微生物的乙醇生产的利记博彩app
【专利摘要】本公开涉及用于工程化光合自养的生物体以转化二氧化碳和光成为脂肪酸酯和其他分子(包括生物燃料)的方法和组合物。所述分子然后由该生物体分泌到生长培养基中。
【专利说明】微生物的乙醇生产
[0001]本申请是申请日为2009年9月3日的200980145256.9号发明专利申请(名称为“微生物的乙醇生产”)的分案申请。
【技术领域】
[0002]本公开涉及用于工 程化光合自养生物体以转化二氧化碳和光成为脂肪酸酯和其他分子的方法和组合物，所述脂肪酸酯和其他分子然后由该生物体分泌到培养基中。
[0003]序列表的引用
[0004]本申请包含通过EFS-Web提交的序列并在此通过引用完整引入。在2009年10月7日产生的ASCII版本名称为“16020_PCT_SL.txt”，列出了 29个序列，文件大小为95kb。
【背景技术】
[0005]光合作用是生物实体利用阳光和二氧化碳产生糖以获取能量的过程。由于自然进化，光合作用是一个具有众多且知之甚少的反馈回路、控制机制和过程无效(process inefficiency)的极其复杂的系统。这个复杂的系统对于单因子轮换(one-factor-at-a-time)和全局优化法都呈现出可能无法逾越的障碍[Nedbal等，Photosynth Res., 93 (1-3):223-34 (2007) ；Salvucci 等，Physiol Plant.，120 (2):179-186(2004) ;Greene 等，Biochem J.,404(3):517-24 (2007)]。
[0006]现有的光合自养生物体(如植物、藻类和光合细菌)很难适用于工业生物加工,并因此没有显示出针对这一目的的商业可行性。与工业化异养生物体如大肠杆菌(20分钟)相比，这类生物体具有缓慢的倍增时间(3-72小时)，这反应出低下的总生产力。此外，遗传操作技术(敲除、经整合或游离Gpisomic)质粒扩增的转基因的过表达)是低效、费时、费力的或不存在的。
【发明内容】
[0007]本文所述的发明确认了赋予光合自养生物体直接产生碳基产物的能力的途径和机制。所获得的产生碳基产物的工程化光合自养生物特别地能够直接从二氧化碳和光高效地产生碳基产物，无需目前从生物质源(包括玉米、甘蔗、芒草、纤维素等)产生生物燃料和生物化学产品所必需的费时的和昂贵的处理步骤。因此，本发明的新型微生物能够通过固定二氧化碳合成从各种生物合成途径获得的碳基目的产物，还能释放这类产物。
[0008]这类产物的范围包括醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃和链烷烃，如丙烷、辛烷、柴油、JP8 ;聚合物如对苯二甲酸酯、I，3-丙二醇、I，4- 丁二醇、多元醇、PHA, PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε -己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商用化学品如乳酸盐、DHA、3-羟基丙酸盐、Y-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛留醇、ω-3?ΗΑ、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特种化学品如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物或药物中间体，如7-ADCA/头孢菌素、红霉素、聚酮、抑制素(statin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇、ω-脂肪酸和其它这类适合的目的产物。这些产物可用于燃料、生物燃料、工业和特种化学品、添加剂、作为用于制造其他产品(如营养补充剂、营养保健品、聚合物、石蜡替代品，个人护理产品和药物)的中间体。这些化合物也可以用作随后反应(例如，酯交换反应、氢化作用、经氢化、热裂解或两者结合的催化裂解或者环氧化反应)以产生其他产品的原料。
[0009]还公开了选择和利用各种生物体直接将太阳光和二氧化碳转化成碳基产物的方法。本发明的一方面提供了一种引入编码一个或多个能够固定二氧化碳以产生和(在一些实例中)排出或分泌碳基目的产物(如乙醇、乙烯、烃、乙基酯和甲基酯)的蛋白质的工程核酸序列的方法。本文提供的显著特征是，该微生物可优选地以商业规模生产各种碳基目的产物，而无需可再生的碳基中间体或源(如生物质)作为起始原料。
[0010]为产生至少一种所需的碳基目的产物如烃，利用了各种能够固定二氧化碳的生物体(例如那些能够进行光合作用的生物体)或可选择地经工程化以固定二氧化碳的生物体。例如，光合自养生物体包括真核植物和藻类，以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。
[0011]在一个方面中，能够固定二氧化碳的宿主细胞被工程化以产生具有希望数目的碳的碳基产物。优选地，该宿主细胞以商业规模产生各种碳基目的产物。
[0012]在其它的实例中，经修饰的宿主细胞是用编码参与涉及产物或中间体产生的生物合成途径的单个蛋白质的外源核酸序列遗传修饰的。在其它实施方式中，经修饰的宿主细胞是用编码参与涉及产物或中间体产生的生物合成途径的两个或多个蛋白质(例如，生物合成途径中的第一和第二个酶)的外源核酸序列遗传修饰的。
`[0013]在另一方面中，本发明提供了能够固定二氧化碳的宿主细胞，其产生乙烯。该宿主细胞可以包含编码乙烯形成酶，efe，的外源核酸。该乙烯形成酶，efe，可以包括雷尔氏菌乙烯形成酶。
[0014]在一个实施方式中，这样一种碳基目的产物是乙醇。在一个优选的实施方式中，该宿主细胞产生商业产量的乙醇。还提供了一种利用生物体以商业规模直接将阳光、水和二氧化碳转换成乙醇的方法。另外公开了一种将产生的乙醇以及与乙醇的产生相关的吸收的二氧化碳货币化的方法。
[0015]在某些方面中，乙醇产生通过在光照下将碳引导离开糖原并朝向丙酮酸等进行优化。糖原通常是在光中形成的，并在黑暗中消耗以减少能量。在一个实施方式中，糖原合成基因被弱化或敲除，和在其它实施方式中，使糖酵解基因成为组成型的。在其他方面中，消除了某些发酵途径，如产生乙酸、乳酸、琥珀酸等的途径(如果存在)。
[0016]进一步在其他方面中，如果实施光-暗周期，糖原产生在光照过程中被优化(与生物量等相反)，并以干细胞重量(可以为糖原)的％增加(即，该细胞经工程化以打破阻止细胞增长全糖原的任何限制)。然后，在黑暗中，使得从积累的糖原进行乙醇合成，已弱化或敲除了其它发酵途径。此外，公开了采用与糖原合成/代谢率相匹配的光暗周期以使浪费的时间最少(糖原未消耗且细胞非生产性地保持在黑暗中，或者在黑暗阶段中有太多糖原完全消耗)。
[0017]在本发明的各方面中，描述了用于产生糖的遗传修饰的光合生物体。在某些实施方式中，产生了糖类，如葡萄糖、果糖或其组合。优选地，产生的糖通过单向运输蛋白或转运蛋白扩散。在其它实施方式中，糖通过在产生3-磷酸甘油醛(3PGAL)的所选择宿主细胞中表达酶来产生，并利用转运蛋白主动运输。在再另外的实施方式中，光合生物体功能性地缺乏纤维素、糖原或蔗糖合成。所获得的光合产物(如光合生物体产生的糖)可作为产生其它的碳基目的产物的原料或碳源。
[0018]在本发明的另一方面中，本发明提供了生产麦芽糖的光合生物体。在某些实施方式中，本发明提供了糖原水解酶的克隆基因，其使工程细胞将糖原水解为葡萄糖和/或麦芽糖并从细胞运输麦芽糖和葡萄糖。用于从细胞运输麦芽糖的酶包括用于麦芽糖运输的叶绿体麦芽糖排出泵=MEXl ;葡萄糖通透酶，低和高Km、葡萄糖:H+协同转运蛋白、葡萄糖/果糖通透酶、用于葡萄糖运输的总糖:H+反向转运蛋白；和葡萄糖-6磷酸:Pi反向转运蛋白、用于葡萄糖-6-磷酸运输的丙糖磷酸:磷酸反向转运蛋白是本发明可预想的转运机制。
[0019]在另一个实施方式中，通过对各种能够固定二氧化碳的或者经工程化以固定二氧化碳的生物体进行工程化来产生烃。在一个实施方式中，该微生物引入了一个或多个编码乙酰CoA =ACP酰基转移酶活性(fabH)、乙酰CoA羧化酶活性(accBCAD)、丙二酰CoA =ACP酰基转移酶活性(fabD)、3_酮酰-ACP合成酶活性(fabB)、3_酮酰-ACP还原酶活性(fabG)、3-羟酰-ACP脱水酶活性(fabA)、烯酰-ACP还原酶活性(fabl)、酰基-ACP水解酶活性(FASl)、醛脱氢酶活性(adhA、adhB)、醇脱氢酶活性(ADH I)、烷烃1_单加氧酶活性(alkB)的外源核酸序列。
[0020]可以过表达以产生脂肪酸衍生物的其它基因为例如，pdh, panK、aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合体的EIp脱氢酶成分和E2p 二氢硫辛酰胺酰基转移酶成分，登录号:NP_414656, NP_414657, EC:1.2.4.1.2.3.1.61，2.3.1.12)、accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码 FAS，登录号:CAD85557，CAD85558, NP_842277, NP_841683,NP_415613, EC:2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3, 2.3.1.179)、编码脂酰 CoA 还原酶(登录号:AAC45217， ECl.2.1.-)的基因、UdhA或类似的基因(编码吡啶核苷酸转氢酶，登录号:CAA46822, EC:1.6.1.1)和编码脂酰 CoA 还原酶(登录号:AAC45217, ECl.2.1.-)的基因。
[0021]与表达使得产生脂肪酸衍生物的外源核酸序列相反，宿主可以有一个或多个功能缺失或弱化的内源性基因。例如，可以至少弱化ackA(EC2.7.2.1)、ackB(EC2.7.2.1)、adhE (ECl.1.1.1,1.2.1.10)、fabF(EC2.3.1.179)、fabR(登录号 NP_418398)、fadE (ECl.3.99.3，1.3.99.-)、GST (EC6.3.2.3)、gpsA (ECl.1.1.94)、IdhA (ECl.1.1.94)、pflB(EC2.3.1.54)、plsB(EC2.3.1.15)、poxB (ECl.2.2.2)、pta(EC2.3.1.8)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)及其组合。
[0022]这类微生物可以经工程化以产生具有限定碳链长度、分支和饱和度的烃或脂肪酸。
[0023]在一些实施方式中，表达了由外源核酸序列编码的肽类(例如硫酯酶)以提供均质的产物，这将降低与发酵和分离有关的整体成本。
[0024]在一些实施方式中，微生物包含一个或多个外源工程核酸，其编码酰基CoA合成酶(EC6.2.1.3)、硫酯酶(EC3.1.2.14)、蜡合成酶(EC2.3.1.75)、醇乙酰转移酶(EC2.3.1.84)或其组合。在另外的实施方式中，微生物包含编码硫酯酶(EC3.1.2.14)、酰基CoA还原酶(ECl.2.1.50)、醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、脂肪醇形成酰基CoA还原酶(EC1.1.1.*)或其组合的工程核酸。
[0025]在一些实施方式中，本文所述的微生物产生每升发酵培养基至少Img的碳基目的产物，例如，烃。在更优选的实施方式中，微生物产生至少100mg/L、500mg/L、I g/L、5g/L、10g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、50g/L、lOOg/L 或 120g/L 的烃。在一些实施例中，所述烃由微生物产生和释放，且在另外的实施例中，微生物在产物分离之前被裂解。
[0026]在某些实施例中，所述烃包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳长的碳链。在一些实施例中，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的制备的烃产物包含2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳长的碳链。在再另外的实施例中，至少60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的脂肪酸衍生产物包含1、2、3、4或5个不饱和点。
[0027]如W02007/136762(通过引用以其整体和全面引入)所示，可对某些生物合成途径工程化以产生脂肪醇和蜡/脂肪酸酯，各底物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、酰基-ACP、脂肪酸和酰基-CoA)各个产物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、酰基-ACP、脂肪酸和酰基-CoA)的转化可以通过使用几种不同的多肽(其为所示的酶类的成员)而实现。
[0028]本文所述的宿主可以产生醇类(短链、长链、支链的或不饱和的)。这些醇可以直接被用作燃料或其可以被用于产生酯，即如上所述酯的A侧。这种酯单独地或与本文所述的其他脂肪酸衍生物结合是用作燃料。
[0029]类似地，本文所述的微生物所产生的烃可用作生物燃料。这些基于碳氢化合物的燃料可以被设计为包含分支点、限定的饱和度和特定的碳长度。当单独地或与其他脂肪酸衍生物结合用作生物燃料时，烃可另外与添加剂或其它传统燃料(醇类、源自甘油三酯的柴油和基于石油的燃料)相结合。
[0030]在一个实施方式中，本发明提供了一种工程微生物宿主细胞，其中所述工程宿主细胞包含一个或多个工程核酸，并且其中所述工程宿主细胞能够利用最少量的光能直接从二氧化碳和水合成碳基目的产物，和其中所述碳基目的产物选自于乙基酯、甲基酯、蔗糖、醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烃、正链烷烃、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、对苯二甲酸盐、多元醇、1，3_丙二醇、1，4_ 丁二醇、PHA, PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶、乳酸盐、DHA、3-羟基丙酸盐、Y-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、co-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸、柠檬烯、药物或药物中间体、红霉素7-ADCA/头孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇以及ω-脂肪酸。
[0031] 在另一个实施方式中，宿主细胞所包含的工程核酸编码乙烯形成酶(Efe)活性。在相关的实施方式中，该乙烯形成酶选自于菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringaepv.Phaseolicola)D13182、豌豆细菌性枯萎病菌(P.syringae pv.Pisi)AF101061 和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)AL646053。在另一个实施方式中，该工程核酸编码密码子优化的雷尔氏菌(Ralstonia)乙烯形成酶。在相关的实施方式中，该密码子优化是对于大肠杆菌(Eschericia coli)密码子选择进行的。在再另一相关的实施方式中，该工程核酸是 SEQ ID N0.7。
[0032]在一些实施方式中，本发明的工程细胞产生高于每升发酵培养基约lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量的乙烯。
[0033]在某些实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码醇脱氢酶活性。在相关的实施方式中，该醇脱氢酶活性选自于运动发酵单胞菌(Z.mobiliS)adhI1、运动发酵单胞菌adhll TS42和运动发酵单胞菌adhB活性。在另一个相关的实施方式中，该工程核酸编码NADPH依赖性醇脱氢酶活性。在再另一个实施方式中，其中该NADPH依赖性醇脱氢酶活性是穆尔氏菌(Moorella) HUC22-1种adhA。
[0034]在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码丙酮酸脱羧酶活性。在相关的实施方式中，该丙酮酸脱羧酶活性选自于Z.palmae和运动发酵单胞菌pdc活性。
[0035]在一些实施方式中，本发明的工程细胞在培养中能够在72小时内以每升培养基至少约249mg的产量产生乙醇。在另一些实施方式中，整个72小时内的乙醇产量为至少约296mg/L。而在再另外的实施方式中，乙醇产量是介于约2.5至约5g/L培养基?小时之间。在另一些实施方式中，72小时后所述培养基中乙醒的水平为低于约14mg/L。在其它实施方式中，该细胞在培养中产生每OD至少约36mg/L的乙醇，或者每OD至少约47mg/L的乙醇。
[0036]在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码蛋氨酸合成酶活性。
[0037]在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于大肠杆菌糖磷酸转运蛋白UhpT(NP_418122.1)、拟南芥(A.thaliana)葡萄糖_6_磷酸转运蛋白GPTl (AT5G54800.1)和拟南芥葡萄糖_6_磷酸转运蛋白GPT2 (AT1G61800.1)的磷酸转运蛋白活性。
[0038]在另一实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于人(H.sapiens)葡萄糖_6_磷酸酶G6PC (P35575)、大肠杆菌葡萄糖_1_磷酸酶Agp (P19926)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)葡萄糖_1_磷酸酶AgpE (Q6EV19)和大肠杆菌酸性磷酸酶YihX (P0A8Y3)的磷酸酶活性。
[0039]在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于人葡萄糖转运蛋白 GLUT-1、-3 或-7 (Pl1166、Pl1169、Q6PXP3)、酿酒酵母(S.cerevisiae)己糖转运蛋白HXT-1、-4或-6(P32465、P32467、P39003)和运动发酵单胞菌葡萄糖单向转运蛋白Glf(P21906)的葡萄糖/己糖转运蛋白活性。在相关的实施方式中，本发明的工程细胞进一步包含编码葡萄糖/果糖:H+协同转运蛋白、集胞藻(Synechocystis)属的种(P15729)的GlcP细菌GlcP、主要葡萄糖(或2-脱氧葡萄糖)吸收转运蛋白GlcP Q7BEC、己糖(葡萄糖和果糖)转运蛋白、恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)097467的PfHTl、Glut_l转运蛋白或Glut-2转运蛋白的工程核酸。
[0040]在另一个方面中，本发明所提供的工程细胞中选自于纤维素合成酶、糖原合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖磷酸化酶、α-1,4-葡聚糖裂合酶和1，4-α -葡聚糖分支酶的酶活性弱化。在相关的方面中，该工程细胞进一步包含编码磷酸酶或者己糖激酶活性的工程核酸。
[0041]在再另一个实施方式中，本发明提供了包含选自于α-，β_，Y-淀粉酶；葡糖淀粉酶；异淀粉酶；支链淀粉酶；麦芽糖转葡糖基酶；淀粉_α -1，6-葡萄糖苷酶;磷酸化酶激酶和磷酸化酶的糖原水解活性的工程细胞。
[0042]在再另一个实施方式中，本发明提供能够产生选自于葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、麦芽糖和麦芽糖磷酸的糖或糖磷酸酯的工程细胞。在相关的实施方式中，该细胞能够产生高于其内源性水平的糖或糖磷酸酯并将所述糖运输至细胞外。在再另一相关的实施方式中，该细胞产生的糖选自于包括葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、木糖、戊糖、鼠李糖和阿拉伯糖的糖类。在某些方面中，本发明的工程细胞在培养中能够以高于每升发酵培养基约 lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量产生糖或糖磷酸酯。
[0043]在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于乙酰CoA乙酰转移酶、AtoB, β -羟基丁基CoA脱氢酶、巴豆酸酶、CoA脱氢酶、CoA-酰化醛脱氢酶(CoA-acylating aldehyde dehydrogenase) (ALDH)和醒醇脱氢酶，AdhE 活性的工程核酸。在再另一个实施方式中，该细胞包含编码选自于2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase), aroF (EC2.5.1.54)、3_ 脱氧查尼酸合成酶，aroB(EC4.2.3.4)、3_脱氢奎尼酸脱水酶，aroD(EC4.2.1.10)、3_脱氢莽草酸脱水酶，quiC (EC4.2.1.η)、β -酮己二酸单酸 CoA 合成酶(β -ketoadipy1-CoA synthase)，pcaF(EC2.3.1.174)、β -酮己二酸 CoA 转移酶，pcaIJ(EC2.8.3.6)、3_ 氧代己二酸烯醇内酯水解酶，pcaL(EC3.1.1.24)、4_羧基粘康酸内酯脱羧酶(4_carboxymuconolactonedecarboxylase), pcaL (EC4.1.1.44)、Y -羧基-顺，顺-粘康酸环异构酶，pcaB (EC5.5.1.2)、原儿茶酸-3，4-加双氧酶，pcaGH(ECl.13.11.3)、原儿茶酸 1，2_ 顺-二氢二醇脱氢酶，tpaC(ECl.3.l.n)和对苯二甲酸1，2-双加氧酶，tpaAB (ECl.14.12.15)的活性的工程核酸。在再另一个实施方式中，该细胞包含编码选自于α-D-葡萄糖-6-磷酸酮醇异构酶(alpha-D-glucose-6-phosphate ketol-1somerase)，PGIl (EC5.3.1.9)、D-甘露糖 _6_ 憐酸丽醇异构酶(D-Mannose-6-phosphate ketol-1somerase), din9 (EC5.3.1.8)、D-甘露糖-6-磷酸1，6_磷酸变位酶，atpmm(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶(mannose-l-phosphate guany Iy I transferase), cyt (EC2.7.7.22)、GDP-甘露糖-3, 5_ 差向异构酶，gme (EC5.1.3.18)、半乳糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶，VTC2 (EC2.7.n.n)、L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶，VTC4(EC3.1.3.11)、1^-半乳糖脱氢酶4丨4633670出(:1.1.1.122)和L-半乳糖酸内酯氧化酶，ATGLDH(EC1.3.3.12)的活性的工程核酸。
[0044]在另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于C-16:1硫酯酶，fatB、丙二酸单酰CoA:ACP转酰基酶，fabD、醇还原酶，acrl、脱羰基酶(decarbonylase),cerl的活性以及列于表11中的基因的工程核酸。
[0045]在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于大肠杆菌tesA、大肠杆菌fadD和A.baylyi wax-dgat的基因的工程核酸。
[0046]在一些实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生链烷烃、链烯烃、甲基酯或乙基酷。
[0047]在某些其它实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码MEV途径酶的工程核酸。在一些实施方式中，该MEV途径酶选自于乙酰CoA硫解酶、HMG CoA合成酶、HMG CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和IPP异构酶。
`[0048]在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码DXP途径酶的工程核酸。在相关的实施方式中，该DXP途径酶选自于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶、4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合成酶、4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶、2C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase)、1-羟基 _2_ 甲基-2-(E)- 丁烯基-4-焦磷酸合成酶和异戊基/ 二甲基烯丙基焦磷酸合成酶。
[0049]在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于高柠檬酸合成酶，lys21 (EC2.3.3.14)、高乌头酸酶，lys4, lys3 (EC4.2.1.36)、同分异构柠檬酸(homoisocitrate)脱氧酶，lysl2, lysll, IyslO (ECl.1.1.87)、2_ 氛基己二酸转氛酶，aro8 (EC2.6.1.39)、磷酸甘油酸脱氢酶，serA (EC1.1.1.95)、磷酸丝氨酸转氨酶,serC(EC2.6.1.52)、磷酸丝氨酸磷酸酶，serB(EC3.1.3.3)、丝氨酸O-乙酰基转移酶，AtSerat2 ； I (EC2.3.1.30)、半胱氨酸合成酶，AtlG55880 (EC2.5.1.47)、乙酰乳酸合成酶，ilvN, 11^出02.2.1.6)、乙酰羟酸异构还原酶，ilvC(ECl.1.1.86)、二羟酸脱水酶，ilvD (EC4.2.1.9)、缬氨酸转氨酶，ilvE (EC2.6.1.42)、ACV 合成酶，Ava_1613 (EC6.3.2.26)、异青霉素-N合成酶，Ava_5009(ECl.21.3.1)，将N-[L_5-氨基_5_羧基戊酰基(carboxypentanoyl) ] -L-半胱氨酰_D_缴氨酸和02转化为异青霉素-N、异青霉素-N差向异构酶，cefD(EC5.1.1.17)、头孢菌素生物合成扩环酶/羟化酶，cefEF(ECl.14.20.1，1.14.11.26)和脱乙酰头孢菌素C乙酰基转移酶，cefG(EC2.3.1.175)的活性的核酸。
[0050]在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码醇脱水酶活性(EC4.2.1.η)的核酸。在相关的实施方式中，该醇脱水酶活性选自具有EC编号4.2.1.2、4.2.1.3,4.2.1.4,4.2.1.11,4.2.1.17、4.2.1.55,4.2.1.33,4.2.1.34,4.2.1.35、
4.2.1.54,4.2.1.58,4.2.1.60,4.2.1.68,4.2.1.74 或 4.2.1.79 的醇脱水酶。在再另一个实施方式中，所述醇脱水酶是EC4.2.1.54。
[0051]在再其它的实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生药物或其中间体。在某些相关的实施方式中，所述药物或其中间体以高于每升发酵培养基约lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量产生。
[0052]在更进一步的实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生碳基目的产物，其包含选自于醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、乙基酯、甲基酯、烃、正链烷烃、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、对苯二甲酸盐、多元醇、1，3_丙二醇、1，4_ 丁二醇、PHA,PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε -己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶、乳酸盐、DHA,3-羟基丙酸盐、Y-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、《-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸、柠檬烯、药物或药物中间体、红霉素7-ADCA /头孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇以及ω -脂肪酸的化合物。在某些实施方式中，该细胞产生的类异戊二烯选自于异戊基焦磷酸酯(isopentylpyrophosphate) (IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAP)、单職、倍半職、二職、三萜、四萜和多萜。
[0053]在另外的实施方式中，本发明提供的工程细胞包含的细胞选自于真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、嗜极微生物(extremophile)、酵母、真菌、其工程生物体和合成生物体。在某些相关实施方式中，该细胞是光依赖性的或固定碳。在其他相关的实施方式中，该细胞有自养活性或光合自养活性。在其它实施方式中，该细胞在有光时为光合自养的，和在没有光时为异养的或混合营养的。在其他相关的实施方式中，该工程细胞是选自于拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜属(Beta)、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、藹草属(Phalaris)、杨属(Populus)、甘鹿属(Saccharum)、柳属(Salix)、油錯树属(Simmondsia)和玉蜀黍属(Zea)的植物细胞。在再另外的相关实施方式中，本发明的工程细胞是藻类和/或蓝细菌生物体，选自于剌菊石属(Acanthoceras)、Acanthococcus、Acaryochloris、曲壳藻属(Achnanthes)、翼娃藻属(Achnanthidium)、星形藻属(Actinastrum)、Actinochloris、福环藻属(Actinocyclus)、福射鼓藻属(Actinotaenium)、双金藻属(Amphichrysis)、前沟藻属(Amphidinium)、Amphikrikos、双肋藻属(Amphipleura)、苗形藻属(Amphiprora)、分须藻属(Amphithrix)、双眉藻属(Amphora)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、暗额藻属(Aneumastus)、针连藻属(Ankistrodesmus)、锚藻属(Ankyra)、异菱藻属(Anomoeoneis)、虚幻球藻属(Apatococcus)、束丝藻属(Aphanizomenon)、隐球藻属(Aphanocapsa)、隐毛藻属(Aphanochaete)、隐杆藻属(Aphanothece)、梨囊藻属(Apiocystis)、顶丝藻属(Apistonema)、四棘鼓藻属(Arthrodesmus)、节方定藻属(Artherospira)、Ascochloris、星杆藻属(Asterionella)、星球藻属(Asterococcus)、奥氏藻属(Audouinella)、浮生直链藻属(Aulacoseira)、杆状藻属(Bacillaria)、巴尔比亚藻属(Balbiania)、似竹鼓藻属(Bambusina)、红毛菜属(Bangia)、Basichlamys、串珠藻属(Batrachospermum)、骈胞藻属(Binuclearia)、角藻属(Bitrichia)、盘苔属(Blidingia)、Botrdiopsis、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻属(Botryococcus)、球葡萄藻属(Botryosphaerella)、成胞藻属(Brachiomonas)、短螺旋体属(Brachysira)、海雹菜属(Brachytrichia)、Brebissonia、毛鞘藻属(Bulbochaete)、柱杆藻属(Bumilleria)、拟杆藻属(Bumilleriopsis)、美壁藻属(Caloneis)、眉藻属(Calothrix)、马鞍藻 属(Campylodiscus)、盒管藻属(Capsosiphon)、四鞭藻属(Carteria)、Catena、Cavinula、丁页剌藻属(Centritractus)、Centronella、角藻属(Ceratium)、角毛藻属(Chaetoceros)、Chaetochloris、硬毛藻属(Chaetomorpha)、Chaetonella、毛丝藻属(Chaetonema)、盾毛藻属(Chaetopeltis)、胶毛藻属(Chaetophora)、毛球藻属(Chaetosphaeridlium)、管胞藻属(Chamaesiphon)、轮藻属(Chara)、Characiochloris、拟小粧藻属(Characiopsis)、小粧藻属(Characium)、轮藻目(Charales)、缘胞藻属(Chilomonas)、厚胞藻属(Chlainomonas)、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻属(Chlamydomonas)、ChlamydomonopsiS、衣粘藻属(Chlamydomyxa、Chlamydonephris、Chlorangiella、拟绿囊藻属(Chlorangiopsis)、小球藻属(Chlorella)、绿葡萄藻属(Chlorobotrys)、绿幅藻属(Chlorobrachis)、绿点藻属(Chlorochytrium)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿胶藻属(Chlorogloea)、拟绿胶藻属(Chlorogloeopsis)、绿梭藻属(Chlorogonium)、绿带藻属(Chlorolobion)、拟衣藻属(Chloromonas)、Chlorophysema、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻属(Chlorosaccus)、Chlorosarcina、Choricystis、色植藻属(Chromophyton)、单鞭金藻属(Chromulina)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、色指藻属(Chroodactylon)、蓝隐藻属
【权利要求】
1.一种生物生产乙醇的方法，包括:在光和无机碳的存在下在培养基中培养工程化的光合微生物，其中所述光合微生物包含重组丙酮酸脱羧酶基因和重组醇脱氢酶基因，且其中所述重组丙酮酸脱羧酶基因和所述重组醇脱氢酶基因是差异表达的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中不同的启动子用于实现各重组基因的差异表达。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组基因之一由诱导型启动子控制而所述重组基因之一由组成型启动子调节。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述重组醇脱氢酶基因的表达由组成型启动子调节。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述不同的启动子各自是组成型启动子或诱导型启动子。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组丙酮酸脱羧酶基因的表达由化学物质影响的启动子调节。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述诱导型启动子是nirA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述醇脱氢酶的活性通过控制醇脱氢酶所需的的辅助因子的水平来改变。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述光合微生物是嗜热的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组醇脱氢酶基因编码NADPH-依赖的醇脱氢酶。`
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组醇脱氢酶基因编码穆尔氏菌HUC22-1种 adhA。
12.—种工程化的光合微生物，其包含重组丙酮酸脱羧酶基因和重组醇脱氢酶基因，其中所述重组丙酮酸脱羧酶基因和所述重组醇脱氢酶基因是差异表达的。
13.根据权利要求12所述的工程化的光合微生物，其中不同的启动子用于实现各重组基因的差异表达。
14.根据权利要求12所述的工程化的光合微生物，其中所述光合微生物缺乏具有功能的乳酸脱氢酶基因或乳酸脱氢酶的酶活性。
15.根据权利要求12所述的工程化的光合微生物，其中所述光合微生物就嗜热微生物或聚球藻菌株。
16.根据权利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述重组基因之一由诱导型启动子控制而所述重组基因之一由组成型启动子调节。
17.根据权利要求16所述的工程化的光合微生物，其中所述重组醇脱氢酶基因的表达由组成型启动子调节。
18.根据权利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述不同的启动子各自是组成型启动子或诱导型启动子。
19.根据权利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述重组丙酮酸脱羧酶基因的表达由化学物质影响的启动子调节。
20.根据权利要求19所述的工程化的光合微生物，其中所述诱导型启动子是nirA。
【文档编号】C12P7/06GK103725717SQ201310404380
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2009年9月3日 优先权日:2008年10月17日
【发明者】B·格林, N·雷帕斯, D·罗伯特森 申请人:焦耳无限科技公司