一种高温重组木聚糖酶及其编码基因和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种重组高温木聚糖酶及其编码基因和应用。该高温木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的木聚糖酶，在90℃、pH为6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到109U/mg；该蛋白酶在温度为75℃-100℃、pH为6.0-7.0的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶在65℃、pH6.5下，保温2h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、弱酸性pH条件下木聚糖的降解，具有潜在的工业应用价值。
【专利说明】一种高温重组木聚糖酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】。具体涉及对一种高温重组木聚糖酶基因克隆和表达、耐热及热稳定性好的高温重组木聚糖酶的制备及其在半纤维素降解中的应用。
【背景技术】
[0002]木聚糖广泛存在于自然界，是植物细胞壁的主要组成成分之一，其含量仅次于纤维素，通常占高等植物细胞干重的7%-30%，在被子植物中甚至高30%-35%。目前，对于半纤维素酶的生物化学和分子生物学研究主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶作用于木聚糖主链内的β -1, 4糖苷键产生不同长度的木寡糖短链，能将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。木聚糖酶在饲料、食品、造纸和医药行业等都有极大地应用价值及应用前景。已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉、青霉和木霉等，人们研究和应用最多的是细菌、曲霉和木霉产木聚糖酶。而我国当前的研究工作起步相对较晚，成熟的木聚糖酶产品较少，尤其缺乏能够与规模化生产相适应的高产菌株，因此有必要进一步开展木聚糖酶基因工程菌的构建及其分子改造工作。了解酶的理化性质将有助于未来更好的利用这生物催化酶。
【发明内容】
[0003]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高温木聚糖酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述高温木聚糖酶的基因。本发明还有一目的是提供上述一种高温木聚糖酶的应用。
[0004]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:` 一种高温木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0005]一种编码高温木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]一种表达高温木聚糖酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有SEQ ID N0.2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
[0007]—种扩增编码高温木聚糖酶的基因的方法，所使用的引物对为:
引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ；
引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
[0008]所述的高温木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。酶解反应温度为75-100°C，pH
6.0-7.0。所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。
[0009]所述的重组体系在酶解木聚糖中的应用。
[0010]一种高温木聚糖酶，氨基酸序列为SEQ ID N0.1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明所提供的木聚糖酶具有极强的耐热性能和弱酸性pH条件下高活性的特性，在90°C、pH 6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到109 U/mg ；该蛋白酶在温度为75°C -100°C、pH为6.0-7.0的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶的耐热性能极高，在65°C、pH 6.5的反应体系中，保温2 h酶活稳定。上述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于65°C以上高温、弱酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是木聚糖酶XynlOA-Ol的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图2是XynlOA-Ol活性随温度的变化结果图；
图3是XynlOA-Ol活性随pH的变化结果图；
图4是XynlOA-Ol热稳定变化结果图；
图5是XynlOA-Ol降解榉木木聚糖TLC图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014]以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0015]实施例1木聚糖酶基因Xjwi似-似的制备
可采用如下人工合成的方式制备似-似基因，也可以以Thermotoga thermarum的总DNA为模版通过PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因xynlOA-Ol通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SE Q ID N0.2所示实施例2木聚糖酶基因似-似的亚克隆用下述引物对PCR扩增实施例1中的木聚糖酶基因:
引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ；
引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
[0016]上述引物合成时，引物I引入#而I酶切位点，引物2引入通ο I酶切位点。
[0017]PCR反应体系:IyL 模版 DNA，lyL 引物 l，lyL 引物 2，25 μ L Premix ExTaq,22 μ L超纯水。
[0018]PCR 反应条件:94°C变性 5 min ;94°C 变性 30sec，52°C 退火 30 sec，72°C 延伸 3min, 30 Cycles ;72°C延伸 10 min ;4°C保温。
[0019]PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(B10MIGA，上海)。
[0020]实施例3重组克隆、表达载体pET-20b- F/?7似-似的构建与验证
将纯化过的PCR产物、pET-20b用分别Ndel和ZAo I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收 后的目的片段与载体，经浓缩加入8 μ L无菌水重悬，加入IuL IOXLigase Buffei PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μ g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养10_12h。
[0021]从转化平板上挑取多个单菌落，采用B10MIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入所克隆的目的片段(2385bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b- F/ 似-似。目的片段即为编码木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示，其表达的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，将该蛋白命名为XynlOA-Ol。
[0022]实施例4重组木聚糖酶XynlOA-Ol的表达与纯化
将重组克隆、表达载体pET-20b- 似-似电转至宿主菌疋coli BL21(DE3)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基，在 37°C温度下，200rpm 震荡培养 8_12h。将上述 4mL菌液接种于含400mL培养基的IOOOmL摇瓶中，37°C温度下，200 rpm震荡培养，当吸光度达到0.6-0.8时，加人200μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm诱导表达10_12h。用高速冷冻离心机将培养液在4°C下以13000 rpm离心15min，收集菌体。用40mL超纯水洗涤并在4°C下以13000rpm离心15min,回收菌体,接着用20mL I XBinding Buffer重悬(0.5MNaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole, pH7.9)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4°C下13000rpm离心15min，得到含木聚糖酶XynlOA-Ol的粗提液。
[0023]粗提液先经60°C加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用N1-NTA亲和层析柱进行纯化(方法见His-Bind Kits, Novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，M为蛋白标准品；S1表示IOOmM咪唑洗脱后的蛋白；S2、S3表示200mM咪唑依次洗脱后的蛋白；S4、S5、S6表示400mM咪唑依次洗脱后的蛋白，S7表示400mM咪唑纯化过后的XynlOA-Ol蛋白，分子量约为95kDa。
[0024]实施例5重组木聚糖酶XynlOA-Ol的酶学性质分析
酶活定义为:lmin内催化榉木木聚糖(sigma)产生Iymol木糖所需的酶量。
[0025]( I)最适温度
用PH值为7.0的0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测.定反应体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，90 μ L 0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成；反应体系的pH为7.0。将反应体系在60-100°C温育IOmin后，加入300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定540nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图。结果如图2所示，研究结果表明在90°C时，木聚糖具有最高的酶活性；将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度75-100°C的反应体系中酶活性较高。
[0026](2)最适 pH
酶活性测定体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，ρΗ5.0-8.5的90 μ L 0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和IOyL稀释酶液组成。将反应体系在90°C温育IOmin后，力口Λ 300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定540nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为6.5时，木聚糖酶具有最高的酶活性；将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在PH6.0-7.0的条件下，酶活较高。
[0027](3)重组酶热稳定性
用PH值为6.5的0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶热稳定的反应体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，90 μ L
0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成。将稀释酶液在65°C、75°C、85°C和90°C水浴30、60、90和120min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为6.5，测定温度为90°C。实验设3次重复，取平均值。结果如图4所示，90°C下水浴120min后无酶活，因此图中未标示。研究结果显示，65°C处理2h酶活下降较少，可见该木聚糖酶在65°C条件下热稳定性能优越。
[0028]实施例6重组木聚糖酶XynlOA-Ol的应用研究
重组木聚糖酶XynlOA-Ol对榉木木聚糖的降解研究,具体步骤如下所述:
(I)称取0.05g榉木木聚糖，加入5mL ddH20，配制成1%浓度的榉木木聚糖溶液。
[0029](2)反应体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，90 μ L 0.1M咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和?ο μ L稀释酶液组成，pH6.5，65°C水浴震荡0.5h、lh、2h和3h。
[0030](3)分别收集上述0.5h、lh、2h和3h水解液100 μ L, 13000rpm，20°C条件下离心IOmin,收集上清并于_20°C的冰箱中保存。
[0031](4)配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇:乙酸:水=2:1:1，显色剂为将0.5g的苔黑酚加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2:8)中配制而成。
[0032](5)用毛细吸管蘸取少量的1%的木1-木4糖的混合液及上述样品，分别点至宽度为10cm、长度为20cm的玻璃娃胶板上，点完样后用吹分机吹干并将娃胶板放置于上述展层剂的层析缸中。
[0033](6) 3h后取出玻璃板先风干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100 °c的干燥箱中烘干。
[0034]结果如图5所示，M为木1-木4的标准样品，1、2、3和4分别为0.5h、lh、2h和3h
的水解液。研究结果表明， 重组木聚糖酶XynlOA-Ol可以快速有效地将榉木木聚糖降解为低聚木糖。
【权利要求】
1.一种高温木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—种编码权利要求1所述的高温木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—种表达权利要求1所述的高温木聚糖酶的重组体系，其特征在于:在所述的重组体系上克隆有SEQ ID N0.2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
4.一种扩增权利要求2所述的编码高温木聚糖酶的基因的方法，其特征在于:所使用的引物对为: 引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ； 引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
5.权利要求1所述的高温木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:酶解反应温度为75-100°C，pH6.0-7.0。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。
8.权利要求3所 述的重组体系在酶解木聚糖中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103436510SQ201310391421
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】王飞, 黄颖娟, 时号 申请人:南京林业大学