唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法。所述唾液腺组织特异性的转基因载体是通过将小鼠腮腺蛋白启动子上游调控区序列和可视化筛选neo-EGFP融合双标记整合到piggyBac转座系统和Lox-Cre酶系统中构建得到，该转基因载体可使目的蛋白在特定组织表达，实现大片段的高效整合效率；且该载体还具有便于筛选的绿色荧光标记和真核细胞筛选的新霉素抗性基因，使转基因细胞筛选和转基因动物鉴定更简单、直接、准确；本发明的转基因载体是一种唾液腺特异表达高效整合通用载体，可用于转基因小鼠和猪等动物方面转基因应用。本发明首次克隆FVB小鼠上游调控区，克隆方法简单高效，有效克服了大片段载体构建难度。
【专利说明】唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及一种唾液腺组织特异性的高效整合转基因载体及其构建方法，本发明还涉及小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]传统载体构建主要借助基因工程限制性内切酶、T4连接酶以及PCR技术把目的片段连接到相应的载体骨架上，然后经过酶切鉴定，测序验证，完成载体构建。根据实验需要有时需要连接多个片段，常因限制性酶切位点限制，使实验设计越来越困难，载体片段越来越大而导致T4连接酶效率低下，载体构建难度大。因此，传统载体构建技术在大载体(12Kb以上)载体构建方面很难成功。
[0003]腮腺蛋白是腮腺中表达丰度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2号染色体上，在基因组中该基因以单拷贝形式存在，且主要在腮腺特异表达，还有研究显示其在唾液腺的颌下腺和舌下腺也有低表达。研究显示该基因主要是由腮腺蛋白基因的上游调控区(11.5Kb)和下游序列(约2.5~3kb)(即腮腺蛋白启动子PSP)调控的，但其调控基因仅在唾液腺中调控表达，在全身其他组织器官不表达。唾液腺表达外源蛋白的转基因动物原理就是借助腮腺蛋白启动子可以把目的蛋白(酶或者药物)在腮腺、舍下腺以及下颌下腺等唾液腺体经表达后直接分泌到动物唾液中，经口腔进入动物消化道，来发挥其功能。
[0004]小鼠腮腺启动子(PSP)载体应用方面最近的报道还是2001年，由加拿大的学者Serguei P.Golovan在制备环境友好动物时应用的,该载体结构比较简单,仅用植酸酶基因代替原来腮腺蛋白基因，没有筛选标记和荧光标记，整合效率也比较低，且整合进基因组多已头尾串联形式，这种整合模式在基因组内，更容易被沉默和丢失，因为没有筛选标记，该载体只适合原核注射或者ICS`I (胞浆注射)方法生产转基因动物，动物中经济价值较大是猪，但猪受精卵不透明，看不到原核。且猪早期胚胎收集难度大，技术难题大。其载体结构如图1所示。
[0005]2006年由中国农业大学伊海芳构建2个猪腮腺蛋白启动子(PSP)载体，除了载体骨架，这两个载体都采用猪PSP部分上游调控区序列(IOkb)连接植酸酶基因，其差异在其后面加尾信号:一个是bGH-pA ;另一个是猪腮腺蛋白PSP下游的Poly-PA。这两个载体都带一个药物筛选基因neo。虽然这两个载体可以进行药物筛选，但没有可视标记，对筛选转基因细胞很难确认，仍是传统载体，其整合模式与Serguei P.Golovan构建小鼠腿腺蛋白载体类似。但猪腮腺蛋白启动子由于其研究还不够透彻，目前分析，在其上游IOKb调控区内，调控元件不全，可能在其它区域还存在其它增强子区，导致其下游蛋白酶基因表达量低。2个猪腮腺蛋白启动子(PSP)载体结构如图2所示。
【发明内容】
[0006]基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法。
[0007]为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0008]一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，包括以下步骤:
[0009](I)、分别以质粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175_CAGGS_EGFP 为模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3 μ L混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I双酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体；
[0010](2)、以质粒 pPB-UbC-EGFP-neo 为模板，分别以 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作为引物，进行 PCR 扩增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分别采用Not I和Xho I酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体 pPSPBGPneo-PB-XynB ；
[0011](3)、以步骤(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作为引物进行 PCR扩增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切胶纯化；用Cla I和Bgl II双酶切步骤⑵得到的载体pPSPBGPneo-PB-XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个1xp 位点中间，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体；
[0012](4)、以步骤(3)得到的 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体为模板，SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB-lox—neoEGFP—loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；
[0013](5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID N0:17和SEQID勵:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游400%?片段，将400%?片段与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-`loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体I ;
[0014](6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体I的StuI位点，即为中间载体2 ；
[0015](7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID N0:21和SEQ ID NO: 22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤出)的中间载体2上，得到载体pPB-MusPSP-neo-EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。
[0016]在其中一个实施例中，所述步骤(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段的克隆方法为:以FVB小鼠基因组DNA为模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2为引物，KOD-FX聚合酶进行第一次PCR扩增；以第一次扩增的产物为模板，SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4为引物，进行第二次PCR扩增，即得。
[0017]在其中一个实施例中，所述步骤(5)-(7)中第一次PCR扩增的反应程序为:94°C2min ；98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 70 °C13min, 5cycles ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min ;所述第二次 PCR 扩增的反应程序为:94°C 2min ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
[0018]在其中一个实施例中，步骤(1)中所述第一次PCR的反应程序为:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 50s，35 个循环；72°C IOmin ;第二次 PCR 反应程序:98°C 2min ；98°C 10s,68°C lmin40s，35 个循环；72°C IOmin0
[0019]在其中一个实施例中，步骤(2)中所述PCR的反应程序为:94°C 30s ；55°C 30s, 35个循环；72°C 30s, 72°C 3min，30个循环；步骤(3)中所述PCR的反应程序为:98°C 2min ；98 °C 10s, 68 °C 4min，35个循环；72°C IOmin ;步骤(4)-(7)中所述PCR的反应程序为:980C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min; 35 个循环；72°C 2min。
[0020]本发明还提供了上述构建方法构建得到的唾液腺组织特异性的转基因载体。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0022]1、本发明的唾液腺组织特异性的转基因载体是通过将小鼠腮腺蛋白启动子(MusPSP)上游12.1kb的上游调控区序列和可视化筛选neo-EGFP融合双标记整合到piggyBac高效转座系统和Lox-Cre酶系统中而构建得到的,该转基因载体可以实现目的蛋白在特定组织表达(具有在小鼠，猪等动物腮腺特异表达的能力)，可在转座酶辅助下实现大片段(IOkb以上)的高效整合效率；且该载体还具有便于筛选的绿色荧光标记EGFP和真核细胞筛选的neo新霉素抗性基因，使转基因细胞筛选和转基因动物鉴定更简单、直接、准确；同时考虑公众对筛选标记安全担忧，该标记又可以借助loxP-cre酶系统一次性精确测定删除。只需要把目的基因插入本发明的转基因载体中ASCI位点，就可以用于转基因动物小鼠和猪等动物生产，具有简单，方便，安全的特点。
[0023]2、本发明的转基因载体是一种唾液腺特异表达高效整合通用载体，可用于转基因小鼠和猪等动物方面转基因应用，既可以用于传统的原核注射，胞浆注射，又可以用于体细胞克隆细胞系筛选等，与现代转基因平台有很好的兼容性。
[0024]3、本发明通过4片段重组方法，即利用多对重叠引物对大片段序列扩增，将其人为打断后，利用扩增片段产生的同源重组接头，在重组酶辅助下，一段段重组在一起，首次克隆FVB小鼠上游调控区，并克隆到载体中，经测序，该调控区不同于文献报道的调控区。该克隆方法简单高效，在技术上有效克服了大片段载体(12Kb以上)构建难度。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为Serguei P.Golovan构建的转植酸酶载体；
[0026]图2为中国农业大学伊海芳(2006)构建的两个猪腮腺蛋白转基因载体；
[0027]图3为本发明实施例1的pPB-MusPSP-neoEGFP载体的构建示意图；
[0028]图4为实施例1中克隆得到的MusPSP的PCR图谱，其中A为MusPSP上游调控区克隆(_11503bp ~+1390bp) ;B 为 MusPSP 上游调控区克隆(_11325bp ~+980bp)；
[0029]图5为实施例1中Neo-T2A-EGFP的酶切鉴定电泳图，其中1、2、3分别代表T2A-EGFP (765bp)，neo-T2A (835bp)，neo-T2A_EGFP (1600bp)；
[0030]图6为实施例1中pcDNA-Neo-T2A-EGFP的酶切鉴定电泳图，其中1、2代表pcDNA-Neo-T2A-EGFP的目的条带1590bp，3代表1和2的质粒对照；
[0031 ] 图7为实施例1中pPSPBGPneo-PB- XynB载体的酶切鉴定电泳图，其中M代表Marker2000 ; 1、2 为 pPSPBGPneo-PB-XynB 质粒对照，3、4 分别代表该质粒 Xho I 和 Not I 的酶切结果；
[0032]图8为实施例1中pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB载体的酶切鉴定电泳图，其中M 代表 DL DNA15000Marker ;泳带 I 代表 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB 载体质粒对照，2、3代表1的酶切结果，箭头所指为目的条带2935bp ；
[0033]图9为实施例1中小鼠腮腺蛋白上游调控区(MusPSP)克隆的构建示意图；
[0034]图10为实施例1中MusPSP调控区片段l(-3143bp~+865bp)克隆质粒AscI，NotI酶切鉴定图谱；其中带1，2，3，4，5为不同克隆酶切鉴定，箭头指示目的带；
[0035]图11为实施例1中MusPSP调控区片段2 (_7849bp~-3143) Agel、stul酶切鉴定图谱；其中带1，2，3为不同克隆株酶切鉴定；
[0036]图12为实施例1中MusPSP调控区片段3 (_11805pb~_7849bp)AgeI酶切鉴定图谱；其中带1，2，3，4为不同克隆酶切鉴定；
[0037]图13为实施例2中利用pPB-MusPSP-neoEGFP载体转染PEF细胞筛选结果对比分析；上图照片为40倍镜下，分别在488nm波长激发光下(左图)和普通光下(右图)的观测结果，C1、C2、Z3、Z4代表各组转染对应的观测结果；其中，C1、C2分别为单质粒转染对照I (环状质粒转染)和单质粒转染对照2 (线性化质粒转染)；Z3、Z4为双质粒共转染的各组；
[0038]图14为实施例2中pPB-MusPSP-neo-EGFP载体转染效率分析图。
【具体实施方式】
[0039]以下结合具体实施例来详细说明本发明。
[0040]以下实施例中所使用的引物均是委托上海生工生物技术有限公司合成的。
[0041]实施例1唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法
[0042]请参阅图3，为本发明的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方案图，包括以下步骤:
[0043](I)、小鼠腮腺蛋白上游调控区(PSP)的克隆(包括腮腺蛋白转录起始位点及第一内含子)
[0044]取FVB品系小鼠尾组织样品，抽提其基因组DNA，接着以FVB小鼠基因组DNA为模板，采用KOD-FX聚合酶(Τ0Υ0Β0，日本)进行PCR扩增。首先采用引物mpsp3497-Fl (SEQ IDNO:1), mpspl6390-Rl(SEQ ID NO:2)进行第一次PCR扩增，得到小鼠腮腺蛋白上游调控区(_11503bp~+1390bp)，结果如图4A所示；然后采用嵌套引物mPSP-3675_F2 (SEQ ID NO: 3)和mPSP-15980-R2(SEQ ID NO: 4)，以第一次扩增的产物为模板，进行第二次PCR扩增，扩增小鼠腮腺蛋白区域(_11325bp~+980bp)，结果如图4B所示，得到克隆FVB品系腮腺蛋白上游调控区MusPSP，其中引物序列如表1所示，MusPSP与文献报道的序列对比的分析结果见表2。经与NCBI中提交的鼠PSP腮腺蛋白上游调控区增强子区(U73190.1, X68699.1)序列比对分析，两个增强子区相识性达99%，核心启动子区(转录起始位点上游300bp)与小鼠数据库(UCSC)比对结果完全一致，分析结果显示本研究获得MusPSP调控区与Golovan，S.P等(2001)制备转基因猪和小鼠采用的腮腺蛋白上游调控区并不是同一来源的。
[0045]表1小鼠腮腺蛋白上游调控区(PSP)的克隆引物
【权利要求】
1.一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、分别以质粒PCDNA3.1(+)和 PT2AL200R175-CAGGS-EGFP 为模板，SEQ ID NO: 5 和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5_3 μ L混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I双酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体； (2)、以质粒pPB-UbC-EGFP-neo 为模板，分别以 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作为引物，进行 PCR 扩增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分别采用Not I和Xho I酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体 pPSPBGPneo-PB-XynB ； (3)、以步骤(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作为引物进行 PCR 扩增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切胶纯化；用Cla I和Bgl II双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo-PB-XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个1xp 位点中间，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体； (4)、以步骤(3)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体为模板，SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架； (5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQID NO: 17和SEQ IDNO: 18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体I ; (6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQID NO: 19和SEQID N0:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体I的StuI位点，即为中间载体2 ； (7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQID N0:21和SEQID NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体2上，得到载体pPB-MusPSP-neo-EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。
2.根据权利要求1所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段的克隆方法为:以FVB小鼠基因组DNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2为引物，KOD-FX聚合酶进行第一次PCR扩增；以第一次扩增的产物为模板，SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4为引物，进行第二次PCR扩增，即得。
3.根据权利要求2所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，所述第一次 PCR 扩增的反应程序为:94°C 2min ;98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 70 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 68 °C13min, 30cycles ；68 °C 7min ;所述第二次 PCR 扩增的反应程序为:94 °C 2min ；98 °C10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
4.根据权利要求1所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一次PCR的反应程序为:98°C 2min ；98°C 10s,68°C 50s，35个循环；72°C IOmin ;第二次 PCR 反应程序:98°C 2min ；98°C 10s，68°C lmin40s，35 个循环；72°CIOmin0
5.根据权利要求1所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述 PCR 的反应程序为:94°C 30s ；55°C 30s，35 个循环；72°C 30s, 72°C min，30个循环；步骤⑶中所述PCR的反应程序为:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 4min，35个循环；72°C IOmin ;步骤(4)-(7)中所述 PCR 的反应程序为:98°C Imin ；98°C IOs ；60°
C 5s;72°C 2min;35 个循环；72°C 2min。
6.权利要求1-5任一项所述的构建方法构建得到的唾液腺组织特异性的转基因载体。
【文档编号】C12N15/66GK103509812SQ201310343067
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】张献伟, 吴珍芳, 李紫聪, 刘德武 申请人:吴珍芳, 李紫聪