棉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及棉蚜特异性SS-COI引物以及含有该引物的检测试剂盒，根据棉蚜特有的mtDNA序列，设计了一对棉蚜特异性SS-COI引物LFAgF和LFAgR（SEQ?ID?No.1和2），该对引物仅对棉蚜具有特异性扩增能力，扩增产物大小为300bp，质粒浓度检出限为5.27E+04，DNA浓度检出限为0.179ng/μL。本发明采用SS-COI?PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。
【专利说明】棉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及棉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]棉虫牙(Aphis gossypii Glover),俗称腻虫、蜜虫、油虫,属同翅目，虫牙科,虫牙属，是一种世界性害虫，除西藏外，在全国各地都有发生，其中以黄河流域和西北内陆棉区发生危害较重。棉蚜的寄主范围广泛，全世界已知寄主植物74科285种，我国已记载113种，其中越冬寄主主要为木槿、花椒、石榴、鼠李等，夏季寄主有棉花及瓜类、茄科、豆科、菊科和十字花科植物等。棉蚜的成蚜、若蚜都主要集中在棉叶背面或嫩头吸食汁液。苗期受害，棉叶卷缩，棉株生长发育缓慢，中部叶片出现油叶，叶表蚜虫排泄的蜜露常诱发霉菌滋生，严重时导致蕾铃脱落。
[0003]田间棉蚜有多种捕食性天敌(如瓢虫、草蛉等)，其保护和利用是棉蚜防治的重要措施。其中，明确捕食性天敌对棉蚜的捕食作用，对于分析田间食物链营养关系及筛选优势天敌种类等具有指导意义。天敌捕食关系研究的方法很多，包括直接观察法、解剖观察法、田间系统调查及相关分析、实验种群观察与分析、食痕与标记法等。但是，这些方法都存在相应的缺陷，如:费时、费力、花费较高、不易成功等。
[0004]Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNACOI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。这为天敌对棉蚜捕食作用的定性与定量分析提供了可能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供棉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
[0006]为了实现本发明目的,本发明根据棉蚜的线粒体DNA序列，设计一对棉蚜特异性SS-COI引物，其包括:
[0007]正向引物LFAgF:5’ -CAGATATATCTTTTCCACGAC-3 ’
[0008]反向引物LFAgR: 5 ’ -TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3 ’。
[0009]本发明还提供含有引物LFAgF和LFAgR的用于检测棉蚜的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0010]本发明还提供所述引物LFAgF和LFAgR，以及含有引物LFAgF和LFAgR的试剂盒在检测棉蚜中的应用。`
[0011]本发明还提供一种棉蚜的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤:[0012]I)提取样品DNA;
[0013]2)以步骤I)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFAgF和LFAgR进行PCR扩增反应；
[0014]3)分析PCR产物。
[0015]PCR反应体系以20 μ L计为:
[0016]
模板 DNA1.0pL
2.5mM dNTPs0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L 引物 LFAgF0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L引物LFAgR0.4μ?
5υ/μΙ Easy Taq DNA聚合酶0_2μ?
10 x Easy 缓冲液2.0pL
CldH2O补足至 20,uL。
[0017]PCR反应条件为:94°C 4分钟；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，共45个循环；72 0C I 秒。
[0018]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为300bp的DNA扩增条带(SEQ ID N0.3)，则判定样品为棉蚜。
[0019]本发明根据GenBank中公布的棉蚜COI (AB506730)的一段基因序列，设计一对特异性引物，该引物特异性强，只对棉蚜具有扩增能力，而对棉田中的其它昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测棉蚜，准确性高，可扩增出300bp大小的片段。采用SS-COI PCR技术检测棉蚜，是对RAPD技术、RFLP技术和mtDNA COI检测技术的补充和改进，SS-COI PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为5.27E+04, DNA浓度检出限为0.179ng/ μ L。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1中棉蚜特异性引物LFAgF/LFAgR的PCR检测结果；其中，M:DNA分子量标准2000bp ladder ;1_114为表I中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。
[0021]图2为本发明实施例2中棉蚜特异性引物LFAgF/LFAgR的DNA浓度梯度检测结果；其中，M =DNA分子量标准5000bp ladder ； 1-8为模板DNA浓度179ng/ μ L依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
[0022]图3为本发明实施例2中棉蚜特异性引物LFAgF/LFAgR的质粒浓度梯度检测结果；其中，M =DNA分子量标准2000bp ladder ;1_10为模板质粒浓度5.27E+10依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0024]实施例1引物LFAgF/LFAgR对棉蚜的扩增效果
[0025](I)棉蚜基因组的制备
[0026]将单头姆虫放入1.5mL离心管中将其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生物有限公司，北京)提取单头蚜虫基因组。将DNA溶液储于_20°C备用，进行PCR扩增时吸取I μ L溶液作为DNA模板。
[0027](2)合成检测棉蚜的特异性SS-COI引物
[0028]特异性SS-COI引物序列如下:
[0029]LFAgF:5’-CAGATATATCTTTTCCACGAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0030]LFAgR:5’-TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0031](3) PCR 扩增
[0032]反应体系为20 μ L，包括:10 X EasyTaq 缓冲液 2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、正、反向引物(lOymol/L)各 0.4yL、模板DNA1.0μ L、ddH2015.6μ L。
[0033]PCR扩增程序:94°C预变性4分钟；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，共45个循环；最后72°C延伸I秒。
[0034](4) PCR产物鉴定
[0035]取6 μ L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
[0036](5)结果
[0037]利用引物LFAgF/LFAgR，以棉蚜DNA为模板，以棉蚜同域的59种其他昆虫(见表I)为对照进行Species-Specific-COI PCR扩增，结果如图1所示，3、4泳道对应的棉蚜扩增出了 300bp的目的条带,说明根据棉姆线粒体DNA设计的Species-Specific-COI PCR扩增引物的特异性强。回收上述300bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0038]表I引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
【权利要求】
1.棉蚜特异性SS-COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 LFAgF:5’ -CAGATATATCTTTTCCACGAC-3’ 反向引物 LFAgR:5’ -TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测棉蚜的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测棉蚜中的应用。
6.棉蚜的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品DNA； 2)以步骤I)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFAgF和LFAgR进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μ L计为:
模板 DNA1.C-L
2.5mM dNTPs0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L 引物 LFAgF0.4μΙ.ΙΟμπιοΙ/L引物LFAgR0.4pL
5U/pL Easy Taq DNA聚合酶0.2μ?
10 x Easy 缓冲液2.0μ?ddH20补足至 20μΕ。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为:94°C4分钟；94°C30秒，54°C 30秒，72 °C 30秒，共45个循环；72°C I秒。
【文档编号】C12N15/11GK103436618SQ201310373835
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】王倩, 杨帆, 陆宴辉, 杨益众 申请人:中国农业科学院植物保护研究所