一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学或代谢工程领域。本发明将编码丙二酸转运酶的基因matB、丙二酸吸收途径的基因matC、酪氨酸脱氨酶(TAL)的基因、4-香桂酸：辅酶A连接酶(4CL)基因、查尔酮合成酶(CHS)基因、查尔酮异构酶(CHI)基因，共计六个基因组成的合成途径引入大肠杆菌BL21，从而获得了一株能以酪氨酸为底物合成柚皮素的重组菌，并通过模块化改造理论优化合成途径，最终菌株在摇瓶中以酪氨酸为底物发酵72h后，柚皮素的产量达到90mg/L。本发明采用的策略为今后微生物法生产天然小分子物质提供了一定的借鉴意义。
【专利说明】一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学或代谢工程领域。
【背景技术】
[0002]黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2_苯基色原酮结构的化合物，其羟基衍生物多具黄色，因而得名。黄酮类化合物具有多种生物活性，主要包括心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎等，对镇痛、保肝、抗突变、降血糖和止咳平喘等具有预防、治疗或辅助治疗效果，而且人体不能合成黄酮类化合物，只能从植物性食物中获得，因此近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30%以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。
[0003]黄酮类化合物分布广泛，种类繁多，黄酮类化合物主要包括黄酮类(如黄岑素、黄岑苷等)、黄酮醇类(如槲皮素、生松素等)、二氢黄酮类(如陈皮素、甘草苷等)、二氢黄酮醇类(如水飞蓟素、异水飞蓟素等)、异黄酮类(如大豆素、葛根素等)、二氢异黄酮类(如鱼藤酮等)、查尔酮类(如异甘草素、补骨脂乙素等)、橙酮类(如金鱼草素等)、黄烷类(如儿茶素等)、花色素类(如飞燕草素、矢车菊素等)和双黄酮类(如银杏素、异银杏素等)。而其中柚皮素是一种很重要的黄酮骨架物质，通过对柚皮素进行羟基化、还原化、烷基化、氧化等修饰可以获得八千多种其他黄酮类物质，另外柚皮素本身作为一种黄酮物质具有多种生物活性，主要包括缓解神经痛，防止脑水肿的发生，减少脑缺血的发生几率等。
[0004]目前，工业上生产柚皮素主要采用植物提取的方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度柚皮素仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及柚皮素的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产柚皮素的研究都是在以香豆酸为底物，然而香豆酸价格昂贵，并且溶解度较低，难以存在于一般的培养基中；另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这些都抑制了微生物法在大规模工业化生产中的应用。
[0005]本发明成是以较廉价的酪氨酸为底物，并通过模块化改造策略优化菌株使其在单一培养基中取得较高的柚皮素产量，为大规模工业化生产奠定了一定的基础。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌及其构建方法，是在Escherichia coli(BL21)中共表达3个质粒:pCDF-RgTAL_Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI 和 pACYCD-matB-matC。[0007]所述pCDF-RgTAL_Pc4CL是携带了编码酪氨酸脱氨酶TAL和4_香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因的P⑶FDuet-1。所述pET-PhCHS-MsCHI是携带了编码查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI的基因的pETDuet-Ι。所述pACY⑶-matB_matC是携带了编码丙二酸转运基因matB、丙二酸吸收酶的基因matC的pACYCDuet-1。pCDF-RgTAL_Pc4CL采用启动子Trc，拷贝数为20 ；pET-PhCHS-MsCHI采用启动子T7，拷贝数为40 ;pACYCD-matB-matC采用启动子T7，质粒拷贝数为10。
[0008]编码所述丙二酸转运的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码所述丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，编码所述酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，编码所述4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，编码所述查尔酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，编码所述查尔酮异构酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009]构建含有所述合成途径的Escherichia coli (BL21)重组菌的方案主要包括以下内容:
[0010](I)采用全基因合成方法获得途径所需要的六个基因；
[0011](2)通过酶切连接构建得到三个共表达质粒P⑶F-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB_matC，测序验证后，将三个共表达质粒以化学法转化Escherichia coli (BL21)感受态细胞；
[0012](3)挑选能在含有100ug/mL的氨苄，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等四种抗生素的LB平板上生长的菌落，使其在含上述的四种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR验证六个途径基因已成功转入到Escherichiacoli(BL21)中。
[0013]利用含有所述合成途径的E`scherichia coli (BL21)重组菌发酵生产柚皮素的方法:
[0014](I)MOPS培养基(g/L):葡萄糖5，氯化铵4，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化铵5.1，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素(ATCC BAA-2326的配方)10ml，自来水定容；M0PS培养基的灭菌温度为115-121 °C，15min，维生素等热敏性材料配制后0.22 μ m膜过滤除菌，接种前加入。
[0015](2)将构建得到的基因工程菌株接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12_20h至菌株OD6tltl达到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基及终浓度ImM的IPTG，30 0C，250rpm条件下培养60h。
[0016]本发明的有益效果:本发明是以一株Escherichia coli (BL21)为出发菌株,利用合成生物学和代谢工程手段在菌株体内构建了一条从酪氨酸到柚皮素的由TAL、4CL、CHS、CH1、matB、matC等六个基因构成的合成途径，将总途径分成了三个模块，通过微调模块的代谢通量，使代谢流最大程度的流向终产物。重组菌Escherichia coli(BL21)在直接以酪氨酸为底物，发酵72h后，柚皮素的产量达到90mg/L，无需添加贵重的前体物质，只在单一培养基中便能合成柚皮素，成功实现了以酪氨酸为底物来合成柚皮素。其中采用的模块化改造策略为今后微生物法生产其他天然小分子化合物提供了一定的借鉴意义。
【专利附图】
【附图说明】[0017]图1模块化改造优化柚皮素产量。
[0018]图2LC-MS分析重组工程菌产生的柚皮素；A1，发酵液中产物的LC/ES1-MS图谱；A2，发酵液中产物的MS/MS图谱；B1，标准品的LC/ES1-MS图谱；B2，标准品的MS/MS图谱。
【具体实施方式】
[0019]柚皮素浓度的测定:高效液相色谱(HPLC)
[0020]仪器:Agilentll00高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件:
[0021]色谱柱:AminexHPX-87H ion exchange column
[0022]流动相:5mMH2SO4
[0023]流速:0.6mL/min/
[0024]柱温:35°C
[0025]进样量:5μ L
[0026]紫外检测器波长:320nm
[0027]样品制备:500 μ L发酵液在10，OOOrpm下离心lOmin，取上清液移入1.5mL离心管
中测柚皮素的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.45 μ m滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
[0028]MOPS培养基(g/L):葡萄糖5，氯化铵4，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化铵5.1，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素(ATCC BAA-2326的配方)IOml,自来水定容至1L。MOPS培养基的灭菌温度为115-121°C，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22 μ m膜过滤除菌，接种前加入。
[0029]实施例1途径基因的选择
[0030]苯丙氨酸脱氨酶(TAL)广泛存在于高等植物、真菌、酵母以及一种原核生物链霉菌，人类至今还没在真细菌或者动物组织中发现该酶。尽管TAL分布很广，但是只有R.glutinis用来做商业用途，同时R.glutinis对酪氨酸的催化活性也比其他种类要高。在最近的研究中，在最近的研究中，已经有人用P.crispum的4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、P.hybrida的查尔酮合成酶(CHS)、M.sativa的查尔酮异构酶(CHI)的组合来获得各种非天然的黄酮类骨架物质。因此本发明选择深红酵母(Rhodotorula glutinis)的TAL、香疗菜(Petroselinum crispum)的 4CL、矮牵牛(Petunia X hybrida)的 CHS、紫苜猜(Medicagosativa)的 CHI(M91079)。
[0031]天然产物生产平台的发展通常受到前体物质或者辅助因子的限制，因为宿主菌中这些物质的量通常都不能满足大规模工业化生产的要求。在形成黄酮类骨架物质时，每生成一个分子的骨架物质需要3mol的丙二酰辅酶A。而大肠杆菌在补充了葡萄糖的培养基指数生长时，其中乙酰辅酶A是辅酶A代谢池中主要组分，丙二酰辅酶A只占其中很少的一部分。因此源于大肠杆菌细胞内的丙二酰辅酶A分子成为限制性前体分子。丙二酰辅酶A的生成途径有两种，一种是乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的作用下转化为丙二酰辅酶A，因此可以通过共表达ACC基因、生物素连接酶基因(birA)以及乙酰辅酶A合成酶(ACS)来提高产量；另一种是通过丙二酰辅酶A合成酶直接将丙二酰和辅酶A转化为丙二酰辅酶A,这时可以通过过量表达三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的丙二酸转运的基因(matB)和丙二酸吸收途径的基因(matC)基因来提高产量。但是前一种代谢途径因为要添加生物素，对大规模生产化不利，因此选用后种代谢途径优化。
[0032]编码丙二酸转运的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，编码酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，编码4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，编码查尔酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，编码查尔酮异构酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0033]实施例2基于模块化改造理论的合成途径优化
[0034]对于构建好的合成途径，本研究欲将其分为三个模块，主要基于以下原则:i)4CL的产物香豆酰辅酶A/肉桂酰辅酶A会抑制途径中的TAL基因，因此将TAL和4CL划分为一个模块，将CHS和CHI划分为一个模块，欲通过强化下游模块，弱化上游模块来减轻这种反馈抑制；ii)菌体异源合成黄酮类骨架物质时，丙二酰辅酶A较低的含量通常限制了菌体内的黄酮产量，因此将丙二酰辅酶A合成途径(matB和matC)置于一个单独模块，通过改变此模块的代谢通量来寻找最优丙二酰辅酶A含量。由此将总个途径分为三个模块分别是:模块一由TAL和4CL组成；模块二为CHS和CHI组成；模块三为matB和matC组成。每个模块的代谢通量由质粒拷贝数和启动子的力度来决定，本系统用到的四个质粒分别为pACYCDuet-1(Novagen:71430),pCDFDuet-1(Novagen:71330),pETDuet-1(Novagen:71353)和pRSFDuet-1 (Novagen: 71363)，其中质粒拷贝数分别为10，20，40和100 ;启动子选为T7和Trc，其中T7的力度为5，Trc的力度为I。通过系统改变每个模块的质粒拷贝数和启动子力度从而改变模块的代谢通量，通过鉴定中间产物和最终产物的含量，来确定最优的模块组合。
[0035]如图1所示,最终找到最优的模块组合:模块一表达质粒为P⑶FDuet-1,启动子为Trc ;模块二表达质粒为pETDuet-Ι，启动子为T7 ;模块三表达质粒为pACYCDuet-Ι，启动子为T7。
[0036]实施例3含优化模块工程菌的构建
[0037]采用全基因合成方法获得途径所需要的六个基因，大小分别为2.1KbU.7Kb,1.5Kb,0.9Kb、1.5Kb、1.3Kb。分别利用酶切连接技术将TAL，4CL基因与经NcoI和Hindlll，NdeI和BlnI酶切后的质粒连接，将CHSjCHI基因与经NcoI和HindIILNdeI和BlnI酶切后的质粒连接，将matB和matC基因与经过EcoRI和Hindlll，NdeI和KpnI酶切后的质粒连接，由此得到三个共表达质粒 pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACYCD-matB-matC。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将三个共表达质粒以化学法转化Escherichia coli(BL21)感受态细胞。挑选能在含有100ug/mL的氨苄，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等三种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的三种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子，测序验证结果，表明六个途径基因已成功转入到Escherichiacoli(BL21)中。其中:
[0038]LB 培养基(g/L)
[0039]氯化钠10g, TryptonelOg, Yeast extract5g,固体培养基添加 20g 琼脂。
[0040]LB+氨苄、氯霉素、链霉素的抗性平板(g/L)[0041]LB+1OOmg氨苄、35mg氯霉素、50mg链霉素，固体培养基添加20g琼脂。
[0042]实施例4发酵生产柚皮素的方法
[0043]采用实施例3得到的基因工程菌为出发菌株，接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12_20h至菌株OD600达到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基和终浓度为ImM的IPTG，，30°C，250rpm条件下培养60h。
[0044]重组菌与转化空质粒的对照菌相比较，对照菌中没有检测出柚皮素的产量，而重组菌中柚皮素的产量达到90mg/L。
[0045]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一株以酪氨酸为底物合成柚皮素的基因工程菌，其特征在于，是在Escherichiacoli (BL21)中表达了柚皮素合成途径需要的关键酶系:酪氨酸脱氨酶TAL、4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL、查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CH1、丙二酸转运酶matC以及丙二酸吸收酶matBo
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述丙二酸转运的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码所述丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示，编码所述酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，编码所述4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，编码所述查尔酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，编码所述查尔酮异构酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述6个基因通过3个质粒进行共表达，所述3个质粒为:(I) P⑶FDuet-1携带编码酪氨酸脱氨酶TAL和4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL的基因，得到质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL，(2)pETDuet_l携带编码查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI的基因，得到质粒pET-PhCHS-MsCHI，(3) pACYCDuet_l携带编码丙二酸转运基因matC、丙二酸吸收酶的基因matB,得到质粒pACY⑶-matB-matC。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述PCDF-RgTAL-Pc4CL采用启动子Trc，拷贝数为20 ;所述pET-PhCHS-MsCHI采用启动子T7，拷贝数为40 ;所述pACYCDuet_l采用启动子T7，质粒拷贝数为10。
5.构建权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用全基因合成方法获得途径所需要的六个基因； (2)通过酶切连接构建得到三个共表达质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB-matC，测序验证后`，将三个共表达质粒以化学法转化E.coli(BL21)感受态细胞； (3)挑选能在含有100ug/mL的氨节，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素四种抗生素的LB平板上生长的菌落，使其在含上述的四种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR验证六个途径基因已成功转入到E.coli (BL21)中。
6.利用权利要求3所述基因工程菌发酵生产柚皮素的方法，其特征在于，是将构建得到的基因工程菌株接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37°C、250rpm条件下培养12-20h至菌株0D_达到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培养基及终浓度ImM的IPTG,30°C,250rpm 条件下培养 60h。
7.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于，MOPS培养基组成为(g/L):葡萄糖5，氯化铵4，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化铵5.1,硫酸铁0.03,硫酸钾0.5，氯化镁1.1,氯化钠29.2，微量元素IOml,自来水定容。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微量元素采用ATCCBAA-2326的配方。
【文档编号】C12N15/70GK103484420SQ201310482140
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】陈坚, 周景文, 吴俊俊, 堵国成 申请人:江南大学