一种岩藻聚糖硫酸酯酶活力的测定方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种重复性好，相对简便的FUCenzyme酶活力测定方法，解决目前FUCenzyme酶活力测定重复性差的问题，可为FUCenzyme的分离纯化奠定基础。本发明涉及一种FUCenzyme酶活力测定方法，包括1）酶活力测定反应体系的建立：2）还原糖含量的测定和3）酶活力的计算步骤。
【专利说明】一种岩藻聚糖硫酸酯酶活力的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶活检测【技术领域】，具体涉及一种岩藻聚糖硫酸酯酶活力的测定方法。
【背景技术】
[0002]岩藻聚糖硫酸酯酶(FUCenzyme)是能够降解岩藻聚糖硫酸酯的酶类的总称，由于其作用的专一性和高效性成为降解岩藻聚糖硫酸酯的最理想的工具。
[0003]由于对FUCenzyme的研究还不够深入，目前还没有统一的FUCenzyme酶活力测定方法，研究者都是根据各自培养体系的特点进行设计。其中应用最多的方法是将酶和底物在一定条件下反应一定时间，通过产物的还原糖生成量计算酶活力。其中还原糖的测定方法通常使用Somogy1-Nelson法，但是该方法具有操作过程过于繁琐、重复性较差等缺点，导致FUCenzyme酶活力测定结果稳定性不好。因此，急需建立一种更加简便、重复性更好的FUCenzyme酶活力测定方法·。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种重复性好，相对简便的FUCenzyme酶活力测定方法，解决目前FUCenzyme酶活力测定重复性差的问题,可为FUCenzyme的分离纯化奠定基础。
[0005]本发明涉及一种FUCenzyme酶活力测定方法,包括如下的步骤:
[0006]I)酶活力测定反应体系的建立:
[0007]将待测酶样品与底物等体积混合，置于水浴恒温振荡器进行酶催化反应，反应结束后将待测酶样品进行灭活，离心后取上清液作为样品上清液；
[0008]将待测酶样品灭活后，与底物在水浴恒温振荡器进行反应，反应结束后离心取上清液作为空白上清液；
[0009]2)还原糖含量的测定:
[0010]取步骤I)的样品上清液和空白上清液分别加入铁氰化钾工作液，在80°C水浴反应，反应结束后进行离心，取上清液在420nm测定吸光度；将测得的吸光度的值代入还原糖标准曲线，计算出样品上清液和空白上清液中还原糖含量；
[0011]3)酶活力的计算:按照下述公式计算酶活力，
[0012]Y=5 X 1000 X (X1- X0) /2
[0013]其中:Y (U/mL):样品酶活力；
[0014]X0 ( μ mol/mL):空白上清液中还原糖的含量；
[0015]X1 ( μ mol/mL):样品上清液中还原糖的含量。
[0016]步骤I)中的底物为岩藻聚糖硫酸酯；
[0017]步骤2)中的铁氰化钾工作液，其一种制备方法如下:取铁氰化钾1.Sg，加入30g无水碳酸钠，用蒸懼水定容至IL完成制备。
[0018]其中铁氰化钾工作液与样品上清液和空白上清液的体积比分别为1:1。[0019]本发明给出了一种新的FUCenzyme酶活力测定方法，该方法更加简便，重复性好。该方法可以应用到FUCenzyme的分离纯化过程,为获得纯化的FUCenzyme奠定基础。因此，本发明的方法具有很好的推广应用前景。
【具体实施方式】
[0020]本发明涉及一种FUCenzyme酶活力的测定方法,包括如下步骤:
[0021]I)酶活力测定反应体系的建立
[0022]将待测酶样品ImL与ImL 0.2%海带岩藻聚糖硫酸酯(用20mmol/L pH8.0Tris-HCl配制)混合，在30°C、120rpm的水浴恒温振荡器反应2h，80°C灭酶20min，在IOOOOrpm离心lOmin，作为样品上清液备用。空白为先将待测酶样品于80°C灭酶20min后再进行上述操作，制备空白上清液。
[0023]2)还原糖含量的测定
[0024]①还原糖标准曲线的绘制
[0025]取11 支试管分别加入 200 μ g/mL 岩藻糖 0、0.05,0.1、0.15,0.2、0.25,0.3、0.35、
·0.4、0.45,0.5mL，再用蒸馏水将每支试管的液体总量补至0.5mL，取各支试管液体0.5mL加入铁氰化钾工作液0.5mL,在80°C水浴反应15min，室温冷却后加入2mL蒸馏水混匀，在IOOOOrpm离心lOmin，取上清液在420nm测定吸光度。以吸光度为横坐标，岩藻糖含量为纵坐标绘制标准曲线。
[0026]②取样品上清液和空白上清液各0.5mL加入铁氰化钾工作液0.5mL,在80°C水浴反应15min,室温冷却后加入2mL蒸懼水混勻，在IOOOOrpm离心IOmin,取上清液在420nm测定吸光度，按照标准曲线分别计算样品和空白的还原糖含量。
[0027]3)酶活力的计算
[0028]酶活力单位定义为30°C、pH值8.0条件下每小时释放Inmol岩藻糖需要的酶量。FUCenzyme酶活力计算公式如下:
[0029]Y=5 X 1000 X (X1- X0) /2
[0030]Y (U/mL):样品酶活力；
[0031]X0 ( μ mol/mL):空白上清液中还原糖的含量；
[0032]X1 ( μ mol/mL):样品上清液中还原糖的含量；
[0033]实施例1:微生物发酵液中FUCenzyme酶活力的测定
[0034]I)酶活力测定反应体系的建立
[0035]将待测酶样品ImL与ImL 0.2%海带岩藻聚糖硫酸酯(用20mmol/L pH8.0
[0036]Tris-HCl配制)混合，在30°C、120rpm的水浴恒温振荡器反应2h，80°C灭酶20min，在IOOOOrpm离心lOmin，作为样品上清液备用。空白为先将待测酶样品于80°C灭酶20min后再进行上述操作，制备空白上清液。
[0037]2)还原糖含量的测定
[0038]①还原糖标准曲线的绘制
[0039]取11 支试管分别加入 200 μ g/mL 岩藻糖 0、0.05,0.1、0.15,0.2、0.25,0.3、0.35、
0.4、0.45,0.5mL，再用蒸馏水将每支试管的液体总量补至0.5mL，取各支试管液体0.5mL加入铁氰化钾工作液0.5mL,在80°C水浴反应15min，室温冷却后加入2mL蒸馏水混匀，在IOOOOrpm离心lOmin，取上清液在420nm测定吸光度。以吸光度为横坐标，岩藻糖含量为纵坐标绘制标准曲线。
[0040]②样品还原糖含量的测定
[0041]取样品上清液和空白上清液各0.5mL加入铁氰化钾工作液0.5mL，在80°C水浴反应15min,室温冷却后加入2mL蒸懼水混勻，在IOOOOrpm离心IOmin,取上清液在420nm测定吸光度，按照标准曲线分别计算样品和空白的还原糖含量。
[0042]3)酶活力的测定及计算
[0043]酶活力单位定义为30°C、pH8.0条件下每小时释放Inmol岩藻糖需要的酶量。试验作三个平行，原始数据及酶活力计算结果见表I。
[0044]表I发酵液酶活力测定原始数据及计算结果
[0045]
【权利要求】
1.一种FUCenzyme酶活力测定方法,包括如下的步骤: O酶活力测定反应体系的建立: 将待测酶样品与底物等体积混合，置于水浴恒温振荡器进行酶催化反应，反应结束后将待测酶样品进行灭活，离心后取上清液作为样品上清液； 将待测酶样品灭活后，与底物在水浴恒温振荡器进行反应，反应结束后离心取上清液作为空白上清液； 2)还原糖含量的测定: 取步骤I)的样品上清液和空白上清液分别加入铁氰化钾工作液，在80°C水浴反应，反应结束后进行离心，取上清液在420nm测定吸光度；将测得的吸光度的值代入还原糖标准曲线，计算出样品上清液和空白上清液中还原糖含量； 3)酶活力的计算:按照下述公式计算酶活力，
Y=5X 1000X (X1-X0) /2 其中:Y (U/mL):样品酶活力； X0 ( μ mol/mL):空白上清液中还原糖的含量； X1 ( μ mol/mL):样品上清液中还原糖的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的步骤I)中的底物为岩藻聚糖硫酸酯。.
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的步骤2)中的铁氰化钾工作液，其一种制备方法如下:取铁氰化钾1.8g，加入30g无水碳酸钠，用蒸馏水定容至IL完成制备。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的步骤2)中铁氰化钾工作液与样品上清液和空白上清液的体积比分别为1:1。
【文档编号】C12Q1/44GK103436592SQ201310312676
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年7月22日
【发明者】李八方, 王莹 申请人:中国海洋大学