 μ g/L，37°C过夜，甩干后以含0.5mL/L吐温20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次静置5min,思干；2)以含40mg/L脱脂乳的PBS稀释鱼精DNA，封闭酶标板，200yL/孔，37°Clh，同上法洗板3次；3)以PBS将PCR产物做1:50稀释，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；4)以1/6体积SSC和0.1%浓度SDS溶液稀释探针(浓度为50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含杂交探针的杂交液，55-60°C反应lh，洗板5次；5)加入100μ L以PBS稀释的ΑΚΡ标记的抗地高辛抗体，37°C lh,洗板5次；6)加入100μ L临时配制的ρΝΡΡ显色液，置37°C避光显色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH终止液；7)可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，hipO基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17为阳性，小于0.17为阴性。
6.根据权利要求5所述的一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，生成PCR产物的反应步骤如下:PCR 扩增反应体系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超纯水14.25 μ L，反应条件:95°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30个循环；72°C延伸5min,各物料的用量可同比例放大或缩小。
7.根据权利要求6所述的一种空肠弯曲菌PCR-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述模板的制备步骤如下:取0.5 mL增菌培养液于1.5mL EP管中，10000 r/min离心5min，弃上清，加入100 μ L超纯水，漩涡混匀，100°C水浴20min，立即冰浴lOmin，12000r/min离心5min,取上清，各物料的用量可同比例放大或缩小。
【文档编号】C12N15/11GK103667454SQ201310585012
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】唐梦君, 高玉时, 陈大伟, 蒲俊华, 张小燕, 唐修君, 陆俊贤, 施祖灏, 葛庆联, 顾荣 申请人:江苏省家禽科学研究所, 唐梦君, 高玉时