松褐天牛球孢白僵菌航天突变株b252及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252及其应用。本发明将球孢白僵菌菌株通过航天诱变筛选获得一株在生长特性以及对天牛致病力等方面发生了较大幅度正向变异的航天突变株B252，其微生物保藏号是CGMCC?No.8048。致病力测定和室内防治实验表明，松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252对天牛的致病力以及室内防治效果均显著高于野生球孢白僵菌。本发明进一步提供了松褐天牛球孢白僵菌突变株B252在防治天牛等害虫方面的应用。
【专利说明】松褐天牛球孢白僵菌航天突变株B252及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及昆虫病原真菌突变体，尤其涉及松褐天牛球孢白僵菌航天突变株，本发明进一步涉及松褐天牛球孢白僵菌航天突变株在防治天牛中的应用，属于球孢白僵菌突变株及其应用领域。
【背景技术】
[0002]由松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner&Buhrer) Nickle)引起的松材线虫病是一种毁灭性松树病害，严重威胁着林业发展。在东亚，该病主要借助羽化后的松褐天牛(Monochamus alternates Hope)成虫进行自然传播,在补充营养时传到健康松树上，导致松树死亡。松褐天牛在中国东至台湾、南至广东、西至西藏、西北至秦岭、北至河北、东北至辽宁均有分布。因此，切断松材线虫病的传播途径，有效地降低其传播媒介昆虫松褐墨天牛的种群密度，显得尤为重要。
[0003]球抱白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.)是中国应用最为广泛的一种昆虫病原真菌(李增智，樊美珍)，国内外学者应用白僵菌防治松褐天牛做了很多研究(蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学[M].合肥:安徽省科技出版社，1996:271~361 ;张玲华，田兴山.微生物空间诱变育种的研究进展[J].核农学报，2004，18 (4):294-296 ;宋满刚，张满贵，缪美锁，红晓祥，梁虹，罗宝君.我国太空育种成果显著[J].种子世界，2004，7:57)。球孢白僵菌和其它昆虫病原真菌一样，作为生物农药，尽管具有化学农药不可比拟的众多优点，但存在致死害虫的时间较长，同时还存在受环境影响较大、防治效果不稳定以及自身抗逆性较差等缺点。为了改变这种境况，通过高效率育种对微生物的生理变异和遗传变异，对昆虫病原真菌进行改造，航天诱变为选育生物防治优良菌株提供了新途径(农向群，张泽华，胡攀，高松，张礼生.航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应[J].菌物学报，2006，25 (4):674-681)，并成功地筛选到优良的金龟子绿僵菌航天突变体。以获得适合市场需要的产品。
[0004]太空环境具有较好的诱变作用，可以产生改善菌种的有利性状、创造新品种等有益变异，还可发诱发与产量有关的数量性状变异，但很多变异具有一定的随机性。搭载微生物的主要目的就是通过设计最佳方案筛选那些产量高、价值大的变异生产菌株(孙继美，丁珊，肖华，等.球孢白僵菌防治松墨天牛的研究[J].森林病虫通讯，1997 (3): 16-18)，而为了选择得到性状稳定的新品种或品系，需要进行大量繁重的筛选和检测试验(刘洪剑，朴春根，汪来发，等.白僵菌和肿腿蜂对松墨天牛幼虫的作用[J].林业科学，2007，43 (5):64 - 68;张立钦，刘军.松墨天牛优良白僵菌菌株筛选[J].南京林业大学学报，2000，24(2): 33-37)。
[0005]从松褐天牛幼虫身体分离的球孢白僵菌进行航天诱变筛选获得在生产性能或对天牛致病力上有显著提高的突变体，这对于天牛的生物防治将具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的是将从松褐天牛幼虫身体分离的球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.)进行航天诱变筛选获得在生产性能或对天牛致病力上有显著提高的突变株；
[0007]本发明的另一目的是将所获得的航天诱变突变株应用于天牛的生物防治。
[0008]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0009]—株在生产性能或对天牛致病力上有显著提高的球孢白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.) Vuill.)突变株B252，其微生物保藏号是=CGMCC N0.8048 ;分类命名:球孢白僵菌Beauveria bassiana ;保藏时间:2013年8月20日；保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0010]本发明将球抱白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.) Vuill.)菌株 cfcc81357 分为两份，一份留在地面常规保存用作对照(CK);另一份搭载“神舟”8号飞船历时6d 20h进行航天诱变，航天搭载菌株返回地面后，以未搭载的原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得在生长性能或对天牛致病能力有显著提高的突变体。
[0011]本发明首先通过显微镜观察了航天诱变对于球孢白僵菌的外部形态的影响，通过观察可以看到原始菌株的分生孢 子梗着生在营养菌丝上，产孢细胞簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的孢囊上，瓶形，颈部明显延长成产孢轴，轴上具有小齿突，呈“之”字形弯曲，产孢细胞和孢囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上聚成球形至卵形的相当密实的孢子头，分生孢子球形或近球形。突变菌株B130菌丝一般向同一方向竖直生长，菌丝长且直，不产生孢子。B159的菌丝形态与原始菌株相比，隔膜明显，且菌丝在每个隔膜之间都稍有弯曲。突变菌株B252的菌丝与孢子形态与原始菌株无明显差异。
[0012]本发明将球孢白僵菌航天诱变菌株的生长速度与原始菌株进行了对比，筛选结果发现，航天诱变菌株出现了正负双向变异，但是大多数的菌株都呈现出负向变异，只有较少的菌株呈现出正向变异，变异幅度较大，说明航天诱变对球孢白僵菌菌落的生长速度的趋向和幅度均有影响。各菌落直径平均每天都有2mm以上的增长，属于生长比较迅速的类型。培养IOd后，菌株B252的菌落直径均大于原始菌株。
[0013]通过观察航天诱变对于菌丝干重的影响发现，球孢白僵菌突变体菌株培养过程菌丝干重变化幅度不大，培养4d后，菌丝干重最重的菌株的B252为0.8391g。
[0014]航天诱变对球孢白僵菌菌株产孢量的影响出现了不同趋向、不同幅度的变异。其中产孢量最多的为菌株B252，其产孢量为2.09 X 107cfu/mL,而菌株B130不产孢，通过菌丝形态观察也可以说明其无孢子产生。
[0015]本发明进一步考察航天诱变对致病力的影响，接种后各突变体对松褐天牛幼虫的致病力有所不同，航天诱变对致病力影响较大，出现负向突变的较多。第4天幼虫开始死亡，突变体B252的致病力相比原始菌株有显著提高，在致死速度上也快于原始菌株，说明突变体B252对松褐天牛幼虫具有较强的致病力。
[0016]室内防治效果实验表明，B252菌株对天牛的防治效果显著高于球孢白僵菌野生菌株。
[0017]从总体上看，球孢白僵菌经航天诱变后，产生了丰富的性状变异，只有少数突变株呈现出正向变异作用，航天诱变的负效应大于正效应，对生长速度、产孢量、致病力等很多性状都表现出不同程度的抑制作用，表现出了不同的的变异趋向和幅度。生长速度、产孢量和致病力是筛选生物防治菌株的重要指标，航天诱变使这些特性表现出不同变异趋向和幅度，证明了航天诱变是非定点的、广泛性的、正负双向性的，且诱变位点多、诱变率高，所导致的生物体变异有生理性变异也可能有遗传性变异。本发明通过筛选航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，最终发现航天诱变菌株B252在生长特性以及对天牛致病力等方面发生了较大幅度的正向变异，是一株具有优异突变性状的菌株，在天牛的防治等生产和研究中具有广泛的应用前景。
[0018]因此，本发明还提供了一种防治天牛的球孢白僵菌微生物制剂，所述微生物制剂包括:球孢白僵菌B252的孢子粉或发酵液以及制剂载体。
[0019]作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到球孢白僵菌B252孢子粉:(O制备球孢白僵菌B252发酵液；(2)从球孢白僵菌B252发酵液中回收孢子产物；(3)干燥所回收的球孢白僵菌孢子产物，即得。
[0020]本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到球孢白僵菌B252发酵液；例如，采用三级培养方法，即:种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到球孢白僵菌B252发酵液；其中，在液体发酵培养时，可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白 胨或黄豆粉中的任一种或多种。
[0021]本发明进一步提供一种制备防治天牛的球孢白僵菌B252微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤:将球孢白僵菌B252的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂，例如，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。
[0022]其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸杆、干燥的农家肥等；此外，本发明的淡紫拟青霉微生物制剂中还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1航天诱变球孢白僵菌形态变异与原始菌株菌落形态；A-1:B122，B130, B159,B252, B260, B283, BJ-1, BJ-80，野生型。
[0024]图2航天诱变球孢白僵菌突变体的菌丝结构。
[0025]图3球孢白僵菌航天突变体生长速度与原始菌株比较。
[0026]图4球孢白僵菌航天突变体菌丝干重与原始菌株比较。
[0027]图5球孢白僵菌航天突变体产孢量与原始菌株比较。
【具体实施方式】
[0028]通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0029]实验例I球孢白僵菌航天诱变突变株的筛选及诱变效应的测定实验
[0030]I实验材料及方法
[0031]1.1 菌株
[0032]球抱白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.) Vuill.)(菌株号 cfcc81357)系从江苏省溧水市马尾松树中感染白僵菌的松墨天牛幼虫体表分离纯化获得。
[0033]供试球孢白僵菌(Beauveria bassiana)航天诱变返地后,于本试验室4°C保存,备用。
[0034]1.2航天搭载
[0035]将球抱白僵菌(Beauveriabassiana (Bals.) Vuill.)菌株 cfcc81357 分别分为两份，一份留在地面常规保存用作对照(CK);另一份于2011年11月I日搭载“神舟”8号飞船，历时6d20h，返回地面后，及时取出材料低温保存。
[0036]1.3突变体筛选
[0037]将经航天诱变处理后的球孢白僵菌菌株和野生型菌株(CK)分别制成孢子悬浮液(B130为菌丝体)，稀释孢 子浓度到1\10\血/11^，涂布到？04平板上(每皿加0.1mL孢子液)，25°C恒温培养4-6d后，观察单菌落大小、形态和正反面颜色，挑选出与野生型菌株(CK)差别较明显的菌株。
[0038]1.4航天诱变效应的测定
[0039]以未搭载的原始菌株为对照，比较航天菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性。
[0040]1.4.1突变菌株的形态和色素变化观察
[0041]从已生长好的平板上，用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5%。吐温的溶液中，充分震荡，制成孢子悬浮液。用灭好菌的直径为6mm的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于25°C温箱中培养,每个菌株3皿,观察菌落的形态、颜色。
[0042]1.4.2菌丝及孢子形态观察
[0043]将一灭菌盖玻片以45°角斜插在刚接过菌的培养基上，25°C恒温培养3d后将盖玻片拔出，显微观察并拍照(徐福元，张培，赵菊林等.利用小蠹虫释传白僵菌技术防治松材线虫病的研究[J].林业科学研究，2000, 13(专):林业科学研究第22卷)。
[0044]1.4.3菌落生长速度测定
[0045]用灭菌的直径为6mm的滤纸片蘸满孢子液放在培养皿中央，置于25°C温箱中培养，以十字交叉法每天测菌落直径，第5天起开始，共测6天。野生型菌株为对照，重复3次。
[0046]1.4.4菌丝干重测定
[0047]250mL锥形瓶装IOOmL PD培养基，吸取0.2mL孢子悬浮液于每瓶培养基中，恒温摇床温度为25°C，转速为120r/min。培养4d后，从三角瓶中倒出所有菌液，离心倒上清，将沉淀倒在滤纸上，60°C烘箱烘干至恒重，称重。
[0048]1.4.5产孢量测定
[0049]用直径为6mm的打孔器切菌落3块于5mL含0.5%。吐温的溶液中，充分震荡后在显微镜下用血球计数板计数，计算产孢量，设3次重复。
[0050]2结果与分析[0051]2.1航天诱变对菌落形态和色素变化的影响
[0052]在PDA平板上，不同分离菌株表现出的培养特性各不相同，与原始菌株差异较大。菌落一般呈平绒状或者丛毛状，表面白色或乳白色，有的逐渐产生淡黄色粉末状孢子，背面为黄褐色，有些有深褐色环状或者沟壑状线条存在(图1，表1)。
[0053]表1球孢白僵菌航天突变体的菌落形态特征
【权利要求】
1.球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.)航天诱变突变株B252,其特征在于，其微生物保藏号是=CGMCC N0.8048。
2.权利要求1所述的航天诱变突变株B252在防治害虫中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的害虫是松褐天牛(Monochamusalternates Hope)。
4.一种防治害虫的微生物制剂，其特征在于，包括:权利要求1所述的航天诱变突变株B252的孢子粉或发酵液以及制剂载体。
5.按照权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于:所述的害虫是松褐天牛(Monochamus alternates Hope)。
6.按照权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于:所述的制剂载体是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸杆或干燥的农家肥。
7.按照权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于:还含有辅料或助剂。
8.按照权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于:所述的辅料是蟹壳粉或几丁质；所述的助剂是润湿剂、分散剂或稳定剂。
9.一种制备权利要求4-8任何一项所述微生物制剂的方法，包括以下步骤:将航天诱变突变体B252的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，得到微生物制剂。
【文档编号】C12R1/645GK103602594SQ201310538354
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】王曦茁, 汪来发, 刘洪剑, 董广平, 马建伟 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所