一种耐热裂解酶TSPpgh和编码此酶的多核苷酸的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种耐热裂解酶和编码这种酶的多核苷酸，该裂解酶能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长，其在40～80℃范围内具有催化活性，在66.5℃催化活性最高，其核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株。
【专利说明】—种耐热裂解酶TSPpgh和编码此酶的多核苷酸
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种耐热裂解酶TSPpgh，以及编码此酶的核酸序列。
【背景技术】
[0002]裂解酶为噬菌体感染宿主后表达释放的一类细胞壁水解酶，通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解，并释放出子代噬菌体。根据作用于细胞壁肽聚糖共价键位点不同，可以将卩遼菌体裂解酶分为三类,葡萄糖苷酶(glucoseidase)、酰胺酶(amidase)、内肽酶(endopeptidase)，它们分别水解氨基糖之间的糖苷键，N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键以及肽交联桥。
[0003]目前，很多裂解酶的结构得到了深入研究，分歧杆菌噬菌体裂解酶蛋白分为3个区域，典型的C-端区，与噬菌体内肽酶的C-端细胞壁结合区功能相关；中心区域，包含一个与肽聚糖水解酶相关的结构及N-端区域，常为一系列编码肽酶功能的蛋白，它们每个结构域类型均有明显差别，研究已发现6种可能的N-端肽酶结构区，5种酰胺酶/糖苷酶结构区，和4种C-端细胞壁结合结构区，可能出现的组合至少120种，其中绝大多数结构分布包含一个N-端肽酶结构区，一个中心酰胺酶/胞壁质酶或糖苷转移酶区及C-端区，但是有一个例外，Myrna gp243没有C-端结合区，目前还没有来源于栖热菌高温噬菌体裂解酶的报道。
[0004]近年来，随着抗生素大量滥用，逐渐出现了很多耐药性菌株带来的各种问题，人们迫切需要研究新型的抗菌试剂，而细菌的天敌噬菌体给人们提供了一个全新的思路，使人们逐渐开始多方面探索噬菌体裂解酶的抗菌作用。其中裂解酶作为新型抗菌制剂，能够对细菌进行防治、治疗并具有.独特的优点。首先，噬菌体裂解酶不会对动物产生毒副作用，因为它只能作用于病原菌宿主而对其他细菌不产生作用。其次，噬菌体裂解酶的催化结构作用于病原宿主菌的细胞壁肽聚糖，病菌对它不会产生耐药性，同时能够与抗生素联合用药，共同发挥作用。2001年Nelson等人实验证明通过重组噬菌体裂解酶纯化能够预防和治疗A型链球菌引起的小鼠粘膜感染。裂解酶能高效裂解细菌，可以抑制细菌的生长，使其有望取代传统的抗生素治疗，特别是对多重耐药性致病菌，也可作为抑菌剂使用于环境的杀菌。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种耐热裂解酶TSPpgh，该裂解酶能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长，其在4(T80°C范围内具有催化活性，其来源于栖热菌(Sezmz1S)噬菌体TSP4，该耐热裂解酶TSPpgh的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少90%的相同性的多肽、类似物或衍生物。
[0006]本发明的另一个目的是提供编码耐热裂解酶TSPpgh的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,或其互补序列，或具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少80%相同性的多核苷酸及其互补序列。[0007]本发明的有益效果:
本发明提供的耐热裂解酶能高效裂解细菌，可以抑制细菌的生长，使其有望取代传统的抗生素治疗，特别是对多重耐药性致病菌，也可作为抑菌剂使用于环境的杀菌。
[0008]目前报道的裂解酶多为常温型裂解酶，在常温下具有较高活性，本发明所述裂解酶在4(T80°C范围内均具有催化活性，在66.5°C催化活性最高，可适用于高温环境的杀菌，目前未见来源于高温噬菌体的裂解酶报道，其核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是本发明耐热裂解酶TSPpgh基因PCR产物电泳示意图，其中M代表Marker，泳道I为TSPpgh基因PCR产物，其大小为501bp ；
图2是本发明中重组质粒TSPpgh/pET28a双酶切图谱示意图，其中M代表Marker，泳道I为重组质粒TSPpgh/pET28a双酶切后产生的两个条带；
图3是本发明中耐热裂解酶TSPpgh的蛋白表达检测示意图，其中泳道I为蛋白Marker,泳道2为总蛋白，泳道3为空载pET28a/BL21空载沉淀，泳道4为pET28a_TSPpgh/BL21诱导前沉淀，泳道5为pET28a-TSPpgh/BL21诱导后沉淀，泳道6为pET28a/BL21空载上清，泳道7为pET28a-TSPpgh/BL21诱导前上清，泳道8为pET28a_TSPpgh/BL21诱导后上清；
图4是本发明耐热裂解酶TSPpgh蛋白的纯化结果检测示意图,其中I为蛋白Marker, 2为上柱后500mM的磷酸缓冲液过柱后第二管,3为上柱后500mM的磷酸缓冲液过柱后最后一管，4 为 pET28a/BL21 空载，5、6 为 pET28a_TSPpgh/BL21 诱导后上清，7 为 TSPpgh 总蛋白；图5是本发明中温度对耐热裂.解酶TSPpgh活性的影响结果示意图；
图6是本发明不同pH值对耐热裂解酶TSPpgh活性的影响结果示意图；
图7是本发明耐热裂解酶TSPpgh对Thennusicm菌株生长的影响结果示意图；其中I为TC16原始菌液对照管，2为加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液2h，3为未加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液2h对照管，4为加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液4h，5为未加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液4h对照管，6为加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液6h，7为未加入耐热裂解酶TSPpgh的菌液6h对照管。
[0010]图8是本发明耐热裂解酶TSPpgh对Thermus TC16菌株生长的影响结果示意图；图9是本发明耐热裂解酶TSPpgh的活性检测示意图，其中1、2、3、4为耐热裂解酶
TSPpgh酶液对ThennusTCm的抑菌圈，5代表用灭活的耐热裂解酶TSPpgh对照；
图10是本发明耐热裂解酶TSPpgh作用后的ThennuslCm菌体形态的变化示意图；其中:A为裂解酶作用前的菌体形态；B、C、D为裂解酶作用后的菌体形态；
图11是本发明耐热裂解酶TSPpgh对地衣芽孢杆菌{Bacillus licheniformis) Tamy6菌株，及万.coli菌株生长的影响结果示意图,其中I为未加入耐热裂解酶TSPpgh的大肠杆菌菌液，2为加入耐热裂解酶TSPpgh的大肠杆菌菌液，3为未加入耐热裂解酶TSPpgh的Tamy6菌液，4为加入耐热裂解酶TSPpgh的Tamy6菌株菌液。
【具体实施方式】[0011]下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0012]实施例1:耐热裂解酶TSPpgh的克隆和表达
1、裂解酶基因的扩增，(以Thermusicm的噬菌体TSP4基因组DNA为模板)
(O嗜热噬菌体TSP4裂解酶TSPpgh基因的扩增所用引物序列如下:
正向引物:
【权利要求】
1.一种耐热裂解酶TSPpgh，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.编码权利要求1所述耐热裂解酶TSPpgh的多核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。.
【文档编号】C12N15/60GK103436514SQ201310363245
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】林连兵, 谷丰, 陈美杉, 魏云林, 季秀玲, 张琦 申请人:昆明理工大学