一种快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其包括以下操作步骤：将甘薯主茎或侧枝修剪成带有3～4片展叶的茎枝，室温条件下预培养2～3天；待茎枝长出须根后，将茎枝平置，在茎枝中间位置且两节之间，用移液器枪头扎1个小洞且不穿透茎枝，然后将茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，并将扎有小洞的一侧朝上，吸取15～25μL1×108cfu/mL的茎腐病病原菌菌悬液，注入小洞内接种培养；培养20～24h后，观察病害情况并对甘薯茎枝进行病害等级鉴定。本发明具有操作简单快速、实用性强、可操作性强和鉴定结果重复性和可靠性较高优点，对于筛选甘薯抗茎腐病优质种质资源具有潜在的社会经济意义。
【专利说明】一种快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法
【技术领域】[0001]本发明涉及对甘薯茎腐病的抗病性进行快速鉴定的方法，尤其是对甘薯抗茎腐病种质资源和育种材料的筛选方法，属于植物保护【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甘薯(Ipomoea batatas (L.)Lam)是世界粮食、能源和工业原料作物之一，我国是世界上最大的甘薯生产国家，其种植面积仅次于水稻、小麦和玉米而居第四位。近年随着甘薯市场需求旺盛，农民种植和引进新品种的积极性增加，种苗或种薯在国家和地区间流动频繁，加之无序种植，随之而来在我国甘薯主产区出现了一些新病害或传统病害重新爆发流行。
[0003]甘薯茎腐病首先在美国乔治亚州被发现，世界上其他国家均未见报道。2006年在我国广东省东部地区甘薯产区首先发现此病害，为我国甘薯新病害。该病害传播快，危害严重，已在广东省的广州、惠州、河源、湛江、增城、海丰、博罗、惠东等多个市县爆发，病情逐年加重，可能已成为广东省发病面积最大、危害最重的甘薯病害。发病严重的田块，成眭的薯苗死亡，甚至全田的薯苗死亡，颗粒无收，严重影响甘薯的生产和薯农的利益。甘薯茎腐病的病原菌根据新的分类系统属于D.dadantii，是我国三类检疫性有害生物之一，该病菌以种薯或种苗传带为主要传播方式。目前世界上尚无针对甘薯茎腐病的有效防治方法。
[0004]众所周知，抗病品种的使用是最为经济有效环保的防治方法，也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品种的选育过程中，需要进行大量的抗病性鉴定试验，而建立完善的病害抗性鉴定评价方法是进行此项研究的重要前提。因此，一种操作简单、快速准确的接种鉴定方法是研究中不可或缺的。目前，植物病原细菌的接种方法较多，如剪叶法、浸(蘸)根法、针刺法、喷雾法、摩擦法、注射法、灌注土壤法等。这些方法因细菌病害和寄主不同，导致作用效果也不同。
[0005]甘薯茎腐病的研究首先在美国报道。Schaad (1977)等利用柯赫氏法则采用注射接种法对病原菌进行了验证，确认了病原菌为菊欧文氏菌(Schaad N W，and Brenner D.A bacterial wilt and root rot of sweet potato caused by Erwinia chrysanthem1.Phytopathology, 1977，67:302-308)。Clark 等(1989)利用菊欧文氏菌悬液涂于薯块切片表面进行接种，结果表明甘薯块根接种病原菌6天或者更长时间后，品种间甘薯块根抗性差异显著；另外该接种方法与针剌接种甘薯茎枝的抗性反应无相关性(Clark，C A., Wilder-Ayersj J A., and Duarte, V.Resistance of Sweet potato to Bacterial Root and Stem Rot Caused by Erwinia chrysanthem1.Plant Disease, 1989，73:984-987)。在我国甘薯茎腐病属于新病害，对此病害的研究较少，对甘薯茎腐病抗性方法的鉴定更是没有。发明人尝试用美国学者在甘薯茎腐病致病性鉴定所用的针剌法和薯块切片接菌法以及已报道诸如剪叶法、喷雾法等几种常用细菌病害接种方法，发现这些接种方法得到的致病甘薯的发病症状不稳定，接菌量很难保证一致，不适合用于甘薯茎腐病的大规模接种抗性鉴定。因此，建立一种操作简单、发病迅速、效果稳定的接种鉴定方法对抗茎腐病甘薯种质资源和育种材料的筛选显得尤为重要。
【发明内容】
[0006]针对甘薯茎腐病抗病育种的特点和现有甘薯茎腐病抗性接种鉴定技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、准确、可应用于大样本量鉴定的甘薯茎腐病抗性鉴定方法。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0008]一种快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，包括以下步骤:
[0009](I)茎枝的处理与预培养:取生长正常、整齐、无病虫害的甘薯主茎或侧枝，用无菌手术刀将甘薯主茎或侧枝修剪成带有3~4片展叶的茎枝，剪后用无菌水洗去剪口处流出的汁液；将已修剪清洗的茎枝放入灭菌广口瓶中进行预培养，灭菌广口瓶装有占其体积 1/3的蒸馏水或无菌水，室温条件下培养2~3天；
[0010](2)茎腐病病原菌菌悬液的制备:将甘薯茎腐病病原菌菌株H12接种于改良营养琼脂培养基中，于28°C划线培养40~48h后，用无菌水配成浓度为I X 108Cfu/mL的茎腐病病原菌菌悬液；
[0011](3)茎枝的接种培养:待茎枝长出须根后，将茎枝平置，在茎枝中间位置且两节之间，用移液器的枪头扎I个小洞且不穿透茎枝，然后将茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，并且将扎有小洞的一侧朝上，吸取15~25 步骤(2)制得的菌悬液，注入茎枝小洞内进行接种，以无菌水作为空白对照，接种后将塑料盒盖好密封，置于30°C的光照培养箱内，培养20~24h;
[0012](4)病害症状观察与等级鉴定:培养20~24h后，观察病害情况，并对甘薯茎枝进行病害等级鉴定。
[0013]本发明的甘薯茎腐病病原菌菌株H12来源于广东省甘薯茎腐病病样(黄立飞，罗忠霞，房伯平，等.我国甘薯新病害茎腐病的研究初报.植物病理学报.2011，41 (I ):18-23.)。
[0014]优选的，步骤(1)中所述茎枝是从甘薯叶节下切断，所述茎枝的长度为12~15cm。
[0015]优选的，所述步骤(2)中吸取20 步骤(2)制得的菌悬液，注入茎枝小洞内进行接种。
[0016]优选的，所述步骤(2)中茎枝接种后置于30°C的光照培养箱内，培养24h。
[0017]优选的，所述改良营养琼脂培养基的组成包括蛋白胨5g/L，蔗糖10g/L，牛肉膏 3g/L，酵母浸膏lg/L和琼脂15g/L，所述改良营养琼脂培养基的pH值为7.0~7.2。
[0018]作为本发明的进一步技术方案，步骤(4)中将甘薯的发病程度分为I~5级，其中 1-无症状，健康；2_小洞出现黑色腐烂，但腐烂小于Icm ；3-腐烂大于等于Icm小于2cm，且腐烂没有通过任何一个叶节；4_腐烂长度大于等于2cm小于3cm或者腐烂通过任何一个叶节；5_腐烂长度大于3cm或腐烂通过2个叶节；以甘薯的发病程度作为病害评价标准鉴定甘薯品种的抗病性，发病程度=5为高度感病品种,3 <发病程度< 5为感病品种；1 <发病程度< 3为抗病品种。
[0019]相比现有技术，本发明的有益效果在于:
[0020](I)实用性、可操作性强:本发明可以直接用于甘薯茎腐病抗病育种中抗性鉴定试验和甘薯抗茎腐病种质资源的筛选；[0021](2)操作简单快速:病原菌接种浓度均一，接种量一致，测定较为简单，适合进行大样本量的试验；接种后甘薯显症时间短和鉴定时间短，接种病原细菌在20~24h后可见到显著的病害症状，在3~5天内就可以完成整个接种鉴定过程，大大减轻了病害抗性鉴定的工作强度；
[0022](3)鉴定结果具有较好的重复性和可靠性。通过实施例证实，不同鉴定批次不同重复间的鉴定结果稳定，误差较小。
[0023]综上所述，本发明作为甘薯茎腐病抗性鉴定的新方法，在环境可控的条件下，通过甘薯茎枝将扎洞接种定量的病原菌，能够快速有效地筛选甘薯抗病种质资源和育种材料， 提高甘薯茎腐病育种的效率；可以用于甘薯种质资源抗茎腐病的鉴定、甘薯抗茎腐病育种和分离病菌的致病性检测等试验，对于丰富甘薯病原细菌的接种方法具有积极意义；同时， 对于筛选甘薯抗茎腐病优质种质资源具有潜在的社会经济意义。
【具体实施方式】
[0024]实验材料:“国家广州甘薯资源圃”保存的98份甘薯种质资源。
[0025]实验方法:对“国家广州甘薯资源圃”保存的98份甘薯种质资源(具体见表1)进行了甘薯茎腐病抗性鉴定，根据甘薯的发病程度，将这些甘薯种质资源分为高度感病品种、 感病品种、抗病品种。
[0026]实验步骤:(I)茎枝的处理与预培养:从甘薯叶节下取生长正常、整齐、无病虫害的甘薯主茎或侧枝，用无菌手术刀将甘薯主茎或侧枝修剪成带有3~4片展叶的茎枝，茎枝的长度为12~15cm，剪后用清水洗去剪口处流出的汁液；将已修剪清洗的茎枝放入灭菌广口瓶中进行预培养，灭菌广口瓶装有占其体积1/3的蒸馏水或无菌水，室温条件下培养2~ 3天；
[0027](2)茎腐病病原菌菌悬液的制备:将甘薯茎腐病病原菌菌株H12接种于改良营养琼脂培养基中，改良营养琼脂培养基的组成包括蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L和琼脂15g/L，pH 值为7.0~7.2，于28°C划线培养48h后，用无菌水配成浓度为I X 108cfu/mL的茎腐病病原菌菌悬液；
[0028](3)茎枝的接种培养:待茎枝长出须根后，将茎枝平置，在茎枝中间位置且两节之间，用移液器枪头扎I个小洞且不能穿透茎枝，然后将茎枝平置于铺有浸透`无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，并且将扎有小洞的一侧朝上，吸取20 y L步骤(2)制得的菌悬液，注入茎枝小洞内进行接种，以无菌水作为空白对照，接种后将塑料盒盖好密封，置于30°C的光照培养箱内，培养24h ；
[0029](4)病害症状观察与等级鉴定:培养24h后，观察病害情况，并对甘薯茎枝进行病害等级鉴定。将甘薯的发病程度分为I~5级，其中I一无症状，健康；2—小洞出现黑色腐烂，但腐烂小于Icm ;3—腐烂大于等于Icm小于2cm，且腐烂没有通过任何一个叶节；4一腐烂长度大于等于2cm小于3cm或者腐烂通过任何一个叶节；5—腐烂长度大于3cm或腐烂通过2个叶节；以甘薯的发病程度作为病害评价标准鉴定甘薯品种的抗病性，发病程度=5为高度感病品种，3 <发病程度< 5为感病品种；1 <发病程度< 3为抗病品种。
[0030]实验结果与分析:本实施例对98份甘薯种质资源做了甘薯茎腐病的室内接种鉴定，具体抗性鉴定结果见表1，其中63份甘薯种质资源鉴定为高感，19份甘薯种质资源鉴定为中感，16份甘薯资源为抗病。为了保证研究结果的准确性，有必要对筛选到的抗性资源进一步田间鉴定观察，通过田间鉴定结果发现，本发明的方法鉴定的结果与田间鉴定结果接近，两者的误差很小。
[0031]表1资源的具体抗病型鉴定结果
[0032]
【权利要求】
1.一种快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)茎枝的处理与预培养:取生长正常、整齐、无病虫害的甘薯主茎或侧枝，用无菌手术刀将甘薯主茎或侧枝修剪成带有3~4片展叶的茎枝，剪后用无菌水洗去剪口处流出的汁液；将已修剪清洗的茎枝放入灭菌广口瓶中进行预培养，灭菌广口瓶装有占其体积1/3的蒸馏水或无菌水，室温条件下培养2~3天；(2)茎腐病病原菌菌悬液的制备:将甘薯茎腐病病原菌菌株H12接种于改良营养琼脂培养基中，于28 1:划线培养40~48 h后，用无菌水配成浓度为IXlO8 cfu/mL的茎腐病病原菌菌悬液；(3)茎枝的接种培养:待茎枝长出须根后，将茎枝平置，在茎枝中间位置且两节之间，用移液器的枪头扎I个小洞且不穿透茎枝，然后将茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，并且将扎有小洞的一侧朝上，吸取15~25 y L步骤(2)制得的菌悬液，注入茎枝小洞内进行接种，以无菌水作为空白对照，接种后将塑料盒盖好密封，置于30 °C的光照培养箱内，培养20~24 h ；(4)病害症状观察与等级鉴定:培养20~24h后，观察病害情况，并对甘薯茎枝进行病害等级鉴定。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于:步骤(1)中所述茎枝是从甘薯叶节下切断，所述茎枝的长度为12~15 cm。
3.根据权利要求1所述的快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于:所述步骤(2) 中吸取20 y L步骤(2)制得的菌悬液，注入茎枝小洞内进行接种。
4.根据权利要求1所述的快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于:所述步骤(2) 中莖枝接种后置于30 °C的光照培养箱内，培养24 ho
5.根据权利要求1所述的快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于:所述改良营养琼脂培养基的组成包括蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母浸膏lg/L和琼脂 15 g/L，所述改良营养琼脂培养基的pH值为7.0~7.2。
6.根据权利要求1所述的快速鉴定甘薯茎腐病抗性的方法，其特征在于:步骤(4)中将甘薯的发病程度分为I~5级，其中I一无症状，健康；2—小洞出现黑色腐烂，但腐烂小于I cm ;3—腐烂大于等于I cm小于2 cm，且腐烂没有通过任何一个叶节；4一腐烂长度大于等于2 cm小于3 cm或者腐烂通过任何一个叶节；5—腐烂长度大于3 cm或腐烂通过2个叶节；以甘薯的发病程度作为病害评价标准鉴定甘薯品种的抗病性，发病程度=5为高度感病品种，3 <发病程度< 5为感病品种；1 <发病程度< 3为抗病品种。
【文档编号】C12R1/645GK103555813SQ201310446213
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】黄立飞, 房伯平, 陈景益, 张雄坚, 李育军, 王章英, 罗忠霞, 黄实辉, 陈新亮 申请人:广东省农业科学院作物研究所