一种同步检测5种植物病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同步检测5种植物病毒的方法，该方法包括植物总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测确定病毒种类。通过设计5种病毒的特异性引物，对引物浓度及PCR反应条件进行优化，实现了同步检测5种植物病毒。本发明检测方法快速准确，避免了普通PCR检测的重复性，检测稳定性好，特异性强，适用于对植物样品进行快速检测，从而指导作物生产，减少病害损失。
【专利说明】—种同步检测5种植物病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒检测【技术领域】，特别是涉及一种同步检测5种植物病毒的方法。
【背景技术】[0002]植物病毒作为重要的病原物，其引起的病害数量占植物病害的第2位，在全世界范围内可引起多种植物严重的病毒病。侵染植物的病毒种类繁多，其中，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic Firw1S, TMV)、黄瓜花叶病毒?麗xsaic Firw1S, CMV)、完菁花叶病毒(Jurnip mosaic virus，TuMV)、马铃薯 Y 病毒(Zbiaio virus Y, PVY)和马铃薯 X 病毒(.Potato Z，PVX)是为害蔬菜、烟草及果树的主要病毒种类，危害严重。以黄瓜花叶病毒(CMV)为例，其能侵染包括单、双子叶植物在内的1000多种植物，是部分农作物的重要毁灭性病原之一。CMV可严重抑制许多作物的正常生长，如引起黄瓜叶片花叶黄化、番茄叶片丝状畸形、香蕉花叶(心腐)、辣椒叶片斑驳畸形等症状，对世界各国的农作物生产造成严重的经济损失。因而，建立这几种重要的植物常见病毒准确快速的检测方法是有效控制和预防农作物病毒病大发生，减少经济损失的最有效手段。
[0003]目前，植物病毒的检测技术主要有3种:生物学鉴定、免疫学鉴定及核酸鉴定。其中，以核酸鉴定法最准确，最灵敏，操作也相对简便。自1988年Chamberlain等首先报道用多重PCR诊断杜式肌营养不良症(DMD)以来，至今已有大量文献报道针对动物尤其是人类疾病的检测，而在植物病理学研究中，对多重PCR技术的研究应用却相对较少。目前，生产上常用的植物病毒检测方法为ELISA，准确性和灵敏度不高。而且研究发现，目前田间植物上病毒复合侵染现象普遍，且类型复杂，如果利用常规的单一 RT-PCR技术需要多次重复实验，逐一检测各种病毒，不仅耗时长，而且成本高。上述5种植物常见病毒的多重RT-PCR检测体系未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种同步检测5种植物病毒的方法，该方法包括植物总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应和电泳检测确定病毒种类等。5种植物病毒为:烟草花叶病毒{Tobacco mosaic Firw1S, TMV)、黄瓜花叶病毒{Cucumber mosaicvirus，CMV)、马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)、马铃薯 X 病毒(Potato virus X, PVX)及完菁花叶病毒mosaic virus, TuMV)0
[0005]本发明所述的一种同步检测5种植物病毒的方法，通过以下步骤实现:
(1)取待测植物叶片，提取总RNA，以提取的总RNA为模板，反转录为cDNA；
(2)以cDNA为模板，采用5对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物，反应体系为:2.5yL 10XPCR buffer (Mg2+ free) ,0.6 μ L rragDNA 酶(5U/μ L)，3 μ L dNTPMixture (2.5mmol/L) ,2μ L MgCl2 (25mmol/L), 0.5 μ L TMV-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ LTMV-R 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ L CMV-F 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ L CMV-R 引物(20 μ mol/L) ,0.5μ L TuMV-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L TuMV-R 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L PVX-F 引物(20ymol/L)，0.5yL PVX-R 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L PVY-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ LPVY-R引物(20 μ mol/L)，5 μ L反转录产物作为cDNA模板，其余用ddH20补充至25 μ L ;反应程序为:94°C预变性3min后开始以下循环反应:94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸100s，35个循环结束后，72°C延伸IOmin ；
(3)用TAE电泳缓冲液配制I %琼脂糖凝胶，取8 μ L PCR产物在水平电泳槽中进行电泳，120V/100mA电泳35分钟，根据条带图判定病毒种类。
[0006]步骤(2)多重RT-PCR反应所用5对弓丨物分别为:
第I对引物:
CMV-F:5’-GATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3’
CMV-R:5，-GCTCGATGTCGACATGAAGT-3，
第2对引物:
TuMV-F:5’-GTGCATTGAGAACGGAACCTC-3’
TuMV-R:5’-GATTAACG TCCTCGGTCGTATG-3’
第3对引物:
PVX-F:5’-GGATCCATGACTGCACCAGCTAGC-3’
PVX-R:5’-GAATTCTGGTGGTGGTAGAGTGAC-3’
第4对引物:
PVY-F:5’-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3’
PVY-R:5’-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3’
第5对引物:
TMV-F:5’-CAGCTGCTATTGACCTTGAAAC-3’
TMV-R:5’-CAATATCAATGATGCCAGAC-3’。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为5种植物病毒多重RT-PCR同步检测的电泳结果 M:DL2000 ;N:阴性对照；1:CMV+TuMV+PVX+PVY+TMV ；
2:CMV ；3:TuMV ；4:PVX ；5:PVY ；6:TMV
图2为多重RT-PCR同步检测6种田间植物的电泳结果
M:DL2000 ；N:阴性对照；1:白菜(CMV+TuMV) ；2:烟草(TuMV+PVX+TMV) ;3:番茄(PVY+TMV) ；4:马铃薯(PVY) ；5:辣椒(PVX+TMV) ；6:南瓜(PVY)
本发明的优点是:
本发明所述方法较ELISA具有更高的准确性和灵敏性，其检测灵敏度可达ELISA检测灵敏度的一万倍以上。应用本发明方法可同时检测5种病毒，与单一 PCR检测相比，操作量大大减少，检测效率得以较大提高，可显著降低试验成本，缩短实验时间。
【具体实施方式】
[0008]取白菜、烟草、番茄、马铃薯、辣椒和南瓜等6个植物样品，按本发明方法实施检测，结果如图2所示。从图中可以明确判定每个样品受侵染的病毒种类，证实了本发明方法用于同步检测5种植物病毒的可行性和准确性。
[0009]具体操作步骤:
(I)总RNA提取
对6个植物样品分别取0.1g新鲜叶片，按照试剂盒(RNAiso? Plus，TaKaRa)方法提取总 RNA。
[0010](2)多重 RT-PCR
以提取的总RNA为模板,采用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit, TaKaRa公司)合成第一链 cDNA，反转录体系为 10yL:2.5yL 总 RNA，2yL 5 X PrimeScript Buffer,0.5 μ L Oligo dT Primer,0.5 μ L Random 6 mers,0.5 μ L PrimeScript RT Enzyme Mix I,4μ L RNase Free dH20，反应程序为:37°C 15min,85°C 20s ；
以上述cDNA为模板，采用前述5对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物，反应体系为:2.5yL 10XPCR buffer (Mg2+ free), 0.6 μ L rT^DNA 酶(5U/μ L)，3 μ L dNTPMixture (2.5mmol/L) ,2μ L MgCl2 (25mmol/L), 0.5 μ L TMV-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ LTMV-R 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ L CMV-F 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ L CMV-R 引物(20 μ mol/L) ,0.5μ L TuMV-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L TuMV-R 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L PVX-F 引物(20ymol/L)，0.5yL PVX-R 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L PVY-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ LPVY-R引物(20 μ mol/L)，5 μ L反转录产物作为cDNA模板，其余用ddH20补充至25 μ L ；反应程序为:94 °C预变性3min后开始以下循环反应:94 °C变性45s，58 °C退火45s，72°C延伸100s，35个循环结束后，72°C延伸lOmin。
[0011](3)电泳检测
用TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，取8μ L PCR产物在水平电泳槽中进行电泳。120V/100mA电泳35分钟，根据条带图判定病毒种类。
[0012]下表为引物序列的信息。
【权利要求】
1.一种同步检测5种植物病毒的方法，其特征在于通过以下步骤实现: (1)取待测植物叶片，提取总RNA，以提取的总RNA为模板，反转录为cDNA； (2)以cDNA为模板，采用下列5对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物； 第I对引物:
CMV-F:5’-GATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3’
CMV-R:5，-GCTCGATGTCGACATGAAGT-3， 第2对引物:
TuMV-F:5’-GTGCATTGAGAACGGAACCTC-3’
TuMV-R:5’-GATTAACGTCCTCGGTCGTATG-3’ 第3对引物:
PVX-F:5’-GGATCCATGACTGCACCAGCTAGC-3’
PVX-R:5’-GAATTCTGGTGGTGGTAGAGTGAC-3’ 第4对引物:
PVY-F:5’-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3’
PVY-R:5’-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3’ 第5对引物:
TMV-F:5’-CAGCTGCTATTGACCTTGAAAC-3’
TMV-R:5’-CAATATCAATGATGCCAGAC-3’ (3)用TAE电泳缓冲液配制I%琼脂糖凝胶，取8 μ L PCR产物在水平电泳槽中进行电泳，120V/100mA电泳35分钟，根据条带图判定病毒种类； 5种植物病毒为:烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV )、黄瓜花叶病毒{Cucumber mosaic Firw1S, CMV)、完菁花叶病毒(Ttfrai/? mosaic Firw1S, TuMV)、马铃薯 Y 病毒(Zbiaio virus Y, PVY)和马铃薯 X 病毒(/biaio virus X, PVX)。
2.根据权利要求1所述的一种同步检测5种植物病毒的方法，其特征在于步骤(2)多重 PCR 扩增反应体系为:2.5μ L IOXPCR buffer (Mg2+free)，0.6 μ L r/i^DNA 酶(5U/μ L)，.3μ L dNTP Mixture (2.5mmol/L) ,2μ L MgCl2 (25mmol/L)，0.5 μ L TMV-F 引物(20 μ mol/L) ,0.5μ L TMV-R 引物(20ymol/L),0.5yL CMV-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L CMV-R 引物(20ymol/L),0.5yL TuMV-F 引物(20 μ mol/L), 0.5yL TuMV-R 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ LPVX-F 引物(20ymol/L),0.5yL PVX-R 引物(20 μ mol/L), 0.5 μ L PVY-F 引物(20 μ mol/L)，0.5 μ L PVY-R引物(20 μ mol/L)，5 μ L反转录产物作为cDNA模板，其余用ddH20补充至.25 μ L ;反应程序为:94°C预变性3min后开始以下循环反应:94°C变性45s，58°C退火45s，.72°C延伸100s，35个循环结束后，72°C延伸lOmin。
【文档编号】C12Q1/70GK103540681SQ201310274031
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】杨会房, 青玲, 王春艳, 刘陈晨, 孙现超 申请人:西南大学