同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法，其特征是，包括如下步骤：将小鼠麻醉处死后，U型剖开腹腔，经门静脉，以胶原酶、蛋白酶灌注，肝脏变软后剥离肝包膜制成细胞悬液，Nycodenze梯度离心分离；吸取细胞层，加入大鼠抗小鼠THY1抗体，该抗体为0.2-0.25μg/L×106细胞终浓度，4℃孵育25-30min；用PBS?buffer洗涤细胞一次，并将细胞浓度定为1-2×106个/ml，然后加入山羊抗大鼠IgG?Dynabeads免疫磁珠，混匀后置2-8℃孵育15-20min；将分离柱安装入磁场中1-2min分离出成纤维母细胞；吸取上清混悬后分离出肝星状细胞。
【专利说明】同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于小型动物肝纤维化研究时肝星状细胞和成纤维母细胞的同时分离方法。
【背景技术】
[0002]肝纤维化是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础，是临床肝硬化发展的必经中间环节。近年来研究认为肝纤维化经有效治疗，仍有逆转可能。目前认为肝星状细胞的激活及表型转化在肝纤维化过程中起关键作用，是肝纤维化发生的中心环节，是肝纤维化病理形成的细胞学基础。在正常情况下，肝星状细胞处于“静止状态”，受炎性细胞因子等病理因素刺激后活化，激活的肝星状细胞转分化为成纤维母细胞，成纤维母细胞的活化不仅表现为数量及表型的改变，更重要的是生物学功能发生很大变化，开始分泌大量的胶原，转变为肝纤维化甚至肝硬化。研究区别两种细胞间的差异、特性，进而阻断肝星状细胞向成纤维母细胞转化，成为针对性研究防治肝纤维化的靶标。如何高纯度、便捷的分离肝星状细胞和成纤维母细胞成为研究的难点。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种高效、便捷的同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法，既保证了细胞的高纯度，也能保障细胞的活力，为下一步研究提供了闻质量的细胞。
[0004]根据实施例，本发明提供的一种同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法，其创新点在于，包括如下步骤:
[0005]将小鼠麻醉处死后，U型剖开腹腔，经门静脉，以胶原酶、蛋白酶灌注，肝脏变软后剥离肝包膜制成细胞悬液，Nycod`enze梯度离心分离；
[0006]吸取细胞层，加入大鼠抗小鼠THYl抗体，该抗体为0.2-0.25 μ g/L X IO6细胞终浓度，4°C孵育25-30min;用PBS buffer洗涤细胞一次，并将细胞浓度定为1-2X IO6个/ml，然后加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混匀后置2-8°C孵育15_20min ;将分离柱安装入磁场中l_2min分离成纤维母细胞；吸取上清混悬后分离出肝星状细胞。
[0007]根据一个实施例，本发明前述同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法中，分离出纤维母细胞和肝星状细胞后，加入适量含10%胎牛血清的DMEM，细胞悬液按1-2 X IO5个/ml细胞接种至12孔细胞培养板上，370C，5%C02培养箱中培养。
[0008]相对于现有技术，本发明用于小动物，同时分离肝星状细胞中和成纤维母细胞的方法，Nycodenze梯度离心分离后的细胞悬液,进一步和包被THYl抗体的磁珠混合,在磁场中分离出成纤维母细胞，上清液洗涤后分离肝星状细胞。本发明方法具有高效高纯度分离两种细胞的特点，节省研究经费和时间，具有良好的推广应用价值。本发明具有如下优点:(I)从同一个体同时分离两种细胞，减少了细胞个体差异的影响，更接近体内细胞间的相互作用；(2)同时分离两种细胞，节约研究经费和时间；(3)操作简便，高效高纯度的分离细胞，能够用于研究细胞间表型转化，肝纤维化。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为荧光显微镜观察到的细胞形态图(HSC分离培养Id)。
[0010]图2为荧光显微镜观察到的细胞形态图(HSC分离培养6d)。
[0011]图3为荧光显微镜观察到的细胞形态图(成纤维母细胞Id)。
[0012]图4为荧光显微镜观察到的细胞形态图(成纤维母细胞培养6d，DAPI染色)。
[0013]图5为荧光显微镜观察到的细胞形态图(肝星状细胞a -SMA染色)。
[0014]图6为荧光显微镜观察到的细胞形态图(成纤维母细胞THYl染色)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
[0016]一、主要试剂:
[0017]EGTA、I型胶原酶、DNase 1、链酶蛋白酶E、Nycodenz均购自美国Sigma公司，胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司，免疫磁珠购自美国Invitrogen公司，大鼠抗小鼠a -SM, THYl单克隆抗体购自美国eBioscience公司，SABC免疫组织化学染色试剂盒、 DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。其余试剂为国产分析纯产品。
[0018]二、主要仪器:`
[0019]荧光显微镜、超速离心机、倒置显微镜、C02培养箱、电子天平、水浴锅、恒流泵、磁力加热搅拌器。
[0020]三、主要灌流液:
[0021]HBSS 液:NaC18.0g/L, KC10.4g/L, KH2P040.06g/L, Na2HP04 ? 12H200.1344g/L, NaHCO30.35g/L。用双蒸水配置后，调整pH=7.4分装于洁净的250ml玻璃瓶中，过滤灭菌后低温保存。
[0022]DNase I溶液:DNase I 25mg,加0.9%生理盐水2.5ml,过滤除菌，_20°C保存。悬浮缓冲液:HBSS 液 100ml, DNase I (10mg/ml) 0.08ml。
[0023]8%Nycodenz 溶液:Nyxodenz7.75g 加入 23ml 左右 HBSS 最终 27ml, 0.22um 滤器过
滤除菌。
[0024]酶灌流液及消化液:DNA酶I (10mg/ml) 0.275ml，链酶蛋白酶E150mg。补充 HBSS220ml，取140ml加入胶原酶I 75mg，作为酶灌注液；剩下的80ml加入80mg牛血清白蛋白，作为消化液，酶灌流液及消化液过滤除菌。
[0025]四、主要操作步骤:
[0026]试验例I
[0027]小鼠麻醉后，U型剖开腹腔，经门静脉，以胶原酶、蛋白酶灌注，肝脏变软后剥离肝包膜制成细胞悬液，Nycodenze梯度离心分离。吸取细胞层，加入加入大鼠抗小鼠THYl抗体(0.25 u g/LX IO6细胞终浓度)，4°C孵育30min ;用PBS buffer洗涤细胞一次，并将细胞浓度定为I X IO6个/ml然后加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混匀后置2_8°C孵育20min ;将分离柱安装入磁场中2min分离成纤维母细胞；吸取上清混悬后分离出肝星状细胞。加适量含10%胎牛血清的DMEM，细胞悬液按2X IO5个/ml细胞接种至12孔细胞培养板上，37 0C，5%C02培养箱中培养。
[0028]试验例2
[0029]小鼠麻醉后，U型剖开腹腔，经门静脉，以胶原酶、蛋白酶灌注，肝脏变软后剥离肝包膜制成细胞悬液，Nycodenze梯度离心分离。吸取细胞层，加入加入大鼠抗小鼠THYl抗体(0.2 u g/LX IO6细胞终浓度)，4°C孵育25min ;用PBS buffer洗涤细胞一次，并将细胞浓度定为2X IO6个/ml然后加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混匀后置2_8°C孵育15-20min ;将分离柱安装入磁场中Imin分离成纤维母细胞；吸取上清混悬后分离出肝星状细胞。加适量含10%胎牛血清的DMEM，细胞悬液按I X IO5个/ml细胞接种至12孔细胞培养板上，37 0C，5%C02培养箱中培养。
[0030]五、试验结果:
[0031]细胞形态观察:实施例1和实施例2刚分离的HSC均为折光性很强的小圆细胞，形态均一；体外培养Id后HSC大多贴壁生长，光镜下可见脂肪颗粒(如图1所示);体外培养6d 后，脂滴消失胞浆开始伸展，胞体变得伸展(如图2所示)。实施例1和实施例2刚分离的成纤维母细胞为多边形(如图3所示)，培养6d后伸展成为梭形(如图4所示)。
[0032]六、成纤维母细胞及肝星状细胞的鉴定:
[0033]a -SM,THYl细胞免疫荧光方法检测实施例1和实施例2分离出的肝星状细胞及成纤维母细胞。4°C预冷PBS缓冲液洗细胞爬片2minX2次，4%多聚甲醛室温固定15min， PBS缓冲液洗5minX2次；含0.03%Triton_X100的PBS室温孵育30min，室温PBS缓冲液洗5minX3次；3%羊血清室温下孵育Ih封闭非特异性抗原；封闭液稀释的一抗(a -SMA，I: 100 ；THY1,1: 200) 4°C孵育过夜；室温PBS缓冲液洗5min X 3次，PBS稀释相对应的荧光二抗(I: 100)避光室温孵育20min ;室温PBS缓冲液洗5minX 3次，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察(如图5-6所示)。
【权利要求】
1.一种同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法，其特征是，包括如下步骤: 将小鼠麻醉处死后，U型剖开腹腔，经门静脉，以胶原酶、蛋白酶灌注，肝脏变软后剥离肝包膜制成细胞悬液，Nycodenze梯度离心分离； 吸取细胞层，加入大鼠抗小鼠THYl抗体，该抗体为0.2-0.25 μ g/LX IO6细胞终浓度，4°C孵育25-30min;用PBS buffer洗涤细胞一次，并将细胞浓度定为1-2X IO6个/ml，然后加入山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠,混匀后置2-8°C孵育15_20min ;将分离柱安装入磁场中l_2min分离出成纤维母细胞；吸取上清混悬后分离出肝星状细胞。
2.根据权利要求1所述的同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法，其特征是，分离出成纤维母细胞和肝星状细胞后，加入适量含10%胎牛血清的DMEM，细胞悬液按1-2 X IO5个/ml细胞接种至12孔细胞培养板上，37°C，5%C02培养箱中培养。
【文档编号】C12N5/071GK103555656SQ201310507049
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】孙姗姗, 周时高, 何颂华, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:上海中医药大学附属龙华医院