一种肺炎支原体培养基的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种肺炎支原体培养基，其为在一个容器中盛装有一固体培养基和一液体培养基，所述的固体培养基在所述的容器内部呈现出一个斜面，同时所述斜面的1/4～1/2浸没在所述的液体培养基中；所述容器还包括一个可密封所述容器的内部空间的密封部件；所述的固体培养基的组分除包括15～25g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基的组分相同。本发明的培养基用于检测肺炎支原体，提高了检测的特异性，且可得到单克隆菌落，方便基于检测结果作下游的进一步研究工作。
【专利说明】一种肺炎支原体培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种肺炎支原体培养基。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae)属脲原体，无细胞壁及前体，细胞器极少。 肺炎支原体主要引起支原体肺炎，支原体肺炎患者虽然自感症状较重，但胸部体检一般无 明显异常体征。除呼吸系统的表现外，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。由于支原体 肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊 断。若要明确诊断，需要进行病原体的检测。
[0003] 目前，国内支原体肺炎的检测主要依靠血清学检测，但该方法的特异性及灵敏度 均较差。肺炎支原体的另一个检测方法是培养法。液体培养法的原理是肺炎支原体分解葡 萄糖后使培养基的pH值降低，使酚红指示剂由红变黄。由于某些耐青霉素微生物也可能分 解葡萄糖，因此该法虽然较为快速，但存在较高的假阳性。而利用固体培养基检测肺炎支原 体虽然可得到单菌落、特异性很强，但报告检测时间太长，不利于临床的快速诊断。因此，本 领域目前亟需检测特异性高同时又能够达到快速检测目的的肺炎支原体检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对目前对肺炎支原体的检测中，液体培养法存在 假阳性，而采用固体培养基检测又太耗费时间的缺陷，提供一种新的肺炎支原体培养基，其 是一种肺炎支原体双相培养基。本发明的肺炎支原体双相培养基提高了检测的特异性，且 可得到单克隆菌落，从而有利于临床诊断。并且，此培养基只需要一份标本接种一次，从而 更易于实验室操作，方便在实践中推广应用。
[0005] 本发明提供的技术方案之一是：一种肺炎支原体培养基，其是一种肺炎支原体双 相培养基，其为在一个容器中盛装有一固体培养基和一液体培养基，所述的固体培养基在 所述的容器内部呈现出一个斜面，同时所述斜面的1/4?1/2浸没在所述的液体培养基中； 所述容器还包括一个可密封所述容器的内部空间的密封部件；
[0006] 所述的液体培养基的组分包括40?60g/L牛肉膏、7?12g/L蛋白胨、4?6g/L 氯化钠、70?130mL/L牛血清、10?20mL/L DMEM液体培养基质、8?15mL/L质量体积百分 数为10?40%酵母浸液、3?7g/L葡萄糖、0. 3?0. 7mL/L质量体积百分数为0. 2?0. 6% 酚红指示剂、0. 005?0. 015g/L制霉素、600?1500IU/L青霉素和0. 5?1. Og/L尼克酰胺 腺嘌呤二核苷酸；所述的DMEM液体培养基质通过如下方法制得：将低糖DMEM粉末溶于水 形成10g/mL浓度；
[0007] 所述的固体培养基的组分除包括15?25g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养 基的组分相同。
[0008] 本发明中，所述的容器可以为本领域常规用于盛装培养基的容器，如透明的玻璃 管或塑料管，优选试管。较佳地，所述的容器的直径为3?7cm，所述的容器的长度为6? 15cm。更佳地，所述的容器的直径为5?7cm，所述的容器的长度为8?10cm。
[0009] 本发明中，所述的密封部件为本领域常规，只要其能够将所述容器的内部空间密 封，使所述容器的内部空间与外界隔绝，防止空气中的杂菌进入所述容器的内部，同时还能 防止容器内部的培养基中的水分挥发即可。较佳地，所述的密封部件为与所述容器可以紧 密贴合的盖子。所述的密封部件也可以是用于封口的塑料封口膜。
[0010] 本发明中，较佳地，所述的液体培养基的组分包括45?55g/L牛肉膏、8?10g/ L蛋白胨、5?6g/L氯化钠、80?110mL/L牛血清、12?18mL/L DMEM液体培养基质、10? 12mL/L质量体积百分数为20?30%酵母浸液、4?6g/L葡萄糖、0. 4?0. 6mL/L质量体积 百分数为0. 3?0. 6%酚红指示剂、0. 008?0. 012g/L制霉素、800?1200IU/L青霉素和 0. 5?1. Og/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。
[0011] 本发明中，较佳地，所述的固体培养基在所述的容器内部呈现出一个斜面，同时所 述斜面的1/3浸没在所述的液体培养基中。
[0012] 本发明中，所述的固体培养基的制备方法为本领域常规所述。较佳地，所述的固体 培养基由如下制备方法制备而得：将所述的固体培养基的各组分简单混合，以水溶解，调节 pH后再进行过滤除菌，然后加热至60?80°C溶化后，转到所述的容器中冷却形成斜面。所 述的调节pH为将pH调节至本领域检测肺炎支原体的培养基的常规的pH值范围，较佳地为 7. 5?8. 0,更佳地是7. 8。所述的水为本领域常规的用于配制培养基的水，较佳地为蒸馏 水。所述的过滤除菌也可以替换为其他的灭菌方式，只要其不破坏所述固体培养基的营养 成分即可。
[0013] 同样地，所述的液体培养基的制备方法为本领域常规所述。较佳地，所述的液体 培养基由如下制备方法制备而得：将所述的液体培养基的各组分简单混合，以水溶解，调节 pH后再进行过滤除菌，然后加热至60?80°C溶化后，转到所述容器中，并覆盖所述固体培 养基形成的斜面的1/4?1/2。所述的调节pH为将pH调节至本领域检测肺炎支原体的培 养基的常规的pH值范围，较佳地为7. 5?8. 0,更佳地是7. 8。所述的水为本领域常规的用 于配制培养基的水，较佳地为蒸馏水。所述的过滤除菌也可以替换为其他的灭菌方式，只要 其不破坏所述液体培养基的营养成分即可。
[0014] 本发明的一较佳实例为：
[0015] -种肺炎支原体培养基，其是一种肺炎支原体双相培养基，其为在一个直径是 5cm、长度是8cm的透明塑料管中盛装有一部分固体培养基和一部分液体培养基，所述的固 体培养基在所述的透明塑料管中形成一个斜面，所述的斜面的1/3浸没在所述的液体培养 基中，所述的透明塑料管还包括一个能紧密贴合所述透明塑料管的盖子；
[0016] 所述的液体培养基的组分包括45g/L牛肉膏、8g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、80mL/L 牛血清、12mL/LDMEM液体培养基质、10mL/L质量体积百分数为30%酵母浸液、4g/L葡萄糖、 0. 4mL质量体积百分数为0. 6%酚红指示剂、0. 008g/L制霉素、800IU/L青霉素和0. 5g/L尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸；
[0017] 所述的固体培养基的组分除包括15. Og/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基 的组分相同。
[0018] 本发明的另一较佳实例为：
[0019] -种肺炎支原体培养基，其是一种肺炎支原体双相培养基，其为在一个直径是 7cm、长度是10cm的透明玻璃管中盛装有一部分固体培养基和一部分液体培养基，所述的 固体培养基在所述的透明玻璃管中形成一个斜面，所述的斜面的1/3浸没在所述的液体培 养基中，所述的透明玻璃管还包括一能密封所述透明玻璃管内部空间的塑料封口薄膜；
[0020] 所述的液体培养基的组分包括55g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、6g/L氯化钠、110mL/ L牛血清、18ml/L DMEM液体培养基质、12mL/L质量体积百分数为20%酵母浸液、6g/L葡萄 糖、0. 6mL质量体积百分数为0. 3%酚红指示剂、0. 012g/L制霉素、1200IU/L青霉素和1. 0g/ L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸；
[0021] 所述的固体培养基的组分除包括25g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基的 组分相同。
[0022] 本发明提供的技术方案之二是：一种以前述肺炎支原体培养基检测肺炎支原体的 方法，其包括如下步骤：
[0023] ( 1)将待测样本接种于所述的液体培养基中，轻摇混匀后倾斜容器，使一部分混有 待测样本的液体培养基平铺于所述的固体培养基上，即完成接种；
[0024] (2)将步骤（1)完成接种的培养容器置于培养箱中培养，培养温度为36?38°C， 培养箱内的C0 2浓度为5%?10%，所述的百分比为体积百分比；
[0025] (3)培养24?48小时判断初步检测结果，对阳性样本继续培养3?7天，得最终 检测结果；
[0026] 所述的判断初步检测结果的标准为：若液体培养基变红且清晰透明，可以初步报 告阳性；所述的最终检测结果的判断标准为：若固体斜面上有油煎蛋样菌落生长，且符合 肺炎支原体生化特征，最终报告肺炎支原体阳性。
[0027] 本发明中，步骤（2)所述的培养温度较佳地为37°C，所述培养箱内的C02浓度较佳 地为8%。
[0028] 在本发明中，对于步骤（3)中所述最终检测结果为阳性的样本，可在固体培养基形 成的斜面上得到单克隆菌落，以方便下游的进一步研究工作。
[0029] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0030] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031] 本发明的积极进步效果在于：
[0032] 同传统的肺炎支原体液体培养基相比，本发明的肺炎支原体双相培养基提高了检 测的特异性，且可得到单克隆菌落，方便基于检测结果作下游的进一步研究工作。一般的液 体培养基检测方法假阳性高达5?15%，给实际诊断带来了很大不便。而同传统的肺炎支 原体固体培养基相比，该培养基可以提前得到初步检测结果。一般传统的固体培养基得到 检测结果需要7?10天，本发明仅需要1?5天，从而有利于在实践应用中加快诊断速度。 本发明的肺炎支原体双相培养基只需要一份标本接种一次，从而更易于实验室操作，方便 在实践中推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为本发明肺炎支原体双相培养基的示意图。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0035] 下述实施例中，低糖DMEM粉末购自Sigma公司。
[0036] 牛血清购自购自Sigma公司。
[0037] 牛肉膏购自购自Sigma公司。
[0038] 蛋白胨购自购自Sigma公司。
[0039] 其他试剂或原料如无特别说明，均为常规市售商品。
[0040] 实施例1肺炎支原体双相培养基的制备
[0041] 将DMEM粉末溶于水形成10g/L浓度备用。秤取或以量具量取50g牛肉膏、10g蛋 白胨、5g氯化钠、100mL牛血清、10mL DMEM液体培养基质、10mL25%酵母浸液、5g葡萄糖、 0. 5mL0. 4%酚红指示剂、0. 01g制霉素、1000IU青霉素和0. 5g/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸， 将各组分简单混合后加入l〇〇〇mL蒸馏水中，调pH至7. 8,然后以0. 22 y m的滤菌膜过滤 除菌，然后加热至60°C充分溶化各组分，再将该培养基分成分别占总量的3/4和1/4的两 份，其中占3/4的一份加入1 lg琼脂粉，待加热溶解后，转入一个无菌的直径是5cm，长度是 10cm的透明塑料管中，倾斜塑料管以冷却形成一个斜面，即固体培养基部分。再将剩下的不 含琼脂粉的培养基倒入该形成斜面的塑料管中，并覆盖此斜面的1/3,即液体培养基部分。 塑料管以一个可以与其紧密贴合的盖子盖住其口部。具体如图1所示。在图1中，所述的 肺炎支原体双相培养基包括容器2、液体培养基3、固体培养基4形成的斜面和盖子1。
[0042] 实施例2肺炎支原体双相培养基的制备
[0043] 将DMEM粉末溶于水形成10g/L浓度备用。秤取或以量具量取45g牛肉膏、8g蛋 白胨、5g氯化钠、80mL牛血清、12mL DMEM液体培养基质、12mL20%酵母浸液、4g葡萄糖、 0. 4mL0. 3%酚红指示剂、0. 008g制霉素、800IU青霉素和0. 5g/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸， 将各组分简单混合后加入l〇〇〇mL蒸馏水中，调pH至7. 5,然后以0. 22 y m的滤菌膜过滤除 菌，然后加热至60°C充分溶化各组分，再将该培养基分成分别占总量的3/4和1/4的两份， 其中占3/4的一份加入15g琼脂粉，待加热溶解后，转入一个无菌的直径是3cm，长度是7cm 的透明玻璃管中，倾斜玻璃管以冷却形成一个斜面，即固体培养基部分。再将剩下的不含琼 脂粉的培养基倒入该形成斜面的玻璃管中，并覆盖此斜面的1/3,即液体培养基部分。玻璃 管以一个可以与其紧密贴合的盖子盖住其口部。
[0044] 实施例3肺炎支原体双相培养基的制备
[0045] 将DMEM粉末溶于水形成10g/L浓度备用。秤取或以量具量取55g牛肉膏、10g蛋 白胨、6g氯化钠、110mL牛血清、18mL DMEM液体培养基质、10mL30%酵母浸液、6g葡萄糖、 0. 6mL0. 6%酚红指示剂、0. 012g制霉素、1200IU青霉素和1. 0g/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷 酸，将各组分简单混合后加入l〇〇〇mL蒸馏水中，调pH至8. 0,然后以0. 22 y m的滤菌膜过 滤除菌，然后加热至60°C充分溶化各组分，再将该培养基分成分别占总量的3/4和1/4的 两份，其中占3/4的一份加入18g琼脂粉，待加热溶解后，转入一个无菌的直径是7cm，长度 是15cm的透明塑料管中，倾斜塑料管以冷却形成一个斜面，即固体培养基部分。再将剩下 的不含琼脂粉的培养基倒入该形成斜面的塑料管中，并覆盖此斜面的1/3,即液体培养基部 分。塑料管以一个可以与其紧密贴合的盖子盖住其口部。
[0046] 实施例4肺炎支原体双相培养基的制备
[0047] 将DMEM粉末溶于水形成10g/L浓度备用。秤取或以量具量取50g牛肉膏、9g蛋 白胨、6g氯化钠、100mL牛血清、18mL DMEM液体培养基质、10mL30%酵母浸液、6g葡萄糖、 0. 6mL0. 6%酚红指示剂、0. 012g制霉素、1000IU青霉素和1. Og/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸， 将各组分简单混合后加入l〇〇〇mL蒸馏水中，调pH至7. 8,然后以0. 22 y m的滤菌膜过滤除 菌，然后加热至60°C充分溶化各组分，再将该培养基分成分别占总量的3/4和1/4的两份， 其中占3/4的一份加入18g琼脂粉，待加热溶解后，转入一个无菌的直径是5cm，长度是8cm 的试管中，倾斜试管以冷却形成一个斜面，即固体培养基部分。再将剩下的不含琼脂粉的培 养基倒入该形成斜面的试管中，并覆盖此斜面的1/3,即液体培养基部分。试管以一个可以 与其紧密贴合的盖子盖住其口部。
[0048] 实施例5双相培养基在检测肺炎支原体中的应用
[0049] 1、检测的过程具体包括如下步骤：
[0050] (1)以无菌一次性拭子采集标本(受试者鼻咽部分泌物或痰标本）后，将其接种至 双相培养基的液体培养基中（将拭子在液相部分对应容器壁上研磨数次)，然后混匀，并倾 斜液相数次，以淹没固体培养基斜面，完成接种。将完成接种的培养基放置到温箱内培养。 培养条件为：37°C、8%C0 2。
[0051] (2)结果的观察：
[0052] (a)判断标准：在24?48h内若液体培养基变红且清晰透明，可以初步报告阳性； 报告阳性的样品继续培养3?7天，若固体斜面上有油煎蛋样菌落生长，且符合肺炎支原体 生化特征，最终报告肺炎支原体阳性；如果超过48h液体培养基仍不变色，可报告肺炎支原 体阴性。
[0053] 2、以实施例1所制得的培养基对待测样本进行检测，并对结果进行分析：
[0054] 选取50名受试者进行试验，结果为15名报告阳性，分别于16?48h液体培养基 变红且清晰透明，且在培养4?5天时最终报告阳性，并得到单克隆菌落，另有35名报告阴 性。具体检测结果如表1所示。
[0055] 表1检测结果
【权利要求】
1. 一种肺炎支原体培养基，其特征在于，其是一种肺炎支原体双相培养基，其为在一个 容器中盛装有一固体培养基和一液体培养基，所述的固体培养基在所述的容器内部呈现出 一个斜面，同时所述斜面的1/4?1/2浸没在所述的液体培养基中；所述容器还包括一个可 密封所述容器的内部空间的密封部件； 所述的液体培养基的组分包括40?60g/L牛肉膏、7?12g/L蛋白胨、4?6g/L氯化 钠、70?130mL/L牛血清、10?20mL/L DMEM液体培养基质、8?15mL/L质量体积百分数为 10?40%酵母浸液、3?7g/L葡萄糖、0. 3?0. 7mL/L质量体积百分数为0. 2?0. 6%酚红 指示剂、〇. 〇〇5?0. 015g/L制霉素、600?1500IU/L青霉素和0. 5?1. Og/L尼克酰胺腺嘌 呤二核苷酸；所述的DMEM液体培养基质通过如下方法制得：将低糖DMEM粉末溶于水形成 10g/mL 浓度； 所述的固体培养基的组分除包括15?25g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基的 组分相同。
2. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的容器的直径为3? 7cm，所述的容器的长度为6?15cm。
3. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的密封部件为与所述容 器可以紧密贴合的盖子或者是用于封口的塑料封口膜。
4. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的液体培养基的组分包 括45?55g/L牛肉膏、8?10g/L蛋白胨、5?6g/L氯化钠、80?110mL/L牛血清、12? 18mL/L DMEM液体培养基质、10?12mL/L质量体积百分数为20?30%酵母浸液、4?6g/L 葡萄糖、0. 4?0. 6mL/L质量体积百分数为0. 3?0. 6%酚红指示剂、0. 008?0. 012g/L制 霉素、800?1200IU/L青霉素和0. 5?1. Og/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸。
5. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的固体培养基由如下制 备方法制备而得：将所述的固体培养基的各组分简单混合，以水溶解，调节pH后再进行过 滤除菌，然后加热至60?80°C溶化后，转到所述的容器中冷却形成斜面；所述的液体培养 基由如下制备方法制备而得：将所述的液体培养基的各组分简单混合，以水溶解，调节pH 后再进行过滤除菌，然后加热至60?80°C溶化后，转到所述容器中，并覆盖所述固体培养 基形成的斜面的1/4?1/2。
6. 如权利要求5所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的调节pH为将pH调节至 7. 5 ?8. 0〇
7. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，其是一种肺炎支原体双相培 养基，其为在一个直径是5cm、长度是8cm的透明塑料管中盛装有一部分固体培养基和一部 分液体培养基，所述的固体培养基在所述的透明塑料管中形成一个斜面，所述的斜面的1/3 浸没在所述的液体培养基中，所述的透明塑料管还包括一个能紧密贴合所述透明塑料管的 盖子； 所述的液体培养基的组分包括45g/L牛肉膏、8g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、80mL/L牛血 清、12mL/LDMEM液体培养基质、10mL/L质量体积百分数为30%酵母浸液、4g/L葡萄糖、0. 4mL 质量体积百分数为〇. 6%酚红指示剂、0. 008g/L制霉素、800IU/L青霉素和0. 5g/L尼克酰胺 腺嘌呤二核苷酸； 所述的固体培养基的组分除包括15. 0g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基的组 分相同。
8. 如权利要求1所述的肺炎支原体培养基，其特征在于，其是一种肺炎支原体双相培 养基，其为在一个直径是7cm、长度是10cm的透明玻璃管中盛装有一部分固体培养基和一 部分液体培养基，所述的固体培养基在所述的透明玻璃管中形成一个斜面，所述的斜面的 1/3浸没在所述的液体培养基中，所述的透明玻璃管还包括一能密封所述透明玻璃管内部 空间的塑料封口薄膜； 所述的液体培养基的组分包括55g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、6g/L氯化钠、110mL/L牛 血清、18ml/L DMEM液体培养基质、12mL/L质量体积百分数为20%酵母浸液、6g/L葡萄糖、 0. 6mL质量体积百分数为0. 3%酚红指示剂、0. 012g/L制霉素、1200IU/L青霉素和1. Og/L尼 克酰胺腺嘌呤二核苷酸； 所述的固体培养基的组分除包括25g/L琼脂外，其余组分与所述的液体培养基的组分 相同。
9. 一种以如权利要求1?8任一项所述的肺炎支原体培养基检测肺炎支原体的方法， 其包括如下步骤： (1) 将待测样本接种于所述的液体培养基中，轻摇混匀后倾斜容器，使一部分混有待测 样本的液体培养基平铺于所述的固体培养基上，即完成接种； (2) 将步骤（1)完成接种的培养容器置于培养箱中培养，培养温度为36?38°C，培养 箱内的C02浓度为5%?10%，所述的百分比为体积百分比； (3) 培养24?48小时判断初步检测结果，对阳性样本继续培养3?7天，得最终检测 结果； 所述的判断初步检测结果的标准为：若液体培养基变红且清晰透明，可以初步报告阳 性；所述的最终检测结果的判断标准为：若固体斜面上有油煎蛋样菌落生长，且符合肺炎 支原体生化特征，最终报告肺炎支原体阳性。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的培养温度为37°C，所述 培养箱内的C02浓度为8%。
【文档编号】C12R1/35GK104450860SQ201310425112
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】刘锦铭, 朱长太, 郭健 申请人:上海市肺科医院