花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用。本发明在花生中分离获得SOS家族基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ?NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本发明对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有指导作用。
【专利说明】花生抗盐基因AhS0S2、克隆方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体说，涉及克隆花生中抗盐的AhS0S2基因并利用其构建融合表达载体，进而通过转基因途径改变植物性状的方法及应用。
【背景技术】
[0002]盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，我国盐碱土地主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带。土壤盐害即盐胁迫，主要表现为渗透胁迫，通过破坏细胞的正常离子分布和动态平衡，干扰植物细胞内的各种代谢过程，最终造成植物的伤害甚至死亡，对作物的产量和品质均有重要的影响。然而，随着人口增加和耕地减少，地球表面大面积盐碱地资源的开发利用具有极其重要的现实意义。因为绝大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3%以下的土壤中，这极大的限制了植物在盐碱滩地上的生长。目前，对植物抗盐、抗逆机制的研究及培育作物抗逆新品种已成为广大植物学家和育种学家研究的主要任务之一。以围绕抗逆基因对植物在逆境环境下的作用为主的研究，已成为从系统水平上探索胁迫生物学和提高植物胁迫抗性和耐性的有效手段。
[0003]在盐胁迫条件下，大量的盐分进入植物细胞，造成Na+离子毒害和细胞失水，破坏了植物细胞中稳定的Na+、Cl—平衡，也影响K+的吸收和Ca2+等离子在胞内的分布，从而影响细胞内的生理调节、信号传导等一系列途径。盐害引起的渗透胁迫，以及由此产生的营养亏缺和次级氧化胁迫，还造成了植物细胞内活性氧的过量积累。大量的活性氧可引起细胞膜脂和蛋白质的过氧化，从而造成生物大分子损伤、代谢途径紊乱，导致植物生长停滞甚至死亡。
[0004]盐胁迫下，细胞内的离子平衡的调节对于植物的耐盐性十分重要。离子平衡的建立在细胞水平上主要包括两方面=Na+的外排和Na+的区隔化。Na+外排主要由细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白(如:S0Sl,Salt Overly Sensitivel)利用质子泵供能将细胞内的Na+排到胞外而完成。Na+的区隔化主要是液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(如:NHX1)起作用，通过质子泵水解ATP供能，将胞质中的Na+区隔化至液泡内。Na+的外排和Na+的区隔化减少了Na+在细胞内的积累，同时促进K+的高亲和性吸收，这对维持植物细胞内K+和Na+的稳态平衡，维持稳定的PH值和离子稳态起着重要的作用。
[0005]美国朱健康实验室最先从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现了参与介导盐胁迫下细胞内Na+的外排及向液泡内的区隔化的相关因子。通过快中子轰击(fast neutronbombardment)、T-DNA诱变以及化学突变(如EMS诱导)等方法，他们创制了大量的拟南芥突变植株，从中筛选并获得了 5组盐敏感突变体，并进一步鉴定了 5个相关基因，因以上基因均在同一信号通路中，故命名为SOS家族(Salt Overly Sensitive)，其成员即包括AtSOSU AtS0S2、AtS0S3、AtS0S4和AtS0S5。 之后该家族相关成员在其他物种中也均有报道。
[0006]其中S0S2类基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其N-末端催化位点与酵母SNFl激酶和哺乳动物的AMPK激酶非常相似，正常情况下，该基因在植物体内含量很低，但盐胁迫下，其在拟南芥根中表达量明显上调。植物在受到高盐胁迫时，会打破体内的离子平衡，Qiu等通过检测拟南芥突变植株与野生型植株细胞内Na+和H+含量，证明了SOS信号通路对于植物抗盐过程具有不可替代作用，S0S3是一个Ca2+感受器，能够激活体内的S0S2蛋白激酶，并与S0S2结合形成S0S3-S0S2蛋白激酶复合物，通过磷酸化激活SOSI，使细胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白发挥作用，将体内的Na+排出体外(Qiu QS，Guo Y, Dietrich MA, Schumaker KS, Zhu JK.Regulation of SOSI, a Plasma MembraneNa+/H+Exchanger in Arabidopsis thaliana, by S0S2and S0S3.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2002,99:8436-8441.)。Quan等通过质壁分离和GFP染色技术证明了 S0S3的同系物SCABP8/CBL10与S0S2蛋白激酶相互作用提高拟南芥芽组织的耐盐性，并且SCABP8与S0S2共同激活 SOSl 发挥作用(Ruidang Q, Huixin L, Imelda M, Yuguo Z, Wanhong C, YongqingY, Mei S，Shouyi C，Jose1 M.Pardo, and Yan G, SCABP8/CBL10, a Putative CalciumSensor,Interacts with the Protein Kinase S0S2to Protect Arabidopsis Shoots fromSalt Stress.The Plant Cell, 2007，19:1415-1431.)。[0007]目前已经从陆地棉、芥菜及大豆中得到了与拟南芥中的S0S2序列上同源、功能上相同或者相似的基因。这些研究结果表明S0S2基因在植物界中是广泛存在的，并且在不同的植物中，它们执行着相似或者相同的功能。拟南芥AtSOSl、AtS0S2和AtS0S3同时在拟南芥中表达显著提高了转基因植株的耐盐性，在酵母中，同时表达SOSl，S0S2和S0S3大大提高了酵母的耐盐性，其耐盐性比只表达其中一个蛋白有更加明显的提高，进一步证明SOSl依赖S0S2和S0S3的调节，以介导Na+外排，在植物耐盐中起到重要的作用。
[0008]花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油用兼食用作物,其产量和品质与人类生活密切相关。花生主要生长于干旱和半干旱地区，是一种较耐旱作物，能忍耐极低的叶片水势，叶片水势降到_45Pa时，植株仍能维持生命力。花生在应对恶劣环境中选择性的积累了胁迫抗性基因，然而对花生分子生物学研究进展却很有限，关于花生耐盐胁迫及其在离子稳态调节方面的研究则更少。虽然模式植物拟南芥中的SOS信号途径研究较清楚，但对该途径在其他物种如何参与抗盐、耐盐及相关机制的了解还较少。本发明在花生中分离获得SOS家族基因AhS0S2，并通过构建相应的植物表达载体转化水稻对基因抗盐及抗逆功能进行了验证，该方面工作的开展有助于加深对SOS途径及其在植物抗盐方面的认识和了解，为改良及培育植物抗盐及抗逆新品种提供理论依据。
【发明内容】
[0009]本发明提供了克隆花生中具有抗盐及抗逆能力的基因AhS0S2的方法，并通过构建植物表达载体，利用基因工程手段获得该基因的转基因植物材料，对基因生物学功能及其在植物抗盐、抗逆等方面的应用进行研究。同时通过构建该基因的原核表达载体，检测蛋白水平的表达情况，并通过在原核菌株中对该基因的功能进行分析，进一步验证了该基因在抗逆环境下发挥一定的作用，同时对获得的转基因水稻植株进行盐胁迫处理，初步对植株抗盐能力进行了分析，揭示该基因在植物抗逆过程中的作用。
[0010]本发明的技术方案是:花生抗盐基因AhS0S2，其核苷酸序列如SEQ N0.1所示，氨基酸序列如SEQ N0.2所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
[0011]花生抗盐基因AhS0S2的克隆方法，其特征是，首先提取花生叶片的RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得AhS0S2基因的全长序列。引物序列:
[0012]AhS0S21:5/ ~GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT~3' (SEQ N0.3)；
[0013]AhS0S22:5/ ~TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG~3; (SEQ N0.4)。
[0014]本发明对基因表达模式进行验证的荧光定量PCR表明，正常生长条件下，AhS0S2在花生的根、茎、叶中均有表达；但在盐(250mmol PNaCl)处理条件下，基因在花生幼苗的茎中表达量明显增强，表达量约是未经处理时的30倍；且基因对干旱处理也产生响应，经30%PEG6000模拟干旱处理后，基因在花生幼苗叶中表达量有较大程度的升高，显示基因表达受盐及干旱等胁迫条件的诱导，基因在参与植物抗盐及抗逆过程中可能发挥作用。
[0015]本发明还根据花生AhS0S2基因序列设计特异引物，利用PCR的方法扩增目的基因，经酶切及连接，将目的基因AhS0S2与PET28a载体成功连接，获得原核表达载体pET28a-AhS0S2,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中，经异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，获得预期大小的蛋白条带，证明该基因在蛋白水平完成了表达，并同时对基因原核蛋白表达系统进行了优化。
[0016]本发明同时利用斑点法对AhS0S2基因进行功能验证，将成功转入PET28a质粒和pET28a-AhS0S2重组质粒的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)经IPTG诱导后，在含NaCl的平板上进行点样，37°C倒置过夜培养，通过比较观察菌斑的数量及大小，进而对该基因的原核蛋白表达菌株的抗盐能力进行验证。
[0017]本发明还通过液体培养法检测AhS0S2基因的生长曲线，将成功转入PET28a质粒和PET28a-AhS0S2重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，在含有250mmol T1NaCl的LB中进行培养，每隔2h进 行取样，紫外分光光度计下测定OD6tltl的吸光值。结果显示，含有重组质粒的大肠杆菌比含有空载体的菌株生长速度快，经12h培养后，菌液浓度与含有空载体的菌株的菌液浓度的差值最大，显示含有AhS0S2基因的菌株具有一定的抗盐功能，该结果也是对前文中斑点法结果的补充和验证。
[0018]本发明还提供一个经人工改造的PCAMBIA1301P植物表达载体。经酶切及连接，将目的基因AhS0S2与pCAMBIA1301P构建融合表达载体，即获得植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhS0S2。进一步借助于基因工程手段，将该表达载体转化入受体材料水稻中，进而提高水稻的抗盐及抗逆能力。
[0019]本发明将筛选获得的转基因阳性水稻植株的T1代种子进行水培培养，待其长至三叶期时进行Ommol L_\ IOOmmol I/1和250mmol L—1不同浓度梯度的NaCl盐胁迫处理，观察幼苗长势和叶片生长情况，结果初步证明了该基因在水稻抗盐及抗胁迫过程中发挥作用。
[0020]本发明以花生为材料，克隆得到了 S0S2基因家族的一个重要基因AhS0S2，并对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有积极的指导作用。【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1:简并引物对AhS0S2序列的PCR扩增电泳结果；其中1、2和3分别表示AhS0S2在50°C、52°C和54°C不同解链温度下的PCR扩增产物，从图1中可以看出，其EST序列的长度为780bp ；
[0022]图2:AhS0S2全长序列扩增PCR电泳结果，其中1、2、3和4分别表示AhS0S2的PCR产物；
[0023]图3:荧光定量PCR分析AhS0S2基因的组织表达特性；
[0024]图4:荧光定量PCR对250mmol T1NaCl处理花生幼苗后基因AhS0S2的诱导表达模式分析；其中图A、B、C分别代表根、茎和叶；
[0025]图5:荧光定量PCR对30%PEG6000模拟干旱处理花生幼苗后基因AhS0S2的诱导表达模式分析；其中图A、B、C分别代表根、茎和叶；
[0026]图6:基因AhS0S2原核蛋白表达SDS-PAGE结果；其中I代表PET28a空载体诱导12h的电泳结果，2-8分别代表诱导时间为0、2、4、6、8、10、12h的电泳结果；
[0027]图7:不同浓度NaCl处理条件下，含有PET28a、PET28a_AhS0S2的菌株，在不同浓度条件下(10'10_4)，在LB平板上的菌斑生长结果比较；
[0028]图8:液体培养法，对含有空载体PET28a的菌株及含有重组质粒PET28a_AhS0S2的菌株在盐溶液(250mmol T1NaCl)中的生长曲线的测定结果；
[0029]图9:植物双元表达载体pCAMBIA1301P_AhS0S2的构建过程示意图；
[0030]图10:利用⑶S组织化 学染色法，对获得的转基因水稻的组织化学鉴定结果，其中CK为对照，T1代表转入AhS0S2基因的转基因植株，经⑶S染色后显蓝色；
[0031]图11:通过PCR分子检测法，对AhS0S2转基因水稻的鉴定，其中泳道+为阳性对照，-为阴性对照，泳道1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15经PCR获得目的条带，与阳性对照一致，为转基因植株；
[0032]图12:AhS0S2转基因水稻抗盐能力的初步分析，CK为盐胁迫处理3d后的对照水稻幼苗，从左至右分别为O、100和250mmol -1不同浓度NaCl胁迫处理J1为盐胁迫处理3d后的转AhS0S2基因水稻幼苗，从左至右分别为O、100和250mmol L—1不同浓度NaCl胁迫处理。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。
[0034]实施例1:花生中AhS0S2基因的克隆
[0035]参考已发表的拟南芥S0S2基因序列，结合搜索NCBI数据库，获得不同物种中S0S2基因，以基因的氨基酸序列为基础设计简并引物，PCR扩增，获得AhS0S2的EST序列(图1)。在获得的EST序列的基础上,分别设计5' race和3' race特异性引物,按照试剂盒(TaKaRa)说明书进行AhS0S2的5'末端和3'末端的扩增，利用CAP3软件进行ESTs片段拼接，得到AhS0S2序列。以提取花生叶片RNA反转录的单链cDNA为模版，根据电子拼接的AhS0S2全长序列设计基因特异性引物AhS0S21和AhS0S22，PCR反应体系为(20 μ I):PCR πι?χΙΟμ 1、上、下游引物各 0.5 μ 1、cDNA2 μ 1、ddH207 μ 1，PCR 反应步骤:94°C 3min ；94°C 30s,56°C 1.5min、72°C 40s、共 35 个循环；最后 72°C IOmin,获得一个全长为 1462bp 的AhS0S2基因的全长序列(图2)，其核苷酸序列如SEQ N0.1所示，氨基酸序列如SEQ N0.2所示。该片段全长为1462bp，包含1341bp的开放阅读框(ORF)，生物信息学分析显示，该基因编码446个氨基酸，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。所述特异性引物为:
[0036]AhS0S21:5/ ~GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT~3' (SEQ N0.3)；
[0037]AhS0S22:5/ ~TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG~3; (SEQ N0.4)。
[0038]实施例2:基因AhS0S2在花生不同组织的表达模式及受高盐、干旱胁迫后的诱导表达模式分析
[0039]一、AhS0S2在花生不同组织中的表达模式分析
[0040]1.植物中RNA的提取
[0041](I)参照SDS法，向1.5ml离心管中加入0.5ml SDS缓冲液、0.3ml tris平衡酚，
0.25ml氯仿、0.1ml巯基乙醇。植物材料研磨后(充分研磨)迅速转移入离心管中(约0.1g),涡旋震荡5min ；
[0042](2) 12000rpm离心15min，吸取上清，(注意不能吸进中间层，否则DNA污染严重)转移上清液至预先加有等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1，下同)的离心管中，涡旋震荡5min ；
[0043](3) 12000rpm 离心 15min ；
[0044](4)转移上清至新管，加入5mol L—1的LiCl至终浓度2.5mol L—1，混匀，4°C放置2h或过夜，12000rpm离心15min ；
[0045](5)弃上清，絮状沉淀为DNA，去除。沉淀用70%乙醇洗涤，超净台吹干，加30-50 μ IDEPC-H2O溶解沉淀(不易溶解，适当延长时间吹打使之彻底溶解)；
[0046](6)在EP管中配制下列反应液:
[0047]
【权利要求】
1.花生抗盐基因AhS0S2，其核苷酸序列如SEQN0.1所述。
2.权利要求1所述的花生抗盐基因AhS0S2的克隆方法，其特征是，首先提取花生叶片的RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得AhS0S2基因的全长序列，其引物序列为:
AhS0S21:5/ -GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3'
AhS0S22:5/ -TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3/ 。
3.权利要求1所述的花生抗盐基因AhS0S2在提高作物的抗逆性方面的应用。
4.一种含有权利要求1所述的花生抗盐基因AhS0S2的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为重组原核表达载体pET28a-AhS0S2。
6.如权利要求4所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为植物双元表达载体 pCAMBIA1301P-AhS0S2，所述 pCAMBIA1301P 是将 CAMV35S promoter 序列插入到PCAMBIA1301载体的多克隆位点EcoR I和Kpn I之间，改造得到的植物表达载体。
7.一种提高作物抗盐性的方法，其特征是，权利要求6的为植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhS0S2借助于基因工程手段介导作物遗传转化，获得转基因植株。
【文档编号】C12N15/82GK103468724SQ201310470939
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】刘炜, 张国嘉, 王庆国, 李臻 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心