家蚕钙离子-atp酶基因重组表达载体及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，用家蚕前部丝腺特异性启动子调控家蚕钙离子-ATP酶在家蚕前部丝腺特异表达，将该重组表达载体显微注射入家蚕蚕卵内获得了转基因家蚕阳性个体，对转基因家蚕阳性个体的研究发现，钙离子-ATP酶在mRNA和蛋白水平上都得到了过量表达，对转基因蚕丝纤维进行力学拉伸试验发现其力学性能得到显著提高，红外光谱分析发现转基因蚕丝纤维的结构发生了变化，因而运用本发明构建的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体可以改变蚕丝纤维的力学性能，有助于获得更加优良的蚕丝纤维。
【专利说明】家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种家蚕基因重组表达载体，以及其在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用。
【背景技术】
[0002]蚕丝纤维为蛋白质纤维，是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。但由于蚕丝蛋白结构上的缺陷，蚕丝纤维的力学性能相比合成纤维较差，从而制约了其在新型高分子纤维、特种材料等领域的应用。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕基因重组表达载体，目的之二在于提供该重组表达载体在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用；目的之三在于提供利用该重组表达载体提高蚕丝纤维力学性能的方法。
[0004]为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案:
[0005]1.家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，是将由家蚕前部丝腺特异性启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因⑶S序列和终止子组成的表达框插入含荧光报告基因的转座载体中而制得；所述家蚕钙离子-ATP酶基因⑶S序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]进一步，所述家蚕前部丝腺特异性启动子为家蚕表皮蛋白BmCP231启动子或BmCP274启动子，所述BmCP231启动子序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1457位核苷酸所示，或者如SEQ ID N0.4中第I位至第1511位核苷酸所示；所述BmCP274启动子序列如SEQID N0.9 所示。
[0007]进一步，所述重组表达载体是将由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因CDS序列和SV40终止子组成的表达框插入pBac [3xP3-EGFPafm]载体的AscI酶切位点而制得；所述BmCP231启动子序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1511位核苷酸所示。
[0008]2.家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用。
[0009]3.利用家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体提高蚕丝纤维力学性能的方法，包括以下步骤:将家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体与编码转座酶的转基因辅助载体等摩尔比混合，显微注射入已解除滞育的产卵后2~5小时的蚕卵中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25°C催青至孵化，孵化出的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，再取卵期第7天的蚕卵，在显微镜下进行荧光检测，筛选出在眼睛或神经特异发射荧光的转基因个体，获得转基因家蚕，其生产的蚕丝纤维即为力学性能提高的蚕丝纤维。
[0010]本发明的有益效果在于:本发明构建了家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，用家蚕前部丝腺特异性启动子调控家蚕钙离子`-ATP酶在家蚕前部丝腺特异表达，将该重组表达载体显微注射入家蚕蚕卵内获得了转基因家蚕阳性个体，对转基因家蚕阳性个体的研究发现，钙离子-ATP酶在mRNA和蛋白水平上都得到了过量表达，对转基因蚕丝纤维进行力学拉伸试验发现其力学性能得到显著提高，红外光谱分析发现转基因蚕丝纤维的结构发生了变化。因而运用本发明构建的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体可以改变蚕丝纤维的力学性能，有助于获得更加优良的蚕丝纤维。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0012]图1为转基因家蚕的Southern Blot检测结果，其中I为转基因家蚕基因组；2为
非转基因家蚕基因组。
[0013]图2为转基因家蚕的荧光定量PCR检测结果，其中I为转基因家蚕前部丝腺基因组，2为非转基因家蚕前部丝腺基因组。
[0014]图3为转基因家蚕的Western Blot检测结果，其中I为非转基因家蚕前部丝腺蛋白样品，2为转基因家蚕前部丝腺蛋白样品。
[0015]图4为转基因蚕丝纤维的红外光谱扫描结果，其中A为非转基因蚕丝纤维，B为转基因蚕丝纤维，曲线a为红外吸收曲线，曲线b为红外吸收值通过傅里叶去卷积化后形成的曲线，箭头处为1660CHT1的峰。
【具体实施方式】
[0016]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂`商所建议的条件。
[0017]优选实施例中使用的家蚕品种为大造，由西南大学家蚕基因资源库提供。
[0018]一、家蚕钙离子-ATP酶基因的克隆
[0019]根据家蚕基因组数据库中钙离子-ATP酶基因(BGIBMGA006603)的CDS序列(SEQID N0.1)，设计I对上下游引物，委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列如下:6603_F:5，-cgacgcgtatggaggacgctcacacga-3，(SEQ ID N0.2,下划线部分为 Mlu I酶切位点):6603_R:5’ -atttgcggccgcttatagtggtccgtagatgatgatg-3’ (SEQ ID N0.3,下划线部分为Not I酶切位点)。
[0020]以五龄第三天的大造马氏管cDNA为模板，采用6603-F和6603-R引物PCR扩增BGIBMGA006603基因CDS片段。PCR反应条件为:94°C预变性4分钟；然后94°C变性40秒，65 °C退火40秒，72 °C延伸3分钟，共24个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收纯化目的片段，再克隆入载体PMD19-T Simple(TaKaRa),获得重组载体 PMD19-BGIBMGA006603。
[0021]二、家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体的构建
[0022]将重组载体pMD19-BGIBMGA006603 用 Mlu I 和 Not I 双酶切，回收 BGIBMGA006603基因CDS片段，再与同样经Mlu I和Not I双酶切的载体pSL[BmCP231-DsRed-SV40]连接，获得重组载体 pSL[BmCP231-BGIBMGA006603-SV40]。所述载体 pSL[BmCP231-DsRed_SV40]的构建方法参见中国专利CN102604954B，家蚕表皮蛋白BmCP231启动子序列如SEQ IDN0.4中第I位至第1511位核苷酸所示。[0023]将重组载体pSL[BmCP231-BGIBMGA006603-SV40]用 Asc I 酶切，回收BmCP231-BGIBMGA006603-SV40片段，再与同样经Asc I酶切的转座载体pBac [3xP3-EGFPafm]连接，获得重组载体 pBac [BmCP231-BGIBMGA006603-SV40, 3xP3EGFP]。所述载体pBac[3xP3_EGFPafm]的构建方法参见文献(Horn and Wimmer, 2000),其携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因。
[0024]三、转基因家蚕的获得
[0025]将重组载体pBac [BmCP231-BGIBMGA006603-SV40, 3xP3EGFP]与编码 piggyBac 转座酶的转基因辅助载体PHA3PIG等摩尔比混合，显微注射入已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2~5小时，GO代)中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25°C催青至孵化，孵化出的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，再取卵期第7天的蚕卵(Gl代)，在宏观体视荧光显微镜(Olympus MVXlO)下以460~490nm波长的激发光检测，筛选出在眼睛或神经特异发射绿色荧光的转基因个体，即获得转基因家蚕。
[0026]随机选取转基因家蚕Gl代蚕蛾，提取基因组DNA进行Southern blot检测，结果如图1所示，EGFP的插入拷贝数为2个，由于BGIBMGA006603基因CDS片段与EGFP处在同一个转座子区域，则其插入拷贝数也为2个，表明携带BGIBMGA006603基因⑶S片段的piggyBac转座元件在转基因家蚕的基因组中发生了 2次转座事件。
[0027]四、转基因家蚕中钙离子-ATP酶及其编码基因的表达量检测
[0028]1、转基因家蚕中钙离子-ATP酶的基因表达量检测
[0029]分别取五龄第三天的转基因家蚕和非转基因家蚕的前部丝腺，在液氮中快速研磨并提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，采用特异引物6603qPCR_F[5’ -aatcccttcaatgttcctaa_3’ (SEQ ID N0.5)]和 66 03qPCR-R[5，_tgctcccttgacaaatagtt_3，(SEQ ID N0.6)],突光定量PCR检测BGIBMGA006603基因⑶S片段的相对表达量，以sw为内参，内参引物sw_F:5’-ttcgtactg-gctcttctcgt-3’ (SEQ ID N0.7);sw-R:5’-caaagttgatagcaattccct-3’ (SEQID N0.8)。PCR反应条件为:95°C预变性30秒，然后95°C变性3秒，60°C退火30秒，共40个循环。结果如图2所示，BGIBMGA006603基因CDS片段在转基因家蚕的前部丝腺中得到了过量表达。
[0030]2、转基因家蚕中钙离子-ATP酶的蛋白表达量检测
[0031]分别取五龄第三天的转基因家蚕和非转基因家蚕的前部丝腺，在液氮中快速研磨使溶于RIPA裂解液中，4°C放置I小时，离心取上清，测定总蛋白浓度后，与5X加样缓冲液混合，37°C孵育30分钟，进行8%SDS-PAGE，电泳完毕后，以Anti_BGIBMGA006603抗体为一抗、Tubulin抗体为内参照抗体进行Western blot分析。结果如图3所示，钙离子-ATP酶在转基因家蚕的前部丝腺中得到了过量表达。
[0032]五、转基因蚕丝纤维的力学性能与结构检测
[0033]1、转基因蚕丝纤维的力学性能检测
[0034]分别将转基因家蚕和非转基因家蚕的头胸部固定，利用机器马达按照60r/min的速度匀速将蚕丝从家蚕吐丝口拉出。取一部分蚕丝纤维，利用万能测试仪进行拉伸试验，实验在温度26°C、空气湿度54%条件下进行，使用50N传感器，拉伸速度为3mm/min，记录蚕丝的断裂载荷及断裂位移；另取一部分蚕丝纤维进行电镜扫描，测量蚕丝纤维的直径；再按以下公式计算最大应力和最大应变:最大应力=断裂载荷/横截面积，最大应变=断裂位移/丝纤维的长度χιοο%。结果见表1，相比非转基因蚕丝纤维，转基因蚕丝纤维的刚性和韧性都得到了提高。
[0035]表1转基因及非转基因蚕丝的力学性能数据
[0036]
样品断裂载荷(N)断裂位移(mm)最人应力CMPa)最人应变转基因蚕丝0.0296^0.0065*9.29IS-2.0926109.07-24.76*61.57 土 14.18*非转基因蚕丝().()25()1().0()918.9257士2.1 56883.81 土 24.0952.82土 102
[0037]*表示转基因蚕丝与非转基因蚕丝之间具有显著性差异，p〈0.05。
[0038]2、转基因蚕丝纤维的结构检测
[0039]分别取转基因蚕丝纤维和非转基因蚕丝纤维进行红外光谱检测，实验在温度22°C、空气湿度46%条件下进行，采用红外透射扫描，采集时间为51s，采集次数为256次。结果如图4所示，转基因蚕丝纤维在1660CHT1处的峰面积较非转基因蚕丝纤维大，由于该峰峰面积代表样品中β折叠的含量，因此转基因蚕丝纤维的β折叠含量较非转基因蚕丝纤维高，说明转基因蚕丝纤维的结构发生了变化，由此导致了其力学性能的提高。
[0040]上述优选实施例中使用的家蚕前部丝腺特异性启动子为序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1511位核苷酸所示(含信号肽)的家蚕表皮蛋白BmCP231启动子，除该启动子外，其它家蚕前部丝腺特异性启动子都适用于本发明，例如，序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1457位核苷酸所示(不含信号肽)的家蚕表皮蛋白BmCP231启动子(CN102604954B)，或者序列如SEQ ID N0.9所示的家蚕表皮蛋白BmCP274启动子(CN102604953B)。这些特异性启动子都可以调控钙离子-ATP酶在家蚕前部丝腺的特异表达，提高转基因蚕丝纤维的力学性能，只是钙离子-ATP酶在转基因家蚕中过量表达的量可能不同，从而导致转基因蚕丝纤维在力学性能的提高幅度上略有区别。
`[0041]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，其特征在于，是将由家蚕前部丝腺特异性启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因⑶S序列和终止子组成的表达框插入含荧光报告基因的转座载体中而制得；所述家蚕钙离子-ATP酶基因⑶S序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如权利要求1所述的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，其特征在于，所述家蚕前部丝腺特异性启动子为家蚕表皮蛋白BmCP231启动子或BmCP274启动子，所述BmCP231启动子序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1457位核苷酸所示，或者如SEQ ID N0.4中第I位至第1511位核苷酸所示；所述BmCP274启动子序列如SEQ ID N0.9所示。
3.如权利要求2所述的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将由家蚕表皮蛋白BmCP231启动子、家蚕钙离子-ATP酶基因CDS序列和SV40终止子组成的表达框插入pBac[3xP3-EGFPafm]载体的Asc I酶切位点而制得；所述BmCP231启动子序列如SEQ ID N0.4中第I位至第1511位核苷酸所示。
4.权利要求1至3任一项所述的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体在提高蚕丝纤维力学性能方面的应用。
5.利用权利要求1至3任一项所述的家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体提高蚕丝纤维力学性能的方法，其特征在于，包括以下步骤:将家蚕钙离子-ATP酶基因重组表达载体与编码转座酶的转基因辅助载体等摩尔比混合，显微注射入已解除滞育的产卵后2~5小时的蚕卵中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25°C催青至孵化，孵化出的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，再取卵期第7天的蚕卵，在显微镜下进行荧光检测，筛选出在眼睛或神经特异发射荧光的转基因个体，获得转基因家蚕，其生产的蚕丝纤维即为力学性能提高的蚕丝纤维。`
【文档编号】C12N15/85GK103555761SQ201310516484
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】赵萍, 王鑫, 谢康, 衣启营, 马三垣, 夏庆友 申请人:西南大学