一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。采用本发明提供的基因获得的重组酶具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性以及耐酸性环境等优点，对提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性具有明显效果，具有重大应用潜力。
【专利说明】一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，更尤其是来源于A.0ryZae和A.flavus的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其表达与应用，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大类酶。蛋白酶按作用方式可分为内外肽酶；按活性中心分为丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，金属蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶来源分为植物，动物，微生物蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。丝氨酸蛋白酶家族成员非常庞大，分为81类，如胰脏分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp,并具有相同的催化机制,但是他们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性，正由于这种结构上微小变化，从而引起其在功能上的差异。并且，由于丝氨酸蛋白酶在结构上全为P蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域(N结构域和C结构域)，这两个结构域在结构上的差异导致它们在功能和进化上的作用差异。脯氨酸特异性内切蛋白酶，也称脯氨酰内肽酶(proline specificendoprotease, prolyl endopeptidase,简称PEP) [EC.3.4.21.26]或脑氨酸寡妝酶，属于丝氨酸蛋白酶中一种新的家族，该家族能专一性地水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键，含有典型的丝氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位点Ser周围的氨基酸残基和其他典型的丝氨酸蛋白不同，而且与已知的丝氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一级结构上同源性很低。
[0003]脯氨酸(Pro)是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其它氨基酸形成肽键时的空间构象。脯氨酸特异性内切蛋白酶对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，且能够特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键。因此，可以应用于食品工业、医药、多肽工业等领域；同时可以作为一种分子生物学的工具酶，应用于蛋白质序列测定，肽谱分析、特异位点的酶切、肽链的修饰以及加工等。
[0004]特别地，在食品工业方面，由于蛋白质水解产物可以为特定人群提供营养补充，因此有广泛的市场效应。来自乳清产品特别受欢迎的原因在于其极好的口感及良好的可溶性。但是，目前这些酪蛋白水解产物还未获得广泛的流行，缺乏市场渗透力的主要原因在于酪蛋白水解过程中所产生的苦味，这种出现苦味的情况代表了一个技术问题，目前在食品工业上还没有解决。但是可以确定的是苦味通常是很多蛋白质的水解产物，研究表明，苦味和几个特别的苦味肽相关，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba发现水解氨基酸C末端或N末端位置的肽类可以出现较少的苦味，而水解氨基酸涉及肽键两端的肽类的苦味则更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla发现水解产物显著脱苦味伴随着疏水肽类出现的选择性降解。众所周知，包含脯氨酸残基的肽键很难被已知可购买的工业用酶切开。脯氨酸残基在肽的羧基末端的高发生率与低的苦味相关，并且证明了羧基末端脯氨酸残基预期的高发生率只能用高浓度的脯氨酸特异性内切蛋白酶来实现。
[0005]因此，在食品工业中，脯氨酸特异性内切蛋白酶不仅在解除直接与抑制苦味相关的苦味肽获得优质的蛋白质水解产物应用显示出了无以伦比的优越性，还在不直接与抑制苦味相关，比如将减少食物蛋白质的变应原性；减缓所得生面团制作面包的腐败；生成富含脯氨酸的肽作为各种食物或营养产品的理想添加剂，以增强蛋白质利用。尤其引人注目的是，该酶还可以用于啤酒酿造，解决啤酒实际生产过程中的冷混浊问题。主要是因为大麦蛋白质中富含脯氨酸序列很丰富，且在他们非发芽的形式时谷类蛋白质是极其难以降解成生产适当的可发酵的麦芽汁所必需的游离氨基酸。
[0006]目前已经发现的脯氨酸特异性内切蛋白酶主要有:一是来自于动物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。二是来自于植物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。它们主要存在于菠菜，蘑菇菌类等，主要是双孢子蘑菇。三是来自于微生物的脯氨酸特异性内切蛋白酶。目前已在细菌如脑膜败血性黄杆菌属，黄单胞菌属，嗜水气单胞菌，产气单胞菌属，假单胞菌属，假平胞菌荚膜，盐生盐杆菌和曲霉中发现该酶的存在，并且克隆得到编码脑膜败血性黄杆菌属(Genbank:M81461.1),嗜水气单胞菌(Genbank:D14005.1),产气单胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌荚膜(Genbank:ABO10298)，黄色粘球菌(Genbank: ABF89794)以及烟曲霉(Genbank: XM744168 )和黑曲霉(Genbank: AX458699 )的核苷酸序列，然而，除假平胞菌属，盐生盐杆菌和黑曲霉外，其他六种微生物都属于病原性微生物。
[0007]近年来，脯氨酸特异性内切蛋白酶的研究成为热点，因其在食品行业上具有诱人的应用前景毋庸置疑，已经引起了越来越多国内外食品研究工作者们的青睐。国外已有商业酶应用在啤酒行业中，以抑制瓶装啤酒中混浊的形成，虽然商品酶价格十分昂贵，但在国内仍旧处于垄断地位。究其原因在于食品安全级微生物产脯氨酸特异性内切蛋白酶自然酶活较低，分离纯化困难，基因工程菌研究很少，从而限制了对其生理功能和性质的研究，相应地，国内对该酶的研究也非常滞后，并未建立相关的研究体系。
[0008]米曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌，从米曲霉中提取脯氨酸特异性内切蛋白酶应用于药品食品行业安全可靠。然而，迄今为止，即使在95年有日本专利显示从产酱油米曲霉菌株中发现具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性，但是国内外有关米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶编码序列和制备方法的报道还未见。因此，研究新型米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。本研究根据黑曲霉(Genbank: AX458699)和烟曲霉(Genbank:EDP53789)来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白质序列设计引物，从筛选获得的米曲霉中成功调取获得米曲霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，发现其与黑曲霉(Genbank: AX458699 )和烟曲霉(Genbank:EDP53789)来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白序列的同源性分别仅为19.5%和21%，并验证了其脯氨酸特异性内切蛋白酶功能与应用价值。进一步通过在NCBI上进行BLASTp相似性检索,发现已报道全基因组测序的米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中的基因Genbank:XM_001825944.2与本研究调取基因序列一致，其被注释为丝氨酸蛋白酶。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是提供一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，其核苷酸序列如以下I)或2)所示:
[0010]I)其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0011]2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。
[0012]米曲霉来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因产量很低，为实现在毕赤酵母中表达及高效表达，对其原始序列做了部分改造，改造后序列如3)或4)所示；
[0013]3)其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
[0014]4)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。
[0015]所述脯氨酸特异性内切蛋白酶基因编码的蛋白质及含有所述脯氨酸特异性内切蛋白酶基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明保护的范围。
[0016]本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母基因工程菌及其构建、表达方法。毕赤酵母可选择GS115，KM71或SMD1168，更优选GSl 15。
[0017]重组毕赤酵母表达载体？？比9，？？比31(，？？1091(，？40815或？？102 0，更优选pPIC9构建重组表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主进行表达。
[0018]所述高产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母的构建方法为选取重组毕赤酵母表达载体PPIC9，构建重组表达载体pPIC9-S2，以毕赤酵母GSl 15为宿主进行表达，具体步骤如下:·[0019](I)提取米曲霉A.0ryzae (中国微生物菌种库保藏编号:CICC40214)的总RNA，进行反转录获取cDNA，以所获得cDNA为模板，利用简并引物gl和g2进行PCR扩增保守区，经过NCBI，EMBL数据库比对，找出同源性最高的序列；然后以所得序列为模板，利用引物g3和g4通过PCR扩增得到1743bp的米曲霉全长脯氨酸特异性内切蛋白酶；
[0020](2)设计引物g5和g6,利用PCR向A.0ryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入SnaBI和Not I限制性酶切位点(不带信号肽)；(下划线显示)；
[0021](3)选取毕赤酵母表达载体PPIC9，构建重组表达载体pPIC9-S2，将重组表达质粒PPIC9-S2转化毕赤酵母GSl 15，通过G418抗生素平板筛选阳性转化子并测序验证；
[0022]所述A.0ryzae为本实验室所保藏。
[0023]所述PCR引物
[0024]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3
[0025]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3
[0026]g3:5' -ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTG-3'，
[0027]g4:5' -TTACTGGATGATATCCATCGGCCGCATC-3,
[0028]g5:5' -CGGTACGTATTGGGGT TGTTTAGAGG-3'
[0029]g6:5，-CCGCGGCCGCCTACATCACCGCCCCCTTTG-3，
[0030]所述重组菌生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤为:将电转化线性化重组表达质粒pPIC9-S2的阳性重组毕赤酵母GS115/pPIC9-S2在20_30°C、100_250rpm条件下培养至0D600=2.0-6.0，随后转入10-28°C培养并加入终浓度为0.1-2.0%的甲醇，诱导表达30-120h，转速 100-250rpm。[0031]本发明首次从A.0ryzae中分离、鉴定了脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，由于A.0ryzae野生菌株的脯氨酸特异性内切蛋白酶表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用毕赤酵母重组表达系统生产脯氨酸特异性内切蛋白酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。本发明利用毕赤酵母GS115成功高可溶性表达获得了A.0ryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白，并对表达的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白进行了纯化。所得重组酶对酸性、高温和酶抑制剂均有很好的耐受性。
[0032]本发明对纯化获得的重组脯氨酸特异性内切蛋白酶进行了最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果表明该脯氨酸特异性内切蛋白酶以Z-Gly-Pro-pNA为底物时,最适作用pH为5.0,最适作用温度为40°C ;结果还显示该脯氨酸特异性内切蛋白酶PH稳定性及温度稳定性都非常好。
[0033]本发明要解决的另一个技术问题是提供上述重组脯氨酸特异性内切蛋白酶在提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性中的应用，尤其是对提高啤酒非生物稳定性的应用。
[0034]本发明提供了一种新型的重组脯氨酸特异性内切蛋白酶，数据表明试验样(添加脯氨酸特异性内切蛋白酶)的非生物稳定性指标(冷混浊)优于对照样，6+1冷热混浊实验结果能够达到相应的货架期要求，并且成品啤酒贮存期间(六周)对照组的起始浊度和贮存过程中的浊度增加明显高于试验组。以上数据表明该重组脯氨酸特异性内切蛋白酶具有很好提高啤酒非生物稳定性的效果，具有较大应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为PCR扩增的A.0ryzae脯氨酸特异性内`切蛋白酶基因S2、蛋白质序列的功能区预测及BLASTp相似性检索部分结果；(A) M:DL2000 Marker ；1:脯氨酸特异性内切蛋白酶基因S2 ;(B)A.0ryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白序列保守功能区预测。
[0036]图2是本发明实施例2的信号肽预测结果图；
[0037]图3是本发明实施例2的利用“同源建模”法预测及其软件分析的米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶功能结构图示；
[0038]图4是本发明实施例3的pPIC9-S2酶切鉴定图；
[0039]图5是本发明实施例3的pPIC9-S2SDS-PAGE及native-SDS-PAGE电泳结果图。\
[0040]图6为纯化的A.0ryzae RIB40重组脯氨酸特异性内切蛋白酶最适作用pH和pH稳定性分析
[0041]图7为纯化的A.0ryzae RIB40重组脯氨酸特异性内切蛋白酶最适作用温度和温度稳定性分析。
[0042]图8是脯氨酸特异性内切蛋白酶应用于提高啤酒非生物稳定性的结果图。
【具体实施方式】
[0043]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0044]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。[0045]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0046]实施例1 A.0ryzae脯氨酸特异性内切蛋白酶基因的获得
[0047]根据产气单胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌荚膜(Genbank: AB010298)，黄色粘球菌(Genbank:ABF89794)以及烟曲霉(Genbank:XM744168)和黑曲霉(Genbank:AX458699)来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白质序列设计简并引物如下:
[0048]gl:5-RASMTWSRYATYASGGRA-3
[0049]g2:5-SVBYCBCYMBRGRKMANRNTB-3
[0050]以米曲霉cDNA为模板，gl和g2为引物进行PCR后，得到1000bp的产物片段，将产物进行测序后，在NCBI比对后，发现其均与A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:XM_001825944.2)的保守序列同源性较高。
[0051]进而，我们根据GenBank数据库中已公开的A.0ryzae蛋白酶基因(Sequence ID:XM_001825944.2)序列，重新设计引物，进行PCR，其步骤如下:
[0052]根据NCBI公共数据库的序列信息设计5’ ‘端和3’端引物，以米曲霉I号菌株的cDNA为模板，采用RT-PCR的方法获得米曲霉脯氨酸内切蛋白的全长编码序列S2。
[0053]1.引物设计(下划线为酶切位点，酶切位点为保护碱基，有效序列为酶切位点后序列)
[0054]g3:5 ’ -CGGTACGTAATGCGTTTCGACCTCTTTCTAAT-3，(SEQ ID.3)
[0055]g4:5? -CCGCGGCCGC·CTACTACATCACCGCCCCCTTTGTTAT-3，(SEQ ID.4)
[0056]2.RT-PCR
[0057]
【权利要求】
1.一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列为SEQID N0.1所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。
2.一种改造的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列为SEQID N0.2所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。
3.权利要求1，2所述基因编码的蛋白质。
4.含有权利要求1，2所述基因的转基因细胞系。
5.含有权利要求1，2所述基因的基因工程菌。
6.含有权利要求1，2所述基因的表达载体或克隆载体。
7.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，优选重组毕赤酵母GS115，KM71和SMDl 168 等，更优选 GS11 5。
8.—种权利要求7所述生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母GS115的构建方法，其特征在于，选取重组毕赤酵母表达载体PPIC9，pPIC3K，pPIC9K，PA0815和pPICZ a等，更优选PPIC9构建重组表达载体，以毕赤酵母GSl 15为宿主进行表达。
9.一种权利要求7所述生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的重组毕赤酵母生产脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法，其特征在于，利用甲醇对重组菌产脯氨酸特异性内切蛋白酶进行诱导表达；所述诱导表达条件为甲醇诱导终浓度为0.1%-2.0%，诱导温度20°C -30°C，诱导时间 30h-120h。
10.权利要求1所述基因在提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性的应用。
【文档编号】C12N1/19GK103589741SQ201310567472
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】徐岩, 喻晓蔚, 康超 申请人:江南大学