提高cik细胞对癌细胞的杀伤作用的方法

提高cik细胞对癌细胞的杀伤作用的方法
【专利摘要】本发明涉及医疗领域，具体而言，涉及提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法。该提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，具体包括以下步骤：CIK细胞诱导的过程中，加入CD3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素-2、干扰素IFN-γ以及白细胞介素-24。本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法提高了效靶比例，促进了对肿瘤细胞的杀伤活性。
【专利说明】提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗领域，具体而言，涉及提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法。【背景技术】
[0002]细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killer cells, CIK细胞)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同诱导而获得的一群异质细胞。大量研究表明CIK细胞是一种新型、高效、具有广谱杀瘤活性的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性免疫效应细胞，在肿瘤免疫治疗中显露出巨大的应用价值，具有比LAK、CTL、TIL更强的增殖能力和细胞毒性，且无MHC限制性，因而成为近十年肿瘤生物治疗的研究热点。
[0003]CIK细胞的活化技术通常采用⑶3单克隆抗体，白细胞介素-1，白细胞介素-2以及干扰素INF- 进行活化和扩增，细胞扩增效果不甚满意，加之很多单位为降低培养成本致细胞培养时间短，个别报道培养时间仅为2-3天，因此获得的细胞数量有限，效靶(CIK:癌细胞)比例低，难以满足临床治疗的需要。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，以解决上述问题。
[0005]在本发明的实施例中提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，具体包括以下步骤:
[0006]CIK细胞诱导的过程中，加入⑶`3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素_2、干扰素IFN-Y以及白细胞介素-24。
`[0007]本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法中，其中的CD3单克隆抗体和IFN- Y是每个方案的必选，CD3单克隆抗体起到丝裂原活性作用，可与T细胞表面CD3交联，诱导其活化；干扰素IFN-Y可诱导白细胞介素-1等因子的合成。不同方案的主要差别在于白介素的不同，目前，研究者都在致力于提高CIK杀伤肿瘤细胞的活性，有的加入白细胞介素-7或白细胞介素-12或白细胞介素-15等，也有应用基因改造和单克隆抗体进行细胞修饰的报道。本发明中，在CIK诱导的过程中加入了白细胞介素-24，对传统方法加以改进。
[0008]白细胞介素-24 (interleukin-24，IL-24)是近些年免疫学领域研究较多细胞因子，具有多种生物学活性，具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。
[0009]本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法促进了 CIK细胞的快速增值，一般在培养两周左右细胞总量可达到IxIOki以上，为临床治疗提供了比较充足的效应细胞，提高了效靶比例，促进了对肿瘤细胞的杀伤活性。
[0010]同时由于白细胞介素-24促进了细胞的增值，可在一定程度上减少培养时间，相对减少了患者的等待时间，此举为CIK细胞抗癌的临床应用提供了实验依据。【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1.为在光镜下观察的使用本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法在细胞诱导六天后CIK细胞镜下的观察图A ；
[0012]图2.为在光镜下观察的使用本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法在细胞诱导数天后，CIK细胞镜下的观察图B ；
[0013]图3A为使用加IL-24的培养组诱导CIK细胞的CIK细胞增值率的变化图；
[0014]图3B为未加IL-24的培养组诱导CIK细胞的CIK细胞增值率的变化图；
[0015]图4.诱导20天时，未加IL-24的培养组的细胞表型⑶3+、⑶56+的检测结果；
[0016]图5.诱导20天时，加IL-24的培养组的细胞表型⑶3+、⑶56+的检测结果；
[0017]图6.光学显微镜下观察CIK细胞杀伤形态学观察的观察图；
[0018]图7.扫描电镜下看到的正常的肿瘤细胞的形态图；
[0019]图8.扫描电镜下细胞看到的杀伤状态下CIK细胞围绕IfepG2，与肿瘤细胞接触的形态图；
[0020]图9.部分CIK细胞进入肿瘤细胞被肿瘤细胞的微绒毛包裹的形态图；
[0021]图10.扫描电镜下看到的部分肿瘤细胞已经坏死崩解的形态图；
[0022]图11.透射电镜下看到的肿瘤细胞被很多活性淋巴细胞包围的形态图；
[0023]图12.透射电镜下看到的凋亡的肿瘤细胞，部分肿瘤细胞已进入肿瘤细胞内的形态图；
[0024]图13.透射电镜下看到的加IL-24的培养组的坏死肿瘤细胞明显增多，核完全固缩的形态图；
[0025]图14.透射电镜下看到的胞质中充满了大量的脂滴颗粒，线粒体嵴性肿胀，空泡变性，部分细胞核完全固缩，核膜结构不清，细胞内膜结构完全溶解的形态图。
【具体实施方式】
[0026]下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0027]实施例1:
[0028]提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，具体包括以下步骤:
[0029]CIK细胞诱导的过程中，加入⑶3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素_2、干扰素IFN-Y以及白细胞介素-24。
[0030]本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法中，其中的CD3单克隆抗体和IFN- Y是每个方案的必选，CD3单克隆抗体起到丝裂原活性作用，可与T细胞表面CD3交联，诱导其活化；干扰素IFN-Y可诱导`白细胞介素-1等因子的合成。不同方案的主要差别在于白介素的不同，目前，研究者都在致力于提高CIK杀伤肿瘤细胞的活性，有的加入白细胞介素-7或白细胞介素-12或白细胞介素-15等，也有应用基因改造和单克隆抗体进行细胞修饰的报道。本发明中，在CIK诱导的过程中加入了白细胞介素-24，对传统方法加以改进。
[0031]白细胞介素-24 (interleukin-24，IL-24)是近些年免疫学领域研究较多细胞因子，具有多种生物学活性，具有显著的抑制肿瘤的作用，能选择性地抑制多种肿瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。
[0032]本发明提供的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法促进了 CIK细胞的快速增值，一般在培养两周左右细胞总量可达到IxIOki以上，为临床治疗提供了比较充足的效应细胞，提高了效靶比例，促进了对肿瘤细胞的杀伤活性。
[0033]同时由于白细胞介素-24促进了细胞的增值，可在一定程度上减少培养时间，相对减少了患者的等待时间，此举为CIK细胞抗癌的临床应用提供了实验依据。
[0034]实施例2:
[0035]基于上述实施例，本发明还做了如下改进:
[0036]CIK细胞诱导的过程中，加入⑶3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素-2以及干扰素INF-Y时，具体按照以下顺序加入:
[0037]在CIK细胞中加入⑶3单克隆抗体；
[0038]加入干扰素IFN- Y和白细胞介素-24 ；
[0039]24小时后再加入白细胞介素-1，白细胞介素_2。
[0040]其中，24小时后再加入白细胞介素-1，白细胞介素-2的步骤之后还包括:
[0041]每次传代扩增时，再次补充白细胞介素-2、干扰素INF-Y和白细胞介素-24。
[0042]所述传代至少包括5次。`
[0043]其中，白细胞介素-24加`入量的多少根据CIK细胞的量的多少加入，为了提高诱导效果，需要保持加入的白细胞介素-24在培养液中的浓度为1000IU/mL，通常CIK细胞的浓度保持在106IU/mL，其余的CD3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素_2以及干扰素INF- 的加入量和通常的使用量相同。
[0044]使用本发明提供的实验组和传统对照组的试验对比如下:
[0045]材料和方法
[0046]1.1材料H印G2肿瘤细胞株由本中心传代保存，干扰素(IFN-Y )、白细胞介素_1(IL-1)均为美国Peprotech公司产品，⑶3为北京天广实生物技术有限公司产品，白细胞介素-2 (IL-2)购自江苏金丝利药业有限公司，白细胞介素-24 (IL-24)购自R & D systems。
[0047]Percp结合的鼠抗人CD3、FITC结合的鼠抗人CD4、PE结合的鼠抗人CD8、PE结合的鼠抗人CD56、CD3均为美国BD公司产品，胎牛血清为杭州四季青生物责任有限公司产品，GT-T551培养基购自日本宝日医生物公司，健康人外周血由本中心志愿者提供，淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，MTT为北京索莱宝科技有限公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品，酶标分光光度计为BioRAU，450型，美国制造。荧光倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品。
[0048]1.2 方法
[0049]1.2.1
[0050]实验组:加IL-24培养组的CIK细胞的诱导方法具体包括如下步骤:
[0051]1.单采机采供者自体外周血单个核细胞，约40_50mL/袋，抗凝；
[0052]2.将人淋巴细胞分离液置50mL离心管底部，加入等量患者血样，其中人淋巴细胞分离液的加入体积和患者血样的加入体积比为1:1，人淋巴细胞在分离时，离心速度为2000rpm,离心时间 20min ；
[0053]3.小心吸取白环层单个核淋巴细胞，置50mL离心管内，加入适量培养液和抗生素；
[0054]4.加入培养液0.5mL,吹打混匀，调节细胞浓度；
[0055]5.将已包被⑶3单克隆抗体lOOng/mL的加入细胞瓶内，同时加入自身灭活血浆10%,再加入干扰素 INF- Y 1000U/mL 和 IL-24, 1000IU/mL,培养 24h ；
[0056]6.观察细胞，加入 IL-1 a 100IU/mL,补加含 IL_21000IU/mL 的 GT-T551 培养基IOmL, IL-24, 1000IU/mL ；
[0057]7.24h后视细胞扩增情况用培养基将细胞适当稀释，根据细胞具体数量培养于培养瓶或培养袋内；
[0058]8.以后每2-3天传代扩增培养一次。同时补充IL-2、INF-Y和IL-24，1000IU/
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[0059]对照组:未加IL-24培养组的CIK细胞的诱导方法具体包括如下步骤:
[0060]1.单采机采供者自体外周血单个核细胞，约40_50mL/袋，抗凝；
`[0061]2.将人淋巴细胞分离液置50mL离心管底部`，加入等量患者血样，其中人淋巴细胞分离液的加入体积和患者血样的加入体积比为1:1，人淋巴细胞在分离时，离心速度为2000rpm,离心时间 20min ；
[0062]3.小心吸取白环层单个核淋巴细胞，置50mL离心管内，加入适量培养液和抗生素；
[0063]4.加入培养液0.5mL,吹打混匀，调节细胞浓度；
[0064]5.将已包被⑶3单克隆抗体lOOng/mL的加入细胞瓶内，同时加入自身灭活血浆10%,再加入干扰素INF- Y 1000U/mL培养24h ；
[0065]6.观察细胞，加入 IL-1a 100U/mL,补加含 IL_21000IU/mL 的 GT-T551 培养基IOmL ；
[0066]7.24h后视细胞扩增情况用培养基将细胞适当稀释，根据细胞具体数量培养于培养瓶或培养袋内；
[0067]8.以后每2-3天传代扩增培养一次。同时补充IL-2和INF- Y。
[0068]1.2.2CIK细胞增殖活性的测定
[0069]将两种方法培养的CIK细胞以5X IOVmL置于培养瓶中，每三天补充新鲜培养液和细胞因子并用胎盘蓝计数细胞总数计算平均值。
[0070]1.2.3CIK细胞毒活性的测定
[0071]取对数生长期的肿瘤细胞，调整细胞浓度分别为lX105/mL、5X104/mL、2.5X IO4/mL，每孔IOOul铺于96孔板中，每组设四个复孔，置37°C，5 % CO2孵箱内培养，24h后将效应细胞CIK浓度调整为IXlOfVmL与靶细胞浓度分别为10:1、20:1、40:1加入96孔板中，另设单独靶细胞组(靶细胞+培养液)和单独效应细胞组(效应细胞+培养液)为阴性对照组，作用48h后每孔加入MTT20ul/孔，继续培养4h~6h，然后翻板弃去上清液，每孔加入IOOul DMS0,震荡几分钟，等沉淀全部溶解后用酶标仪(波长570nm)测定吸光度A值，计算杀伤率(％)={1-[A (效 + 靶)-A (效)]/A (IE)} X 100% ο
[0072]1.2.4CIK细胞表型测定
[0073]取2X 106/mL细胞于流式专用管中，相应抗体混匀避光放置20min，用PBS洗两遍，1500rpm离心5min, I %甲醒固定后待上机测定。[0074]两组细胞(未加IL-24对照组和加IL-24实验组分别于8、15、20天检测0)3+、0)4+、⑶8+、⑶3+、⑶56+细胞膜标志。
[0075]1.2.5光镜下细胞形态观察
[0076]在诱导过程中每天于光镜下观察细胞形态变化，与肿瘤细胞共同培养，观察两者形态上的差别。
[0077]1.2.6扫描电镜和透射电镜标本的制备参考文献本实验室方法。
[0078]统计学处理采用SPSS10.0数据分析软件，所有数据用mean±SD表示，采用方差分析和配对t检验统计学分析，P < 0.05为有统计学意义。
[0079]2试验结果
[0080]2.1诱导过程中细胞形态的变化
[0081]刚提取的单个核细胞大小较均一，折光性较一致，而经3天培养诱导后的活化细胞中，部分细胞明显增大，可见很多小集落开始生成，胞核密度加强，细胞异型性较明显，细胞核中可见多量颗粒，为大颗粒淋巴细胞(LGL)。
[0082]如图1所示，第六天观察细胞集落明显增多而且增大，在肉眼下即可以看到白色的斑点集落(见图1A)，如图2所示，镜下大集落成黑团，看不清细胞，但围绕集落周围有很多的细胞游出，细胞饱满折光性好，大小形态各异(见图1B)。
[0083]A:诱导六天后CIK细胞镜下观察，细胞呈异型性，并有集落生成(X400)；
[0084]B:数天后细胞快速扩增，`呈叠层式生长，透光度减弱，光镜下可见数个大集落(X200)。
[0085]如图3A和图3B所示，横坐标为培养的天数，纵坐标为CIK细胞的总数。加IL-24培养组和未加IL-24培养组均在培养3天时开始增殖，在培养15天时进入快速增殖期，21天以后增殖趋于缓慢进入平台期，加IL-24培养组增殖略快于未加IL-24培养组(图2)，经统计学配对t检验分析，t > 3.055, P < 0.05,两者有显著差异，
[0086]结果提示IL-24可在一定程度上促进CIK细胞增殖。
[0087]2.3CIK细胞的杀伤活性
[0088]表1两种CIK细胞对肿瘤细胞的抑制率(mean土SD)
【权利要求】
1.提高CK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: CIK细胞诱导的过程中，加入CD3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素-2、干扰素IFN-以及白细胞介素-24。
2.根据权利要求1所述的提高CK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，其特征在于， 所述CIK细胞诱导的过程中，加入CD3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素-2以及干扰素INF-时，具体包括以下加入顺序: 在CIK细胞中加入CD3单克隆抗体； 加入干扰素IFN-和白细胞介素-24 ； 24小时后再加入白细胞介素-1，白细胞介素_2。
3.根据权利要求2所述的提高CK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，其特征在于， 所述24小时后再加入白细胞介素-1，白细胞介素-2的步骤之后还包括: 每次传代扩增时，补充白细胞介素-2、干扰素NF-和白细胞介素-24。
4.根据权利要求3 所述的提高CIK细胞对癌细胞的杀伤作用的方法，其特征在于， 所述传代至少包括 5次。
【文档编号】C12N5/078GK103468640SQ201310454356
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】王志华 申请人:合肥凤凰肿瘤医院