一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及一种鸭肠炎病毒人工染色体的构建及应用。本发明克隆得到一种鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE质粒，该质粒保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为CCTCC?NO：M2013377。本发明还公开了鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE在重组鸭肠炎病毒包装上的应用。
【专利说明】—种鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物基因工程【技术领域】，具体涉及一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建及其应用。
【背景技术】
[0002]鸭病毒性肠炎(DuckVirus Enteritis, DEV)又名鸭瘟(Duck Plague, DP)，是由鸭肠炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、接触性传染病，各年龄的禽类均可发病。鸭病毒性肠炎在很多国家都有该病的报道，在我国也广泛流行。由于其传播迅速，并且发病和死亡率高，能达50-100%，成鸭甚至在90%以上，已经成为危害养鸭业的主要疫病之一。近几年，陆续有关于鸭肠炎病毒基因组的研究报道；2009年，鸭肠炎病毒基因组序列已经公布并登陆在Genbank (Li Y et al.，2009)，为研究DEV的基因和蛋白功能提供了有力的参考数据。其基因组大小约为150kb，编码78个蛋白质，其中有67个蛋白与α -疱疫病毒有同源性，I个蛋白与Y -疱疫病毒同源,5个与禽疱疫病毒同源。将疱疹病毒的整个基因组克隆到BAC质粒中，然后在细菌中重组其他病毒的具有免疫源性的外源基因，从而构建二价疫苗。
[0003]对于疱疹病毒这样的大基因组病毒(大于lOOkb)，体外操作的难度很大，常规的体外酶切和连接的方法不适合。构建重组病毒的经典方法是将带有目的基因的转移载体与病毒基因组共转染哺乳动物细胞，经细胞内同源重组获得重组病毒。由于存在野生型病毒的干扰，一般需要经过多轮空斑纯化才能筛选得到纯的重组病毒(Domi A etal., 2005; Horsburgh B C et al.，1999)，这是一项极为繁琐的工作，有时还会遇到重组病毒传代不稳定的问题。为了克服这种方法的局限，研究人员尝试在大肠杆菌中直接对病毒基因组进行修饰。首先尝试的 是大肠杆菌Cosmid载体。由于病毒基因很大，而此载体容量有限(约40kb)，必须将病毒基因组分成几段，构成一套重叠的载体，经细胞内的多次同源重组组装成完整的病毒基因组，产生重组毒。Cosmid载体在大肠杆菌中不稳定，共转染的效率低，此外，这些载体在细胞内要经过多次同源重组，其精确性很难保证，发生缺失突变的较高，因而对分离到的重组病毒尚需进一步分析鉴定，不是一种很好的方法。
[0004]在基因组学研究工作的需要下，研究人员开发了一系列适用于大片段克隆的载体和宿主系统，如酵母人工染色体载体(YAC)、大肠杆菌的F因子衍生的细菌人工染色体载体(BAC)和以噬菌体复制子为基础的载体(PAC)。BAC载体可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大肠杆菌中稳定的复制(McGeoch D J et al.，1994)。近年来,一系列大的双链病毒基因组陆续被 BAC 化(Adler H et al., 2000; Borst E M et al., 1999; Azab W etal., 2002; Smith B N et al.，2000)。这些BAC化的病毒基因组转染细胞后，在细胞中能产生感染性病毒粒子，这使得利用细菌的遗传工具操作病毒成为可能。但是，由于某些未知原因，位于基因组中BAC载体部分不太稳定，BAC化的病毒基因组转染细胞后，载体及其两侧病毒基因组序列会发生不同程度的缺失。为了解决这个问题，BAC载体两侧各引入了一个1xP位点,该载体转入表达Cre重组酶的动物细胞中，Cre酶会催化在两个位点之间的重组反应，从而使原核来源的载体骨架部分从病毒基因组上去除，仅留下34bp的1xP的序列，保证了基因组的保真性和完整性，尽可能的避免了原核来源对插入位铬邻近的病毒基因表达的影响，这样利用BAC克隆的细菌遗传工具操作大基因组病毒更趋完善，该方法成功的用于伪狂犬病毒的BAC克隆(Smith G A et al.，2000)。同源重组和位点特异性重组是广泛被用于修饰BAC克隆的方法。RecA同源重组系统是最早为人们熟知的大肠杆菌同源重组系统。然而，由RecA介导的同源重组所需同源区长达1000bp左右，操作的难度大，相对耗时费力，从而使其应用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重组系统可以催化同源反应在20_25bp的同源区间发生，同源重组效率较高(Muyrers J P et al., 2000;MuyrersJ P et al.，2000a)。Red-gam 系统与 RecE/RecT 类似，且重组效率更高(Muyrers J P etal., 2000b; Jamsai D et al.，2003)。至此,人们把这两种重组技术结合起来(Red/ET)实现了直接以PCR产物作为供体分子对目的序列的打靶修饰，可以有效地对BAC克隆上的任意基因进行点突变、插入和缺失等修饰。位点特异性重组是由位点特异性重组酶介导特定位点间的发生位点特异性重组。通用的系统有Pl噬菌体的Cre-1oxP系统(Smith G A etal.，2000)，入噬菌体的 Int-att 系统(Suzuki Y et al.，2005)，和酵母的 Flp-FRT 系统(Cherepanov P P et al.，1995)。位点特异性重组技术祀向性强、重组效率高,也是修饰BAC克隆的有效工具。这整个过程都是在细菌体内进行的，在很大程度上能避免了离体操作对大分子的损伤。2005年，Li M Z et al.开发了一个有效的方法，用于同源重组方法在体内构建重组DNA分子——交配辅助遗传整合克隆(MAGIC) (Li M Z et al.，2005)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，构建一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒，该鸭病毒性肠炎(DEV)疫苗株(C-KCE)的细菌人工染色体质粒，可以利用大肠杆(例如DH10B)以及鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)重新快速拯救出DEV。将外源基因克隆入载体PRThGA后，利用交配辅助遗传整合克隆(即MAGIC方法)重组，即可获得含有外源基因的重组鸭肠炎病毒。
[0006]实现本发明的主要技术方案和步骤如下所述:
[0007](I)将BAC骨架质粒由低拷贝变成多拷贝，以方便后期的操作。
[0008](2)将鸭病毒性肠炎(DEV)的全基因组通过同源重组的方法插入到BAC质粒上。
[0009](3)运用MAGIC的方法将鸭其他病原的免疫源性基因快速稳定的插入DEV中。从而得到一个表达该外源基因的DEV病毒。
[0010](4)利用表达外源基因的DEV病毒控制鸭群中其他病毒和鸭瘟感染的问题。
[0011]更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。
[0012]本发明优点在于:
[0013]1利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体大大缩短了获得重组病毒的周期。[0014]2本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体重组外源基因后对载体进行了剔除，无功能性外源序列插入，对基因组亦无影响，不存在遗传物质发生跨物种转移的可能。
[0015]3利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体重组外源基因可以达到一针同时防两病甚至多种疾病的目的。【专利附图】
【附图说明】
[0016]序列表SEQ ID NO:1是pBlue_Lox空载体序列，序列长度为8284bp。
[0017]序列表SEQ ID NO:2 是 pBlue-UL27-UL26 序列，长度为 12557bp。
[0018]序列表SEQ ID NO:3 是 pCAGGS 的 chicken β -actin promotor-rabbit β -globinPloyA的表达框和同源臂序列，长度为2380bp。
[0019]序列表SEQ ID NO:4是Loxp序列，长度为644bp,从第485_518bp是切除BAC骨架后仅留下一个34bpLoxp位点的序列。
[0020]序列表SEQ ID NO:5是序列表SEQ ID NO:4中切除BAC骨架后仅留下一个Loxp位点的序列，序列长度为34bp。
[0021]序列表SEQ ID NO:6是Pacl酶切线性化的rBAC同源臂载体序列，长度为10717bp
[0022]图1:是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26的构建流程。其中:图1中的左图中的CMV Promoter是CMV启动子；图1中的下图的CMV Promoter是CMV启动子。
[0023]图2:是本发明鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建的流程示意图。
[0024]图3:是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡的成纤维细胞上增殖的示意图。其中:图3A为转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡的成纤维细胞上单独形成空斑的照片；
[0025]图3B为转移载体pBlue-UL27_UL26重组到鸭肠炎病毒上，并且经过多次空斑纯化后在鸡的成纤维细胞增殖的示意图。
[0026]图4:是本发明pRThGA 载体改造成重组质粒pRTHGAl的示意图。其中:图中左上图中的CMV Promoter是CMV启动子；右上图及下中图中的Chicken beta-actin promoter是 Chicken beta-actin 启动子，CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增强子。
[0027]图5:是本发明构建的重组质粒PRTHGA-HA的示例图。其中，图中的Chickenbeta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 的启动子,CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增强子；质粒带有Amp (氨节青霉素)抗性。
[0028]图6:是本发明中所的应用MAGIC方法的示意图。图中供体菌A为Amp (氨苄青霉素)抗性；受体菌B为Kna (卡那霉素)抗体、Cam (氯霉素)抗性和Ara (阿拉伯糖)抗性。
[0029]图7:是运用Western Blot检测DEV-HA表达HA的结果。下图中DEV-HA重组毒株与DEV毒株与内参GAPDH的单抗都发生反应产生明显的条带呈阳性，证明该实验有效。图7的上图中DEV-HA重组毒株与抗HA的单抗发生反应产生明显的条带呈阳性，而DEV毒株则呈阴性，证明DEV-HA重组毒株构建成功。
【具体实施方式】
[0030]实施例1BAC同源臂的构建和多拷贝的形成
[0031]1、鸭病毒性肠炎(DEV)病毒基因组的提取
[0032]将冻存的鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE (购自中国兽医药监察所，该疫苗株C-KCE的基因组 DNA 序列已提交(登录)，登录号为 temporary gene bank accession N0.KF263690)的病变细胞连续冻融3次，4°C 8000rpm离心20min沉淀细胞碎片。收集上清，30% (w/w)蔗糖溶液垫底，4°C 16000rpm离心60min沉淀病毒粒子。弃掉上清，加入双蒸水将病毒粒子悬浮。加入蛋白酶K至终浓度500 μ g/rnL，十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度1%。置56°C水浴lh。将消化后产物用等体积的V(苯酚):V(氯仿)=体积比为1:1和氯仿各抽提一次，16000rpm离心15min。取上清液向其中加入有加入等体积的异丙醇轻轻混匀，_20°C沉淀核酸2h。4°C 16000rpm离心20min沉淀DNA, 70%冷乙醇洗漆一次，回收核酸沉淀,重悬于TER (含有RNA酶的TE)室温作用lOmin，充分消化RNA，消化完毕后用作模板使用。
[0033]2.在UL26和UL27 (UL26和UL27是鸭肠炎病毒的部分基因组序列，GenBank:EU082088.2)之间插入BAC载体:UL26两端引入NOTI和PACI的酶切位点(上下游引物分别为UL26-F和UL26-R，引物具体序列见表1)，UL27两端分别引入Sal I和Pac I的酶切位点(上下游引物分别为UL27-F和UL27-R，引物具体序列见表1)。以C-KCE的基因组为模板将同源臂用PCR扩增下来(UL27的终止子位于正中间)。以ρ⑶NA3.1(湖北大学生命科学院马立新教授赠送)为模板扩增AMP的复制子，并且在两端引入Pac I的酶切位点(上下游引物分别为Amp-F和Amp-R，引物具体序列见表1)。PCR扩增体系=Easy-Taq0.25 μ L ；IOxbuf fer2.5 μ L，dNTP2 μ L，模板2 μ L，上下游引物各I μ L，ddH20补齐25 μ L，混匀后按以下程序进行反应:95°C预变性5min，94°C变性30s，按各引物退火温度，40s，延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸IOmin。
[0034]采用重叠PCR 方法(PCR 扩增体系:Easy_Taq0.25 μ L ； IOxbuffer2.5 μ L,dNTP2 μ L，模板2 μ L，三对上下游引物各I μ L，ddH20补齐25 μ L，混匀后按以下程序进行反应:95°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火，40s，72°C延伸5min，30个循环，最后72°C延伸IOmin)将三者连接在一起，然后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue_lox载体(湖北大学生命科学院马立新教授赠送)上，获得用于重组的BAC载体，将其命名为rBAC载体(上述过程见图1)。
[0035]表1PCR及重叠PCR弓丨物
[0036]
【权利要求】
1.一种包含重组鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE质粒的大肠杆菌DHlOB-1S2/BAC-C-KCE，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013377。
2.权利要求1所述的包含重组鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE质粒的大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE在重组鸭肠炎病毒包装上的应用。
【文档编号】C12N7/01GK103497967SQ201310374703
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】金梅林, 李淑云, 邹忠 申请人:华中农业大学