构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法

构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步骤：（1）制备同源重组载体：（2）ES细胞打靶及筛选；（3）重组干细胞PCR鉴定；（4）嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊胚腔注射获得嵌合体子代；（5）F1代杂合小鼠Kv1.3+/-繁育。此外，本发明还公开了用于构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的PCR引物对。
【专利说明】构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kv1.3基因敲除小鼠 模型的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物和医学实验模型的制备技术和细胞构建领域。涉及一种构建与心 肌保护相关的线粒体钾通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法。

【背景技术】
[0002] 与其它器官相比，缺血/再灌注（I/R)对心脏产生的损伤更迅速更严重。心肌细 胞更易出现自由基增多和供能障碍。线粒体早期即出现明显损伤，显微镜下见心肌、冠脉平 滑肌和内皮细胞病变，尤其是线粒体病变。表现为无复流(器官水平的血管痉挛）和心脏失 功。纵观已知研究结果，线粒体供能障碍、钙钾异常导致凋亡启动和正反馈甚至结构破坏是 主要环节。目前钾通道与心脏保护关系开始成为研究热点。国内外研究发现K ATP钾通道在 缺血预处理中发挥作用，与心肌保护的关系是肯定的。在我们前期的研究中也发现，阿片受 体激动剂预处理可以产生明显的心肌保护作用，并且这些作用和线粒体K ATP通道有关（刘 中民，2008)，为进一步探讨钾通道药物用于心肌保护提供了实验依据。随着研究的展开，我 们发现，心肌损伤和线粒体Kvl. 3钾通道关系密切，值得深入研究，其中要着重探索以下主 要方面的问题。
[0003] 哺乳动物细胞线粒体内已知存在两种涉及调节钾内流的钾通道，KATP和Bkca。淋 巴细胞内线粒体内已经发现存在Kvl. 3钾通道。心肌内线粒体是否存在Kvl. 3钾通道对研 究心肌保护至关重要。本发明涉及该领域。
[0004] 心肌损伤时线粒体Kvl. 3钾通道的重要性和机制需着重研究：
[0005] 首先，与已知有保护作用的两个线粒体钾通道（KATP、Bkca)比较，线粒体Kvl. 3在 心肌损伤中的地位如何？其次，如果关系很重要，这种影响对心肌细胞的影响是否超过对 内皮和冠脉平滑肌的影响？最后，涉及机制方面的研究，该通道的下游信号通道如何，和邻 近分子的相互作用有那些可以进一步了解？线粒体Kvl. 3与心肌损伤关系问题、只有这些 问题有所了解，才能明确线粒体Kvl. 3与心肌损伤的关系。
[0006] Kvl. 3通道是否在心肌中有表达，它们和MI/RI是否有关？抑或和其它通道协同 作用尚不清楚，对这些通道的进一步研究将为MI/RI的防治以及药物的开发奠定基础。为 此，我们构建了 Kvl. 3基因敲除小鼠。在实验中我们发现，野生型小鼠心房组织表达Kir3. 4 明显高于其他组织，而Kvl. 3不仅在心房组织有表达，在心室心肌中表达更明显。心脏三种 实质细胞均见免疫标记的呈现。Kvl. 3基因敲除后，小鼠表现能量代谢显著变化和抗肥胖、 体型突变等表现。并且引起外周细胞对胰岛素增敏效应(表现为脂肪、骨胳肌细胞膜的葡萄 糖转运蛋白增加，糖摄取增加)。该通道在依赖胰岛素的组织普遍表达。心肌是依赖胰岛素 的组织，该通道心肌细胞内的详细定位和作用缺乏研究。
[0007] 对自发商血压鼠血管的基因表达研究提不，Kvl. 3与血管张力过商?切有关。血 管平滑肌Kvl. 3通道是否在心脏I/R中产生痉挛致使无复流值得研究。最近还发现，脑组 织内皮细胞也表达Kvl、2钾通道，Kvl. 3参与内皮细胞膜电位平衡作用，其阻断剂对I/R防 止有重要意义。Kvl. 3基因在各种组织的表达提示存在广泛型和差异性。在心脏组织中，成 肌细胞以及成纤维细胞均表达Kvl. 3通道，并且与成肌细胞间以及成纤维细胞和心肌细胞 之间的偶联有关，同时涉及到钙依赖基因的编程。而此前的文献报道，一些组织的纤维细胞 表面不表达该基因。这些差异有什么生理意义不知道。
[0008] 由此，启发考查心脏三种实质细胞(心肌、血管平滑肌、内皮）内、线粒体内的 Kvl. 3的变化与心肌保护存在的一定关系。目前尚缺乏这方面的研究。因此有必要进一步 研究心脏不同细胞该基因的生理病理情况下的表达规律。
[0009] 线粒体KV1. 3通道在心肌不同细胞的表达及作用可用通道药物组合干预：
[0010]目前发现线粒体存在的钾通道KATP和BKca都有保护心肌损伤的作用。"线粒体渗 透转换孔"被活性氧（R0S)激活而大量通透启动凋亡甚至肿胀破裂。KATP的通道开放有利于 减轻该过程，保护心肌。此外，文献报道线粒体内膜上钙依赖钾通道Bkca也和损伤的保护 有关系。"线粒体渗透转换孔"的阻断(环孢素等）也可能对心肌保护有作用。"线粒体渗透 转换孔"直接涉及线粒体的膜完整性维持，直接与细胞的坏死和凋亡有关。研究淋巴细胞 的发育历程发现，线粒体内除了存在K ATP和Bkca，还有Kvl. 3三种钾通道。它们和线粒体的 钾浓度、线粒体容积、内膜电位、凋亡有关。T淋巴细胞发育和转变记忆细胞时候，人们观察 到Kvl. 3钾通道分布于淋巴细胞膜，能够调节淋巴细胞激活、增殖、分化和细胞因子分泌， 是免疫调节的靶点。在T淋巴细胞线粒体内膜上的Kvl. 3分子通道对细胞的抗凋亡有重要 作用。K通道的失敏也与缺氧反应和电传导功能有密切关系。我们前期预实验也发现心肌 内存在Kvl. 3通道蛋白。该蛋白是否直接和心肌损伤机理存在联系尚未知。由于线粒体内 有KATP和Kvl. 3、Bkca三种钾通道，共同的作用都是释放钾到线粒体内。三者的肽片段感受 器不同，三者的作用不同，下游信号通路不一样。而三者在心肌线粒体内的神秘关系有待揭 示。故提出整体研究方案，在基因敲除鼠等模型和活体、器官、细胞、信号通路等不同层面上 用三种钾通道各自特异阻断剂和开放剂经不同组合干预，统计分析分离因素，从而了解不 同的钾通道在抗损伤的作用。
[0011] 深入研究线粒体Kvl. 3通道参与细胞凋亡、能量代谢的信号通路：
[0012] 目前，钾通道和心肌保护关系研究已经发展到能够了解通道下游分子信号联系及 其损伤预防设计的层面。线粒体内三种钾通道下游分子联系开始引起关注。这从其它细胞 的研究发现可以启发心肌细胞该通道下游信号通路研究的思路，对下一步研究该通道在心 肌保护时的作用尤其对线粒体钾通道研究提供了有效的研究思路和手段。（1)在研究淋巴 细胞的该分子部分通路已了解。（2)神经元的该分子部分通路已了解。（3)本研究组前期 已经开展了心脏表达文库(美国进口文库)_酵母双杂交筛选(钾通道下游）预实验，实验完 成可以指导下一步探索研究心肌细胞Kvl. 3通道下游信号通路明确方向。这些理论和实验 都为研究信号通路提供了可行性。目前，单通道基因敲除模型小鼠的制备为这类研究提供 了很好的平台。
[0013] 综上所述，发明背景有以下几点：①在临床实践中，MI/RI仍然是威胁高龄、危重 心脏病人治疗效果的高危因素，需进一步探讨MI/RI的防治方法；②心肌缺血/再灌注损伤 时心肌保护和线粒体损伤程度及钾离子通道有关，例如K ATP、Bkca。T细胞Kvl. 3钾通道与 线粒体的钾浓度、线粒体容积、内膜电位、能量代谢以及凋亡有关。③前期研究发现脑组织 线粒体Kvl. 3通道参与缺血再灌注损伤。我们研究发现，Kvl. 3不仅在心房组织有表达，在 心室心肌中表达更明显。④推测心脏三种实质细胞内、线粒体内的Kvl. 3的变化与心肌保 护可能存在一定关系。
[0014] 根据心肌内存在Kvl. 3通道的前期结果以及掌握足够特异的通道药物，在已构建 的Kvl. 3通道基因敲除小鼠模型上做细胞内、外两种Kvl. 3通道特异阻断，组合另外两种线 粒体通道的特异开放、阻断不同组合干预，可以区分出线粒体Kvl. 3钾通道在心肌保护中 的作用。结合力学电学和生化免疫学研究，探索线粒体钾通道之间的联系及心肌和内皮细 胞的损伤程度。并深入研究线粒体Kvl. 3通道参与细胞凋亡、能量代谢的信号通路及其机 制。研究结果为临床治疗提供钾通道药物治疗和保护心肌的理论基础，将为临床治疗心衰 提供心肌保护新的途径。


【发明内容】

[0015] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道 Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法。
[0016] 本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于构建与心肌保护相关的线粒体钾 通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的PCR引物对。
[0017] 具体而言，在本发明的第一方面，提供了一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通 道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步骤：
[0018] (1)制备同源重组载体：
[0019] (2) ES细胞打靶及筛选；
[0020] (3)重组干细胞PCR鉴定；
[0021] (4)嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过 囊胚腔注射获得嵌合体子代；
[0022] (5) F1代杂合小鼠Kvl. 3+/_繁育。
[0023] 作为优选的技术方案，步骤（1)具体为：打靶载体使用BAC载体，构建好的质粒用 BanmHI、EcoRI、HindllI酶切，产物电泳照相后鉴定条带。
[0024] 作为优选的技术方案，步骤（2)为：将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使其与基因 组发生同源重组。
[0025] 作为优选的技术方案，在步骤（3)中，设计如下PCR引物对：P1 : 如 SEQ ID N0. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID N0. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示；P1 和 P2 为一对引物，P3 和 P4 为一对引 物。
[0026] 作为优选的技术方案，在步骤（3)中，所述PCR反应条件为：94°C 30s ;67°C 30s ; 72°C 5min ;35 个循环。
[0027] 作为优选的技术方案，步骤（4)中，注射用囊胚采自C57BL/6J近交系小鼠，通过超 数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫， 假孕受体为C57BL/6J( 6 )与CBA (早）的杂交一代，生育出嵌合率大于50%的嵌合雄鼠。
[0028] 作为优选的技术方案，步骤（5)中，将嵌合率大于50 %的成熟小鼠与野生型 C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，用PCR方法 鉴定基因型，用普通酶短片段PCR扩增法，PCR阳性产物用T载体连接后转化进大肠杆菌， 电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子，产物用T4连接酶连到pMD18T载体，转化进大肠杆 菌筛选，煮菌PCR初步鉴定后，送测序鉴定。
[0029] 在本发明的第二方面，提供了用于构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kvl. 3基 因敲除小鼠模型的PCR引物对，采用以下两对引物对：P1和P2引物对，P3和P4为引物对； PI :ATGAAACCATTCACATAGCCT AAACAG，如 SEQ ID NO. 1 所示；P2 :CCTCCCCCGTGCCTTCCTTG AdnSEQIDN0.2m*;P3:GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGTjnSEQIDN0.3m* ;P4: CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAjnSEQIDN0.4K*。
[0030] 本发明的有益效果在于，本模型可以通过建立和应用基因敲除和野生型小鼠心肌 缺血再灌注损伤模型方法，分别在整体水平、细胞水平、亚细胞水平以及离子单通道水平深 入探讨Kvl. 3在心肌保护中的作用和机制，并与KATP、Bkca钾通道心肌保护效果比较，试图 揭示实质细胞中线粒体内Kvl. 3、KATP、Bkca通道与MI/RI之间的科学联系。小鼠Kvl. 3钾 通道分子的敲除系制备有一定难度，其检测尤其困难，本发明解决了现有技术的难题，提供 了一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法及涉及PCR检 测引物和特定测定方法。
[0031] 传统基因打靶小鼠的建系多使用小质粒和DNA杂交等方法构建和鉴定。本实验使 用BAC载体和PCR加测序鉴定获得同样效果。用同源重组方法敲除ES干细胞的靶基因，经 过嵌合体、杂交生殖繁育工程和筛选鉴定，初步获得Kvl. 3基因敲除鼠。改进方法产生的首 建鼠尾组织DNA鉴定证实该方法也能获得敲除小鼠个体群。敲除小鼠个体特征符合国外文 献报道的个体特征。尽管尚需要进一步生化鉴定和进一步繁育回交到C57近交系才能获 得稳定种群，但是，快速获得首建的方法经过基因检测初步获得证实，方法值得应用。该小 鼠的繁育成功，为建立了稳定的钾离子通道病研究模型和先进的研究方法，对心肌保护的 病理生理机制等打下了基础。小鼠基因Kvl. 3又叫Kcna3,是电压依赖性钾通道。2005年 Ildik Szab发现淋巴细胞的线粒体中的Kvl. 3通道和免疫细胞的进化发育以及功能密切 相关，是T淋巴细胞细胞膜的主要钾通道。电镜和免疫组化研究显示定位在线粒体膜上。 研究发现Kvl. 3基因的分子高表达在自身免疫病人的记忆T和M细胞上，提示和免疫疾病 也存在很大关系。有报道称，该钾通道甚至与癌症也有关系。最近还有研究发现，线粒体 的钾通道中，Kvl. 3分子在细胞凋亡途径中是重要的成份。线粒体去极化并释放细胞凋亡 标记蛋白CYTC与Kvl. 3钾通道有关。另有文献讨论，Kvl. 3与能量代谢和体重调节有关， 用药物阻断该通道可以调节能量代谢[1°]。心肌损伤与线粒体早期受损以及能量代谢有着 不可分割的联系。开展该模型的研究，对心肌保护研究将提供有益的先进模型。该分子敲 除后动物主要大体表现主要有体重减小很明显，生成超级小体重鼠 [11]。味蕾细胞膜的该分 子作用可能是主要原因之一。该分子剔除后还表现阴离子通道代谢性表达增强[12]。它对 细胞的胰岛素敏感性这个涉及能量代谢的环节也存在调节作用 [13，14]。总之，该模型的建 立，为研究免疫、细胞调亡、心肌保护等和线粒体钾通道的关系甚至研究代谢综合症提供了 一种新的方法。
[0032] 以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是， 这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发 明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

【专利附图】

【附图说明】
[0033] 图1是本发明实施例1的小鼠Kcna3基因敲除示意图。
[0034] 图2是本发明实施例1的小鼠Kcna3基因打靶载体示意图。
[0035] 图3是本发明实施例1的小鼠Kcna3基因打靶质粒限制性内切酶鉴定电泳图谱。
[0036] 图4A和图4B是本发明实施例1的小鼠129胚胎干细胞基因打靶药物筛选后PCR 鉴定琼脂糖电泳结果示意图，其中，图4A见4. 8kbp为阳性条带，图4B见4. 2kbp为阳性条 带。
[0037] 图5是本发明实施例2中显微镜示意图；
[0038] 图6是本发明实施例2中C57新生（2d)小鼠原代心肌细胞培养爬片上见四种主 要功能细胞(心肌细胞、冠脉内皮细胞、冠脉平滑肌细胞、传导(大核）细胞）的Kvl. 3钾通道 免疫染色示意图（200X)。

【具体实施方式】
[0039] 以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未 尽之处，可以参考相应的PCR和基因测序的实验手册。
[0040] 实施例1
[0041] 1. Kvl. 3基因敲除小鼠的制备：
[0042] 1. 1?制备同源重组载体
[0043] 设计和构思基因组中对Kcna3的打祀原理。Kcna3打祀载体使用BAC (Geneserve Co，U.K.)载体（BAC:bMQ42P18)。参照文献（Otani H.The role of nitric oxide in myocardial repair and remodeling. Antioxid Redox Signal,2009,11(8):1913-28 ;和 Halestrap AP, Clarke SJ, Khaliulin I.The role of mitochondria in protection of the heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta. ,2007,1767 (8): 1007 - 1031)。构 建好的质粒用BanmHI、Ec〇RI、HindIII酶切，产物电泳照相后鉴定条带。
[0044] 1. 2. ES细胞打靶及筛选
[0045] 基因打祀：100 u g Kcna3-K0_vector 质粒 DNA 用 Notl (酶用量：300U)线性化。 打靶载体线性化酶切体系为250 y L、37°C消化过夜，等体积酚氯仿、氯仿处理后，无水乙醇 沉淀，100 U L 无菌 PBS 重悬备用。35 u g 线性化 Kcna3-K0_voctor DNA 在 Bio - Rad Gene Pulser电转仪上对129/S6/SvEv鼠胚胎干细胞SCR012电穿孔。电穿孔条件：电压256v，电 容500 ii F,通电时间9. 6ms。打靶后用300 ii g/mL G418和2 ii Mol/L GanC双药筛选8d后 挑克隆，并进行跨5'或3'臂和插入片段的DNA鉴定，使用长链PCR酶（Fermentas Co,立 陶宛)。
[0046] 1. 3?重组干细胞鉴定：
[0047] 设计 PCR 引物：Pl(5' 臂）：ATGAAACCAITCACATAGCCT AAACAG (如 SEQ ID NO. 1 所示）；P2(Neo F) :CCTCCCCCGTGCCTTCCTTG AC (如 SEQ ID N0.2 所示）；P3(3 '臂）： GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT (如 SEQ ID N0.3 所示）；P4(Ne〇-R) :CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA (如 SEQ ID NO. 4 所示）；5' 臂用 PI 和 P2 检测。PCR 条件：94°C 30s ;67°C 30s ; 72°C 5min ;35 个循环。PCR 仪使用 Eppendorf AG22331(Hamburg，德国）。试剂：TaKaRa La Taq EcoRI 来自宝生物工程（大连)有限公司。Marker:MBI GeneRuler;lkb DNA Ladder(晶 美生物有限公司，上海）。电泳见4.8kbp阳性条带。3'臂用P3和P4检测。PCR条件： 94°C 30秒；63°C 30秒；72°C 5分；35个循环。电泳见4. 2kbp阳性条带。
[0048] 1. 4?实验动物：
[0049] SPF级C57BL/6J(古）与CBA (早）小鼠来源于上海实验动物资源中心 【SyXK (沪）2008-0035】。无菌手术在上海中医药大学实验动物中心屏障动物实验设施进行 【SyXK (沪）2009-0069】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。
[0050] 1.5?嵌合小鼠制备：
[0051] 参照以下文献（Facundo HT, Fornazari M, Kowaltowski AJ.Tissue protection mediated by mitochondrial K + channels. Biochim Biophys Acta.，2006, 1762 (2) : 202-12..)记载的方法。药物筛选挑取的阳性克隆，PCR鉴定获得同 源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊胚腔注射获得嵌合体子代。注射用囊胚采 自C57BL/6J近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射。 注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6J( 6 )与CBA (早）的杂交一代。生 育出嵌合率大于50 %的嵌合雄鼠。
[0052] 1. 6.F1代杂合小鼠Kvl. 3+繁育：
[0053] 将嵌合率大于50 %的成熟小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代灰色 小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定。用PCR方法鉴定基因型。用普通酶短片段PCR扩 增法。PCR阳性产物用T载体连接后转化进大肠杆菌。电泳结果判断野生型、杂合子或纯合 子。产物用T4连接酶连到pMD18T载体，转化进大肠杆菌筛选。煮菌PCR初步鉴定后，送测 序鉴定。
[0054] 2?结果
[0055] 2. 1构建好的质粒用BanmHI、EcoRI、Hindlll限制性内切酶反应后电泳鉴定图谱 和基因打靶设计图见图1，图2,图3。如图1所示，分别是小鼠Kcna3基因野生型、打靶突变 型基因座位、打靶双臂位置示意图。如图2所示，载体中插入序列小鼠Kcna3基因的5'端 4410bp、3'端3744bp和中间Pgk启动NE0表达读框（1926bp)。如图3所示，M代表DNA大 小参照标准；（_)代表阴性对照；1泳道代表BamHI内切酶反应，10388bp和5654bp ;2泳道 代表 EcoRI 内切酶反应，5653&口、395(^口、3255&口、159(^口、148(^口、48&口和16&口 ；3泳道代表 Hindlll内切酶反应，8952bp、6341bp和699bp。图1-图3结果提示检测片段正确。基因打 靶后，做ES克隆鉴定。将pGK启动子指导的NE0表达框敲进并替代到Kvl. 3第三外显子部 位。上游臂3. 2k，下游臂为5. 0k，下游臂侧翼接pGK启动子指导的TK表达框。PCR鉴定药 物抗性ES细胞克隆96个，其中9个ES克隆发生双臂同源重组。PCR产物经DNA序列测定 进一步证实。9个ES克隆PCR电泳图如图4A和图4B所示。如图4A所示，5'端阳性PCR 条带4. 8kbp见于1、2、4、6、7、8、9、10、11孔道；如图4B所示，3'端阳性PCR条带4. 2kbp见 于1、6、12、13、16、20、21孔道；每对有一个引物在插入片段中。
[0056] 2. 2超排了 80只C57BL/6J小鼠，共注射了 151枚囊胚，移植了 9个假孕母鼠，出生 了 17只小鼠，其中4只为嵌合率大于50%的嵌合雄鼠。嵌合雄鼠经C57BL/6J小鼠交配繁 殖后获得40只灰鼠，经基因型鉴定分析，有8只为杂合子小鼠，为5雄3雌（F1代)。
[0057] 2. 3基因敲除F1代杂合小鼠。对繁育的F1代后代做基因型鉴定。用PCR法对构 建载体测序报告的结果提示PCR为基因组DNA序列敲除原设计部位的特异产物。排除了非 特异扩增现象，提示结果可靠。杂合小鼠经过繁育现已获得纯合子个体。
[0058] 2. 4,经过7代以上回交，基因型稳定在近交系动物群内。
[0059] 实施例2心肌线粒体内膜Kvl. 3钾通道的发现
[0060] 1. C572D鼠消毒后采取心脏，剪碎；
[0061] 2?胰酶消化心肌；
[0062] 3?培养三天后传代到载玻片室，48H换液，72小时换液；
[0063] 4.去培液，DPBS洗两次，冷95%固定5分钟，送公司处理；
[0064] 5.大概处理：4%多聚甲醛固定15分，待穿膜的PBS洗两次，放在4°C温度下保 存。
[0065] 6.染荧光：
[0066] (1)封闭15分后，
[0067] (2) -抗：染15分钟，洗两次，
[0068] (3)二抗：染15分钟，洗两次，
[0069] 7.加PI染十分钟后，放在4°C温度下待测；
[0070] 8.显微镜下采取图像，见图5 :
[0071] 一，见培养细胞均有染色，主要集中在心肌线粒体上；心脏传导细胞内线粒体少， 核大，但是细胞膜Kvl. 3染色弱阳性。
[0072] 二，心肌四种细胞(心肌细胞、冠脉内皮细胞、冠脉平滑肌细胞、传导(大核）细胞） 中，Kvl. 3分布有差异：心肌多，内皮也很多，平滑肌相对少些，而传导细胞（大核）很 少(见图6)。
【权利要求】
1. 一种构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法，其特征 在于，包括如下步骤：（1)制备同源重组载体：（2)ES细胞打靶及筛选；（3)重组干细胞PCR 鉴定；（4)嵌合小鼠制备：PCR鉴定获得同源重组克隆后，将正确同源重组的ES细胞通过囊 胚腔注射获得嵌合体子代；（5) F1代杂合小鼠 Kvl. 3+繁育。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)具体为：打靶载体使用BAC载体，构 建好的质粒用BanmHI、Ec〇RI、HindIII酶切，产物电泳照相后鉴定条带。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)为：将打靶载体电击转化胚胎干细 胞，使其与基因组发生同源重组。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，设计如下PCR引物对：P1 : 如 SEQ ID NO. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID NO. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示；P1 和 P2 为一对引物，P3 和 P4 为一对引 物。
5. 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，所述PCR反应条件为： 94°C 30s ;67°C 30s ;72°C 5min ;35 个循环。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)中，注射用囊胚采自C57BL/6J近 交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假 孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6J( 6 )与CBA (早）的杂交一代，生育出嵌合率大于 50%的嵌合雄鼠。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5 )中，将嵌合率大于50 %的成熟小鼠 与野生型C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定， 用PCR方法鉴定基因型，用普通酶短片段PCR扩增法，PCR阳性产物用T载体连接后转化进 大肠杆菌，电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子，产物用T4连接酶连到pMD18T载体，转化 进大肠杆菌筛选，煮菌PCR初步鉴定后，送测序鉴定。
8. 用于构建与心肌保护相关的线粒体钾通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的PCR引 物对，其特征在于：采用以下两对引物对：P1和P2引物对，P3和P4为引物对；P1 : 如 SEQ ID NO. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID NO. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104450759SQ201310443449
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】刘中民, 范慧敏, 张良平 申请人:上海市东方医院