一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法
【专利摘要】本发明是从绿藻miRNAs文库中筛选或针对影响光合效率的绿藻功能基因设计调控miRNAs，构建能够通过光强或温度等手段诱导表达调控miRNAs的转基因藻，以miRNAs对其靶基因的抑制作为手段，间断调控绿藻光合系统II的活性，控制藻细胞内的低氧环境，从而使绿藻细胞能够持续产氢；以上述方法构建的转调控miRNA基因藻在产氢过程中不需要交替更换培养基，从而克服了现有绿藻为了持续产氢需要交替更换培养基从而造成其生长和产氢能力大大下降的缺陷，具有产业化应用前景。
【专利说明】—种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法。
【背景技术】
[0002]在20世纪四十年代，Gafforn及其合作者首次发现栅藻利用其可逆氢酶，既能在厌氧条件下吸收氢气固定二氧化碳，又能在光照条件下放出氢气【Gaffron H, RubinJ.Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae.J.Gen.Physiol.，1942(26):219-240.】。随后在许多绿藻(如莱茵衣藻、小球藻等)均发现光合放氢现象。由于这些绿藻能从自然界最丰富的资源(光和水)中获得氢能，而且绿藻中氢酶的活性高达蓝藻和光合细菌氢酶活性的100倍以上，国际能源组织(IEA)在1998年的评估报告中，将绿藻光合制氢称为最有应用前景的生物制氢途径【Carolyn CE.Annual Report ofIEA, 1998:15-31.】。然而，由于绿藻氢酶活性受到光合放氧的抑制，使得其持续放氢时间只能维持几秒到几分钟，大大制约了绿藻光合制氢产业的发展前景。
[0003]“如何才能使绿藻细胞持续放氢”已经成为绿藻光合制氢产业的瓶颈问题。美国国家可再生能源实验室(NREL)和加州大学伯克利分校的Melis小组于2000年在缺硫条件下培养莱茵衣藻时，发现光合放氧速率发生可逆下降现象，但线粒体的呼吸耗氧却不受影响，使封闭的莱茵衣藻生物反应器中的藻细胞处于厌氧环境，解除了衣藻光合放氧对氢酶的抑制作用，从而使持续放氢时间达到70小时以上，莱茵衣藻的放氢效率大大提高【Melis A, Zhang L, Forestier M et al.Sustained photobiological hydrogen gasproduction upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algalChlamydomonas reinhardti1.Plant Physiol.2000 (22): 127-135.】。由此引起人们对绿藻缺硫放氢现象的极大关注。进一步研究表明:当莱茵衣藻在缺硫条件下培养时，其藻细胞光合系统IKPSII)的活性受到抑制，进一步诱导呼吸耗氧，从而解除氧对绿藻氢酶的抑制，实现绿藻持续放氢过程。基于绿藻能在缺硫环境下持续放氢的理论，目前国际上设计出的绿藻光合制氢生物反应器均是使用两步交替法制氢，即在有硫培养基中生长，在去硫培养基中放氢，这样交替更换培养基来达到持续产氢的目的。然而，由于绿藻与培养基分离困难，将藻固定化后其生长和放氢能力又会大大下降，所以这种制氢途径没有产业化应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的一个技术问题是提供一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻的构建方法；本发明要解决的另一技术问题是利用上述方法构建一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻。
[0005]本发明提供了一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，包括如下步骤:
[0006](I)转基因受体藻的筛选和培养；[0007](2)筛选或设计调控miRNAs:根据表达量发生变化的miRNAs建立小RNA库，并从中筛选出预测的靶基因是与光系统II相关的且表达量均显著上调的miRNAs，或根据影响光合效率的绿藻靶基因序列设计并合成调控该基因的人工miRNAs ；
[0008](3)分别构建含有步骤(2)的各调控miRNAs的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体；
[0009](4)步骤(3)中得到的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体的遗传转化；
[0010](5)转基因绿藻的筛选。
[0011]所述转基因受体藻为细胞壁缺陷型莱茵衣藻或细胞色素b缺陷型莱茵衣藻，其培养条件如下:采用TAP培养基，在温度为22-25°C、光照强度为90μ E/m2/S的条件下连续光照通气培养，藻细胞对数生长期浓度为1-2 X IO6细胞/mL时离心收集。
[0012]所述步骤(2)的调控miRNAs为预测的靶基因为细胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亚家族的miR1150.3，预测的靶基因为磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因为组成PSII复合体的0EE2蛋白的编码基因的人工调控miRNAs，靶基因为与叶绿体类囊体膜相关的VIPPl蛋白的编码基因VIPPl的人工调控miRNAs。
[0013]步骤(3)是先将各调控miRNAs的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，得到调控miRNAs表达骨架；再利用调控miRNAs表达骨架构建绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体。
[0014]步骤(3)中绿藻核表达载体的构建方法:使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化上述调控miRNAs表达骨架，得到相应的基因，将相应的基因插入经Pmac I和Nhe I消化的PH105载体并用EcoR I酶切，获得调控miRNA基因表达框架，将调控miRNA基因表达框架插入pSP124的EcoR I位点，即获得绿藻核表达载体。
[0015]步骤(3)中绿藻叶绿体表达载体的构建方法:通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架；通过Nco I和Pst I双酶切上述调控miRNAs表达骨架，获得相应的基因；将相应的基因与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接获得质粒，使用EcoR V和Sma I双酶切前述质粒，获得相应的基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，即获得绿藻叶绿体表达载体。
[0016]步骤(3)中含有调控miR1150.3的绿藻核表达载体的构建方法如下:
[0017]将miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表达骨架；
[0018]使用限制性内切酶Nhe I 和 Pmac I 消化 miRNA-cre-MIR1162_miR115(X 3 表达骨架，可获得miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的 PH105 载体，获得 pH105-miR1150.3，用 EcoR I 酶切 pH105_miR1150.3，获得调控miRNA 基因表达框架 HSP70A-RBCS2:: miR1150.3:: RBCS2,将其插入 pSP124 的 EcoR I位点，构建得到附图1所示的调控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因绿藻核表达载体pH105-miR1150.3-124 ；
[0019]步骤(3)中含有调 控miR1166.1的绿藻核表达载体的构建方法如下:[0020]将miRl 166.1的成熟序列代替cre_MIRl 162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表达骨架；
[0021]使用限制性内切酶Nhe I 和 Pmac I 消化 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 表达骨架，获得miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的 PH105 载体，获得 pH105-miR1166.1，用 EcoR I 酶切 pH105_miR1166.1，获得调控miRNA 基因表达框架 HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2,将其插入 pSP124 的 EcoR I位点，构建得到附图2所示的调控miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因绿藻核表达载体pH105-miR1166.1-124 ； [0022]步骤(3)中含有与靶向0EE2匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下:
[0023]将与0EE2相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIRl 162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表达骨架；
[0024]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre_MIRl 162 - 0EE2表达骨架，获得miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得PH105-0EE2，用EcoR I酶切pH105_0EE2，获得调控miRNA基因表达框架HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2，将其插入pSP124的EcoR I位点，构建得到附图3所示的调控 miRNA-cre-MIRl 162-0EE2 基因绿藻核表达载体 ρΗ105_0ΕΕ2_124 ；
[0025]步骤(3)中含有与靶向VIPPl匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下:
[0026]将与靶基因VIPPl相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl表达骨架；
[0027]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNAs-cre_MIR1162 - VIPPl表达骨架，可获得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得PH105-VIPP1，用EcoR I酶切pH105_VIPPl，获得调控miRNA基因表达框架HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2，将其插入pSP124的EcoR I位点，构建得到附图4所示的调控 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因绿藻核表达载体 pH105-VIPPl_124。
[0028]步骤(3)中含有调控miR1150.3的绿藻叶绿体表达载体的构建方法如下:
[0029]将miRl 150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3表达骨架；
[0030]通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表达骨架，获得完整调控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表达盒5’ atpA:: miRl 150.3:: 3’ rbcL 的 p423miR1150.3 质粒，使用 EcoR V 和 Sma I 双酶切p423miRl 150.3 质粒，获得 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因表达盒，将其与经 EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图5所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表达盒的绿藻叶绿体表达载体pmiR1150.3chl ；
[0031] 步骤(3)中含有调控miR1166.1的绿藻叶绿体表达载体的构建方法如下:
[0032]将miRl 166.1的成熟序列代替cre_MIRl 162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1表达骨架；
[0033]通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1表达骨架，获得完整调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表达盒5’ atpA:: miR1166.1:: 3’ rbcL 的 p423miR1166.1 质粒，使用 EcoR V和 Sma I 双酶切p423miR1166.1 质粒，获得 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1 基因表达盒，将其与经 EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图6所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表达盒的叶绿体表达载体pmiR1166.1chl ；
[0034]步骤(3)中含有与靶向0EE2匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下:
[0035]将与0EE2相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIRl 162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2表达骨架；
[0036]通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIRl 162-0EE2表达骨架，获得完整人工调控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表达盒 5’atpA:: miR0EE2:: 3’rbcL 的 p423miR0EE2 质粒，使用 EcoR V 和 Sma I 双酶切p423miR0EE2质粒，获得miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图7所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因表达盒的叶绿体表达载体pmiR0EE2chl ；
[0037]步骤(3)中含有与靶向VIPPl匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下:
[0038]将与靶基因VIPPl相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl表达骨架；
[0039]通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1表达骨架，获得完整人工调控miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表达盒5，atpA:: miRVIPPl:: 3’rbcL 的 p423miRVIPPl 质粒，使用 EcoR V 和 Sma I 双酶切p423miRVIPPl质粒，获得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图8所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表达盒的叶绿体表达载体pmiRVIPPlchlo
[0040]步骤(4)的遗传转化方法采用珠磨法或基因枪法；步骤(5)的筛选在含有10 μ g/ml的2601^(^11抗性平板或15(^8/1111的壮观霉素抗性平板上进行，筛选获得阳性藻落后进行分子检测鉴定。
[0041]本发明还提供了一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻，它由上述所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法制备而成。
[0042]本发明是从绿 藻miRNAs文库中筛选或针对影响光合效率的绿藻功能基因设计调控miRNAs，构建能够通过光强或温度等手段诱导表达调控miRNAs的转基因藻，以miRNAs对其靶基因的抑制作为手段，间断调控绿藻光合系统II的活性，控制藻细胞内的低氧环境，从而使绿藻细胞能够持续产氢；以上述方法构建的转调控miRNA基因藻在产氢过程中不需要交替更换培养基，从而克服了现有绿藻为了持续产氢需要交替更换培养基从而造成其生长和产氢能力大大下降的缺陷，具有产业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1为调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因衣藻核表达载体pH105-miR1150.3-124 构建示意图。
[0044]图2为调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因衣藻核表达载体pH105-miR1166.1-124 构建示意图。
[0045]图3为调控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因衣藻核表达载体ρΗ105_0ΕΕ2_124构建
示意图。
[0046]图4 为调控 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因衣藻核表达载体 pH105-VIPPl_124 构
建示意图。
[0047]图5为调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因衣藻叶绿体表达载体pmiR1150.3chl构建不意图。
[0048]图6为调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因衣藻叶绿体表达载体pmiR1166.1chl构建不意图。
[0049]图7为调控miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2基因衣藻叶绿体表达载体pmiR0EE2chl构
建示意图。
[0050]图8为调控miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl基因衣藻叶绿体表达载体pmiRVIPPlchl
构建示意图。
[0051 ] 图9为根据莱茵衣藻缺硫胁迫培养前后miRNAs的表达量的变化筛选的miRNAs序列及其预测的靶基因。
[0052]图10为WMD3平台设计的靶向0EE2的候选人工miRNAs。[0053]图11为WMD3平台设计的靶向VIPPl的候选人工miRNAs。
[0054]图12为转基因衣藻1166.1的DNA-PCR产物电泳图，共有两条泳道:其中M为marker DL2000 ；1 为转基因衣藻 1166.1 的 DNA-PCR 产物。
[0055]图13为转基因衣藻P的DNA-PCR产物电泳图，共有三条泳道:其中M为markerDL2000 ；1为阳性对照(质粒pH105-0EE2-124) ；2为转基因衣藻P的DNA-PCR产物。
[0056]图14莱茵衣藻cc-849和转基因衣藻1166.1在室温及热激处理后氢气产量检测示意图。
[0057]图15莱茵衣藻cc-849和转基因衣藻P气体检测组成成份图a:莱茵衣藻cc_849(对照组)气体检测组成成份；b:转基因衣藻P气体检测组成成份。
[0058]图16空气气体GC检测组成成份图。
[0059]图17莱茵衣藻cc-849和转基因衣藻P在室温及热激处理下的氢气产量检测示意图。
【具体实施方式】[0060]以下对绿藻的代表物种莱茵衣藻进行举例说明。
[0061]实施例1转基因受体藻株的选择与培养
[0062]本发明选择的转基因操作的受体为细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii, cc-849,购自美国Duck大学衣藻遗传中心)和细胞色素b缺陷型莱茵衣藻(cc-2654,购自美国Duck大学衣藻遗传中心)。
[0063]上述莱茵衣藻培养时使用的培养基为TAP培养基，所述TAP培养基的组分如下:Tris2.42g, 4XBei jerinck salts (每升含 16g NH4Cl, 2g CaCl2.2H20, 4gMgSO4.7H20) 25mL, IM磷酸钾缓冲液lmL，Trace微量元素混合液(每升含11.4g H3BO3, 5.6gMnCl2.4H20, 22g ZnSO4.7H20, 4.99g FeSO4.7H20, 1.61g CoCl2.6H20, 1.57g CuSO4.5H20, 1.1g (NH4) 6Mo7024.4H20, 50g Na2EDTA, 20%(m/v) KOH 调 ρΗ6.5-6.8)lmL,溶解到 975mL 水中，使用冰醋酸调pH至6.95-7.05，用水定容至IL (下同)。
[0064]莱茵衣藻的培养条件如下:温度为22_25°C，在光照强度为90 μ E/m2/s的条件下连续光照培养，通气量可调整(0.5L/min)，藻细胞对数生长期浓度为1_2X 106cells/mL时离心收集。
[0065]实施例2筛选或设计调控miRNAs
[0066](I)胞内miRNAs的筛选
[0067]莱茵衣藻通过缺硫胁迫培养后，其产氢量提高，检测其miRNAs的表达量，将表达量发生变化的miRNAs进行统计，建立了小RNA库(BMC Genomics, 2012，13:108),并且发现建立的小RNA库中的衣藻miRNAs表达量发生了明显的变化(2倍以上)，其中绝大多数miRNAs表达量发生了上调，从建立的小RNA库中筛选了一些预测的靶基因主要是与光系统 II 相关且表达量均显著上调的 miRNAs，如 miRNA909.l，miR1150.3，miR1166.l，miR1158。图9为挑选的miRNAs及其预测的靶基因。这里优选选择miRl 150.3和miRl 166.1进行下一步构建骨架，miR1150.3 的序列为:UGCAGCGGCGACUGGGGCCGA，miR1166.1 的序列为:UGGACCUCGCGGCCCUGGAGG。
[0068](2 )人工mi croRNA序列的设计[0069]采用在线的人工调控miRNAs设计网站(网址http: //wmd3.weigelworld.0rg/CR1-bin/webapp.cgi),将影响光合效率的绿藻$巴基因序列作为$巴基因提交(影响绿藻光合效率的靶基因蛋白包括PSII复合体的组成蛋白(如Dl蛋白、0EE2蛋白等)、天线色素复合体蛋白、碳固定相关蛋白、叶绿体类囊体膜相关蛋白(如VIPPl蛋白)等光合放氢相关的功能蛋白)，并从网站回馈的候选人工调控miRNAs邮件包中挑选与靶基因相匹配的最优化的人工调控miRNAs进行研究。
[0070]本实施例选择的是光系统II组成蛋白的编码基因0EE2序列(GenBank基因登录号:5716532)和叶绿体类囊体膜相关蛋白的编码基因VIPPl序列(GenBank基因登录号:5719360)作为靶基因提交，然后，从邮件包中选择与靶基因0EE2相匹配的最优化的人工调控miRNA对应的DNA序列(图10，第二行)，并将邮件包中DNA序列的胸腺嘧啶(T)转换为RNA专用的尿嘧啶(U )，更换后的序列为:UCUAACGUGAAUAGGUGGCAA。从邮件包选择与靶基因VIPPl相匹配的最优化的人工调控miRNA对应的DNA序列(图11，最后一行)，并将邮件包中DNA序列的胸腺嘧啶(T)转换为RNA专用的尿嘧啶(U)，更换后的序列为:UUGACCAUCUUAGACUUGCUC。其余影响光合效率的绿藻靶基因均可按此方法设计人工mi RNAs。
[0071]实施例3调控miRNAs表达骨架的构建及合成
[0072]绿藻miRNAs在细胞内表达时，是先转录出包含骨架结构的前体，因此要过表达胞内miRNAs时，也需要为设计的“调控miRNA”选择一个表达骨架。在本实施例中，选择在莱茵衣藻中表达丰度高的天然cre-MIR1162M10006223作为筛选的miRNAs的骨架前体。将从小RNA库中筛选的胞内调控miRNAs成熟序列分别代替cre_MIR1162M10006223中成熟的miRNAs序列，可获得完整调控miRNAs表达骨架。
[0073]在本实施例中，从库中筛选了 miR1150.3及miR1166.1进行研究，其余库中的miRNAs均可按此方法进行构建与合成。分别将miR1150.3和miR1166.1的成熟序列代替cre-MIR1162M10006223的 成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，分别获得靶向目的基因的完整调控miRNAs的新序列，SP含有miR1150.3的完整调控miRNA表达骨架命名为miRNA-cre-MIR1162_miR1150.3，基因序列如SEQ ID N0.1所示，以及含有miR1166.1的完整调控miRNA表达骨架命名为miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1，基因序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0074]SEQ ID N0.1
[0075]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCGGG
[0076]Nco I Nhe I
[0077]ACCCAGUCGCCGCUGCACGCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGG
[0078]ACCCCUCGGGACCCGGUACGUCGUGCAGCGGCGACUGGGGC
[0079]CGAGGUCGCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0080]Pmac I Pst I
[0081]SEQ ID N0.2
[0082]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCgucaa
[0083]Nco I Nhe I
[0084]gggccgcgagguccacgCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGGACCCCUCG
[0085]GGACCCGGUACGUCGUGGACCUCGCGGCCCUGGAGGGGUC[0086]GCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0087]Pmac I Pst I
[0088]在本实施例中，分别将实施例2设计的与靶基因0EE2和VIPPl相匹配的最优化的人工调控miRNA代替cre-MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上NcoI和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，分别获得靶定0EE2基因的完整人工调控miRNA表达骨架命名为miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2，基因序列如SEQ ID N0.3所示；以及靶定VIPPl基因的完整人工调控miRNA表达骨架命名为miRNA-cre-MIRl 162 -VIPPl，基因序列如SEQ ID N0.4所不。
[0089]SEQ ID N0.3
[0090]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCggcaa
[0091]Nco I Nhe I
[0092]ccuauucacguuagacgCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGGACCCCUCG
[0093]GGACCCG⑶ AC⑶ C⑶ CUAAC⑶GAAUAG⑶GGCAAG⑶ CG
[0094]CGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCAG
[0095]Pmac I Pst I
[0096]SEQ ID N0.4
[0097]CCATGGGCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCCGC
[0098]Nco I Nhe I
[0099]CAGUCUAAGAUGGUCAACGCCGCGCCUGGACCCGAGGGAGG
[0100]ACCCCUCGGGACCCGGUACGUCGUUGACCAUCUUAGACUUG
[0101]CUCCGGUCGCGGUGGGGUCAGGUCCUUCCGCCACGTGCTGCA
[0102]Pmac I Pst I
[0103]G
[0104]然后分别将上述设计好的miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3、miRNA-cre-MIRl162-miRl166.1、miRNA-cre-MIRl162 - OEE2 和 miRNA-cre-MIRl162 -VIPPl送上海生物工程有限公司进行人工合成，并通过测序进行验证。
[0105]实施例4调控miRNAs绿藻表达载体的构建
[0106](I)调控miRNAs衣藻核表达载体的构建
[0107]可通过Nhe I和Pmac I双酶切实施例3中设计并合成的完整miRNAs表达骨架，如 miRNA-cre-MIRl162-miRl150.3,miRNA-cre-MIRl162-miRl166.l、miRNA-cre_MIR1162 -0EE2 或 miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl。载体 pH105【Wu JX et al.Efficient expressionof green fluorescent protein (GFP) mediated by a chimeric promoter inChlamydomonas reinhardti1.Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2008(26): 242-247】克隆有HSP70A-RBCS2启动子序列和RBCS2终止子序列，中间携带有Pmac 1、Nhe 1、Xba I和Sal I等多克隆酶切位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达° 载体 pSP124 [Lambreras v, Stevens DR, Purton S.Efficient foreign geneexpression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron.PlantJ.1998; 14(4): 441-447】含有表达盒RBCS2:: ble:: RBCS2，可使转化的宿主细胞获得腐草霉素和Zeomycin抗性，在本发明中作为衣藻转化的筛选标记。[0108]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化实施例3中设计并人工合成的完整miRNA 表达骨架 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3，可获得 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因(166bp)，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105-miR1150.3，通过EcoR I酶切pH105_miR1150.3，获得调控miRNA基因表达框架(HSP70A-RBCS2:: miRl150.3:: RBCS2),将其插入 pSP124 的 EcoR I 位点，获得调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因衣藻细胞核表达载体 pH105-miRl 150.3-124 (图1)。
[0109]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化实施例3中设计并人工合成的完整miRNA 表达骨架 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1，可获得 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因(166bp)，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105-miR1166.1，通过EcoR I酶切pH105_miR1166.1，获得调控miRNA基因表达框架(HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2),将其插入 pSP124 的 EcoR I 位点，获得调控miRNA-cre-MIRl 162-miRl 166.1 基因衣藻细胞核表达载体 pH105_miR1166.1-124 (图 2)。
[0110]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化实施例3中设计并人工合成的完整人工 miRNA 表达骨架 miRNA-cre-MIRl 162 - 0EE2,可获得 miRNA-cre-MIR1162_0EE2 基因(166bp)，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105_0EE2。通过EcoR I酶切PH105-0EE2，获得调控miRNA基因表达框架(HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2)，将其插入pSP124的EcoR I位点，获得调控miRNA-cre-MIRl 162-0EE2基因衣藻细胞核表达载体PH105-0EE2-124 (图 3)。
[0111]使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化实施例3中设计并人工合成的完整人工 miRNA 表达骨架 miRNA-cre-MIRl 162 -VIPPl，可获得 miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1 基因(167bp)，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105_VIPPl。通过EcoRI 酶切 pH105-VIPPl，获得调控 miRNA 基因表达框架(HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2)，将其插入pSP124的EcoR I位 点，获得调控miRNA-cre-MIR1162_VIPPl基因细胞核衣藻表达载体 PH105-VIPP1-124 (图 4)。
[0112](2)调控miRNAs基因衣藻叶绿体表达载体的构建
[0113]质粒p423 (购自美国Duck大学衣藻中心)上携带有aadA基因表达盒(5’ atpA:: aadA:: 3’ rbcL)，aadA基因作为衣藻遗传转化的筛选标记，赋予宿主细胞壮观霉素抗性。莱茵衣藻叶绿体表达载体p423chl由深圳大学生命科学学院构建(构建方法见专利ZL200810066705.8)，携带有chlB基因外显子5’和3’端序列，在衣藻遗传转化过程中，作为同源转化片段，可使外源目的基因定点整合入叶绿体DNA的chlB基因的5’和3’端序列之间的位置。
[0114]通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切实施例3中设计并人工合成的完整miRNA表达骨架miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3，可获得完整调控 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3 基因(166bp)，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接，构建得到含 miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3 基因表达盒(5，atpA:: miR1150.3:: 3，rbcL)的p423miR1150.3质粒。使用EcoR V和Sma I双酶切上述构建的p423miR1150.3质粒，获得miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3基因表达盒的莱茵衣藻叶绿体表达载体pmiR1150.3chl(见图5)。
[0115]含有aadA基因表达盒和miRNAs-cre-MIRl 162-miRl 166.1基因表达盒的莱茵衣藻叶绿体表达载体pmiR1166.1chl (见图6)、含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162 -0EE2基因表达盒的莱茵衣藻叶绿体表达载体pmiR0EE2chl (见图7)及含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIRl 162 - VIPPl基因的表达盒莱茵衣藻叶绿体表达载体pmiRVIPPlchl(见图8)构建过程同上。
[0116]实施例5调控miRNAs在莱茵衣藻细胞的遗传转化
[0117]1.“珠磨法”遗传转化
[0118]米用QIAGEN⑧Plasmid Purification Kit 提取调控 miRNA 核表达质粒。“珠磨法”具体步骤如下:
[0119](I)将细胞壁缺陷型莱茵衣藻cc-849在连续光照和TAP培养基中培养至对数期，细胞数约为l-2X106cells/ml(TAP培养基配方及培养条件见实施例1)，室温(20_25°C )下5000rmp离心5min,弃上清,得到藻细胞沉淀；
[0120](2)用灭过菌的新鲜TAP培养基重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2X IO8细胞/ml，得到藻细胞悬浮液；
[0121](3)吸取270μ I藻细胞悬浮液至1.5ml EP管中(内含已灭菌的合金锡珠)，加入I μ g酶切成线状的含调控miRNA的衣藻细胞核表达载体(pH105-miR1150.3-124，pH105-miR1166.1-124，ρΗ105_0ΕΕ2_124 或 pH105-VIPPl_124)(均为 200 μ g/μ I)以及30 μ 150% (m/v)聚乙二醇(PEG6000)到EP管中，得到衣藻细胞/合金锡珠/外源DNA混合物；同时建立一个不添加PEG6000的样品组；此外，还建立一个不添加DNA的对照组；
`[0122](4)将上述衣藻细胞/合金锡珠/外源DNA混合物置于振荡器上以最高速振荡25s ；
[0123](5)将振荡后的衣藻细胞/合金锡珠/外源DNA混合物转移到含有IOml新鲜TAP培养基的离心管中，在IOOrpm摇床弱光下过夜培养(22-25°C)，使细胞恢复；
[0124](6) 3000rmp室温(20-25°C )离心5min，收集细胞，弃上清；用500μ I新鲜TAP培养基小心重悬细胞，加入3.5ml0.5% TAP培养基，混匀后倒在含有10 μ g/ml的Zeomycin的TAP固体平板上，置于光照培养箱(22-25°C，90y E/m2/s)里倒置培养约3周，待平板上长出绿色的单克隆。
[0125]2.“基因枪法”遗传转化
[0126]“基因枪”遗传转化在无菌超净工作台中使用基因枪(Bio-Rad)进行。具体步骤如下:
[0127](I)莱茵衣藻cc-2654在TAP培养基中培养至对数生长期(1_2X 106cells/ml)，5000rmp室温(20_25°C )离心5min，收集藻细胞；弃上清；用灭过菌的新鲜TAP培养基重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2X108cells/ml，得到藻细胞悬浮液；吸取300 μ I藻细胞悬浮液涂布于TAP固体平板中央(直径为35mm) ;22_25°C光照(90 μ E/m2/s)培养24小时，待平板表面形成一层细胞层。
[0128](2)取100 μ I金粉悬浮液(60mg/mL)，依次加入5μ g含调控miRNA的衣藻细胞叶绿体表达载体(pmiR1150.3chl, pmiR1166.1chl, pmiR0EE2chl 或 pmiRVIPPlchl)(均为100 μ g/μ 1),100μ 12.5Μ CaCljP 40 μ 10.1M亚精胺，通过漩涡振荡器振荡2-3分钟，静置1分钟，8，OOOrpm室温(20-25°C )离心2秒，弃上清；加入280 μ 170%乙醇清洗，弃上清；加入280ul无水乙醇清洗，弃上清；加入100 μ I无水乙醇，轻轻重悬。
[0129](3)取10μ1 DNA金粉包被液用于轰击；轰击参数如下所示:可裂膜氦气压力IlOOpsi,真空度25inches.Hg,轰击距离9cm,金粉颗粒直径IOOnm ；
[0130](4)把轰击后的平板放置于22_25°C光照培养箱中，光照(90 μ E/m2/s)培养8h。用ImL新鲜TAP培养基将衣藻细胞洗下，涂布于含壮观霉素抗生素筛选平板培养约3周(22-25°C，90 μ E/m2/s)，待平板上长出绿色单克隆。
[0131]实施例6转调控miRNAs基因藻的筛选与鉴定
[0132]转基因绿操由于导入ble基因而具有Zeomycin抗性或是导入aadA基因而具有壮观霉素抗性，因此可在含有10 μ g/ml的Zeomycin抗性平板或150 μ g/ml的壮观霉素抗性平板上对实施例5的遗传转化方法得到的绿藻进行初步筛选，以获得转调控miRNA基因藻。
[0133]初步筛选获得的转基因藻进行如下的分子检测:基因组DNA-PCR检测、RT-PCR检测和Western blot检测。本实施例以实施例5中通过“珠磨法”遗传转化获得的含有miRNA-cre-MIRl 162 - miRl 166.1 基因的转基因藻 1166.1 和含有 miRNA-cre-MIRl 162 -0EE2基因的转基因衣藻P为例，转基因藻采取基因组DNA-PCR检测，具体步骤如下:
[0134](I)转基因衣藻总DNA的提取
[0135]分别挑选转基因衣藻1166.1和转基因衣藻P分别接种到空白平板TAP培养基上，待单克隆子长出来之后，再接种到液体培养基，待生长到对数期之后，分别提取基因组DNA，基因组 DNA 的提取方法参照 TAKARA Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 说明书。
[0136](2 )基因组 DNA-PCR 检测
[0137]使用根据莱茵衣藻细胞核表达载体pH105_miR1166.1_124载体序列设计的引物对转基因衣藻1166.1进行基因组PCR检测，结果显示转基因衣藻1166.1的基因组通过PCR扩增得到约593bp的目的条带(见图12)。使用根据莱茵衣藻细胞核表达载体PH105-0EE2-124载体序列设计的引物对转基因衣藻P进行基因组PCR检测，结果显示转基因衣藻P的基因组通过PCR扩增得到与阳性对照一致的目的条带(见图13)。以上实验结果表明，miRNAs-cre-MIRl 162-miRl 166.1 和 miRNA-cre_MIR1162 - 0EE2 已整合到莱茵衣藻基因组中。
[0138]同样，也可用同样的方法鉴定miRNA-cre-MIRl 162-miRl 150.3和miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1是否已整合到莱茵衣藻核基因组或叶绿体基因组中。
[0139]实施例7转基因藻持续产氢调控分析
[0140]将转基因藻接种到绿藻光合制氢反应器(顶空瓶)内，先检测顶空瓶的气密性，接种后光照培养(温度为22-25°C，光照强度为90 μ E/m2/s)到对数生长期，将培养至对数生长期(浓度为l-2X106cells/mL)的藻液，采用连续热激(Heat Shock,简称HS) (40°C，60min)的方法，采用热激培养I小时再光照恢复培养(温度为20-25°C，光照强度为90μ E/m2/s)24小时，重复此操作，共进行三次热激培养和恢复培养。每次热激前先测量藻液OD值，从生长曲线对照表确认藻液的生长浓度，每次热激后再取气体进行GC检测。
[0141]本研究利用GC色谱仪对密闭培养的藻液进行气体分析，当气体通过TCD检测器时，将不同气体进行分离，即设定程序将CO2先放出，再使后续h2、o2、n2的气体依次过柱，以保证检测器有单峰依照时间分开出现。
[0142]本实施例以实施例5和实施例6获得的转基因衣藻1166.1和转基因衣藻P为例进行氢气含量检测。将培养至对数期(浓度为1-2XlO6ceIlsAiL)的莱茵衣藻cc-849(对照组)、转基因衣藻1166.1和转基因衣藻P分别进行热激处理，同时，还以室温(RoomTemperature，简称RT) (22_25°C )培养的衣藻作为对照组，分别进行气体检测。从图14可以看到转基因衣藻1166.1的产氢量在经过三次热激诱导后其产氢量有一个很大的提高，氢含量达到了气体总体积的11.958%。将峰面积与对照组(cc-849-RT)相对比，转基因藻1166.1热激三次之后产氢量增长近I倍。从图15可以看到莱茵衣藻cc-849和转基因衣藻P气体组成部分都包含四个组份:C02、H2、02、N2，且各组分出峰时间基本一致，表明其组份成分一致。从图15和16可以看出，以空气作为对照组进行比对，藻液气体检测中出峰时间
2.8s左右的单峰为H2。从图17可以看出，通过热激培养的转基因衣藻P氢气含量比对照组cc-849氢含量高了 1.5倍。以上实验结果表明，利用热激和强光恢复处理手段，经过转调控miRNAs的转基因藻氢气·含量得到明显的提高。
【权利要求】
1. 一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，包括如下步骤: (O转基因受体藻的筛选和培养； (2)筛选或设计调控miRNAs:根据表达量发生变化的miRNAs建立小RNA库，并从中筛选出预测的靶基因是与光系统II相关的且表达量均显著上调的miRNAs，或根据影响光合效率的绿藻靶基因序列设计并合成调控该基因的人工miRNAs ； (3)分别构建含有步骤(2)的各调控miRNAs的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体； (4)步骤(3)中得到的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体的遗传转化； (5)转基因绿藻的筛选。
2.根据权利要求1所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，所述转基因受体藻为细胞壁缺陷型莱茵衣藻或细胞色素b缺陷型莱茵衣藻，其培养条件如下:采用TAP培养基，在温度为22-25°C、光照强度为90μ E/m2/S的条件下连续光照通气培养，藻细胞对数生长期浓度为1-2 X IO6细胞/mL时离心收集。
3.根据权利要求2中所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)的调控miRNAs为预测的靶基因为细胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亚家族的miR1150.3，预测的靶基因为磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因为组成PSII复合体的OEE2蛋白的编码基因的人工调控miRNAs，靶基因为与叶绿体类囊体膜相关的VIPPl蛋白的编码基因VIPPl的人工调控miRNAs。
4.根据权利要求3所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤(3)是先将各调控miRNAs的成熟序列代替cre-MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，得到调控miRNAs表达骨架；再利用调控miRNAs表达骨架构建绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体。
5.根据权利要求4所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤(3)中绿藻核表达载体的构建方法:使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化上述调控miRNAs表达骨架，得到相应的基因，将相应的基因插入经Pmac I和Nhe I消化的PH105载体并用EcoR I酶切，获得调控miRNA基因表达框架，将调控miRNA基因表达框架插入pSP124的EcoR I位点，即获得绿藻核表达载体。
6.根据权利要求4所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤(3)中绿藻叶绿体表达载体的构建方法:通过Nco I和Pst I双酶切质粒P423切除aadA基因，获得质粒p423框架；通过Nco I和Pst I双酶切上述调控miRNAs表达骨架，获得相应的基因；将相应的基因与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接获得质粒，使用EcoR V和Sma I双酶切前述质粒，获得相应的基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，即获得绿藻叶绿体表达载体。
7.根据权利要求5所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于， 步骤(3)中含有调控miRl 150.3的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表达骨架； 使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre-MIR1162_miR1150.3表达骨架，可获得miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105-miR1150.3，用EcoR I酶切pH105-miR1150.3，获得调控miRNA基因表达框架 HSP70A-RBCS2:: miR1150.3:: RBCS2，将其插入 pSP124 的 EcoR I 位点，构建得到附图1所示的调控 miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3 基因绿藻核表达载体 pH105_miR1150.3-124 ；步骤(3)中含有调控miR1166.1的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将miR1166.1的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表达骨架； 使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1表达骨架，获得 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 基因，将其插入经 Pmac I 和 Nhe I 消化的 pH105 载体，获得pH105-miR1166.1，用EcoR I酶切pH105_miR1166.1，获得调控miRNA基因表达框架HSP70A-RBCS2:: miR1166.1:: RBCS2，将其插入 pSP124 的 EcoR I 位点，构建得到附图 2 所示的调控 miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1 基因绿藻核表达载体 pH105_miR1166.1-124 ；步骤(3)中含有与靶向0EE2匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将与0EE2相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表达骨架； 使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNA-cre_MIRl 162 - 0EE2表达骨架，获得miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得PH105-0EE2，用EcoR I酶切pH105_0EE2，获得调控miRNA基因表达框架HSP70A-RBCS2:: 0EE2:: RBCS2，将其插入pSP124的EcoR I位点，构建得到附图3所示的调控 miRNA-cre-MIR1162-0EE2 基因绿藻核表达载体 ρΗ105_0ΕΕ2_124 ；步骤(3)中含有与靶向VIPPl匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将与靶基因VIPPl相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - VIPPl表达骨架；使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化miRNAs-cre_MIR1162 - VIPPl表达骨架，可获得miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，将其插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得PH105-VIPP1，用EcoR I酶切pH105_VIPPl，获得调控miRNA基因表达框架HSP70A-RBCS2:: VIPPl:: RBCS2，将其插入pSP124的EcoR I位点，构建得到附图4所示的调控 miRNA-cre-MIR1162-VIPPl 基因绿藻核表达载体 pH105-VIPPl_124。
8.根据权利要求6所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于， 步骤(3)中含有调控miR1150.3的绿藻叶绿体表达载体的构建方法如下:将miR1150.3的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.1所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表达骨架； 通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3表达骨架，获得完整调控miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因表达盒5’ atpA:: miR1150.3:: 3’ rbcL 的 p423miR1150.3 质粒，使用 EcoR V和 Sma I 双酶切p423miRl 150.3 质粒，获得 miRNA-cre_MIRl 162_miRl 150.3 基因表达盒，将其与经 EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图5所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIR1162-miR1150.3基因表达盒的绿藻叶绿体表达载体pmiR1150.3chl ； 步骤(3)中含有调控miR1166.1的绿藻叶绿体表达载体的构建方法如下: 将miR1166.1的成熟序列代替cre_MIR1162M10006223的成熟序列，并在上游加上NcoI和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表达骨架； 通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1表达骨架，获得完整调控miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIR1162-miR1166.1基因表达盒5’ atpA:: miR1166.1:: 3’ rbcL 的 p423miR1166.1 质粒，使用 EcoR V和 Sma I 双酶切p423miR1166.1 质粒，获得 miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1 基因表达盒，将其与经 EcoR V双酶切的p423chl质粒用连·接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图6所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIR1162_miR1166.1基因表达盒的叶绿体表达载体pmiR1166.1chl ； 步骤(3)中含有与靶向0EE2匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将与0EE2相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.3所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - 0EE2表达骨架； 通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIR1162-0EE2表达骨架，获得完整人工调控miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIR1162-0EE2基因表达盒5’ atpA:: miR0EE2:: 3’ rbcL 的 p423miR0EE2 质粒，使用 EcoR V 和 Sma I 双酶切p423miR0EE2质粒，获得miRNA-cre-MIR1162_0EE2基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图7所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIR1162_0EE2基因表达盒的叶绿体表达载体pmiR0EE2chl ；步骤(3)中含有与靶向VIPPl匹配的人工调控miRNA的绿藻核表达载体的构建方法如下: 将与靶基因VIPPl相匹配的人工调控miRNA代替cre_MIR1162M10006223中的成熟的miRNA序列，同时在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，构建得到具有SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的miRNA-cre-MIR1162 - VIPPl表达骨架； 通过Nco I和Pst I双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架，通过Nco I和Pst I双酶切miRNA-cre-MIR1162-VIPPl表达骨架，获得完整人工调控miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因，将其与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒P423框架通过连接酶进行连接，构建得到含miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表达盒·5，atpA:: miRVIPPl:: 3’rbcL 的 p423miRVIPPl 质粒，使用 EcoR V 和 Sma I 双酶切p423miRVIPPl质粒，获得miRNA-cre-MIRl 162-VIPP1基因表达盒，将其与经EcoR V双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到附图8所示的含有aadA基因表达盒和miRNA-cre-MIR1162-VIPPl基因表达盒的叶绿体表达载体pmiRVIPPlchlo
9.根据权利要求1所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤(4)的遗传转化方法采用珠磨法或基因枪法；步骤(5)的筛选在含有10μ g/ml的Zeomycin抗性平板或150 μ g/ml的壮观霉素抗性平板上进行，筛选获得阳性藻落后进行分子检测鉴定。
10.一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻，其特征在于，它由权利要求1-9任一项所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法制备而成。
【文档编号】C12N1/13GK103571868SQ201310541659
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】胡章立, 李辉, 庄晓珊, 张立, 舒龙飞 申请人:深圳大学