专利名称：一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，属于生物检测领域。
背景技术：
猪圆环病毒(porcine circovirus type2, PCV-2)属于圆环病毒科，直径仅为17nm，无囊膜，二十面体对称，共价闭合环状单股DNA病毒。PCV-2是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，该病自1991年在加拿大猪群中首次爆发以后，在全球各国猪群中广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV-2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPs)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)和猪巴氏杆菌(swinepasteurellosis, Sp)等诸多病原并发或继发感染，增加了其防治难度。除了引起PMWS以外，PCV-2还会导致育肥猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatis and nephropathysyndrome, FONS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、增生性坏死性肺炎(proliferativenecrotising pneumonia, PNP)、新生仔猪的腹湾病等综合征以及猪体内免疫抑制，因而很难进行有效的药物治疗，再加上与之同源性很高且无致病力的PCV-1的存在，无疑为PCV-2感染的准确诊断及有效防控增加了难度。在2000年初，PCV-2已经成世界性流行,给世界各养猪生产大国(North and South America, Europe, andAsia)造成了巨大的经济损失。诸多数据表明，尽管PCV-2在我国各地区猪群中的感染阳性率不尽相同，但其在我国猪群中广泛存在已是不争的事实，已经给猪群的健康构成重大威胁。目前我国猪群中PCV-2呈现多基因型混合感染，不同基因型毒株共存，已报道的包括PCV2A、PCV2B、PCV2D、PCV2C。4株不同基因型毒株，它们的核心区序列未发生改变，突变存在于外表面(Cap蛋白氨基酸)，因此不同基因型毒株的抗原性存在一定差异。猪圆环病毒分为2个血清型，PCVl和PCV2。其中PCVl型不引起临床症状，广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞。PCV2对各种年龄的家猪和野猪均有致病性。与血清型分类相对应，猪圆环病毒基因组也分为2种基因型，即PCVl型基因组和PCV2型基因组。PCV2型基因组全长为1766bp、1767bp或1768bp，通常含有11个0RF，其中0RF1、0RF5、0RF7 和 0RF10 在病毒链上，而 0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 0RF11 在互补链上，这些基因表现为重叠基因，从而充分利用了病毒有限的遗传物质。ORFl和0RF2是2个主要的开放阅读框，分别编码与病毒复制有关的蛋白和病毒的衣壳蛋白(Cap)。在ORFl和0RF2的中间区域是病毒DNA的复制起始区(Ori)茎环序列，在病毒的蛋白合成、DNA自身复制及子代病毒产生中发挥重要作用。对PCV2的基因组分析发现，所有PCV2分离株的基因组同源性都在90%以上，但与PCVl的核苷酸同源性却只有68% 79%。PCVl和PCV2间与复制相关的DNA复制起始区和复制酶编码基因(r印)序列的同源性分别约为79.5%和82% ；但其衣壳蛋白编码基因(cap)存在较大差 异，同源性只有约62%。
欧盟猪圆环病毒病委员会提出的将PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c三种基因亚型的分类方法被广泛接受，其分型的基本原则是全基因遗传距离大于0.02和0RF2基因遗传距离大于0.035，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型。基因型与致病力的关系目前也成为PCV2研究的热点，Grau-Roma等发现PMWS发生的猪群中分离到的PCV2多属于PCV2b(原文中命名为genotypel)，而从健康猪群和有轻微消瘦症状的猪分离到的PCV2多属于PCV2a(原文中命名为genotype2)，结果提示PCV2存在不同毒力的毒株.且基因分型可能对判断疾病流行状况有很大帮助。而且系统进化分析显示，PCV2a型毒株在出现时间上早于PCV2b型的毒株，许多国家也发现随着PMWS的不断暴发，出现了由PCV2a向PCV2b基因型转换的现象。此外有人还发现在同一猪体内分离到多个PCV2分离株，目这些分离株分属不同的基因型，此现象提示基因重组可能在PCV2遗传进化中起到重要作用。按照欧盟猪圆环病毒病委员会的分类方法.我国目前的PCV2分离株多属于PCV2b亚型。猪PCV-2的检测与诊断是疫病防治的前提，猪PCV-2的分型检测与诊断对后续疫苗的研究、正确使用及治疗等具有指导性意义。但由于PCV-2病原体的加速突变和在猪场中多基因型PCV-2混合感染的特点，传统的医学检测手段(普通PCR、ELISA等)已经无法检测到新型病原体的突变体和分型系统检测与诊断，而分子生物学技术和荧光定量检测技术的飞速发展，为新型病原体及其突变体的定性和定量检测提供了可能。目前实时定量PCR (real time PCR, qPCR)可以实现PCV2快速的测定，已有学术文章和专利报道，PCV2实时定量PCR反应体系常包含四个组分:(I)反应液(master mix),通常有缓冲液，镁离子，酶，和dNTP等；⑵被测的病毒核酸染色体(target DNA), (3)引物(primers), (4)探针(probe),最常用的探针是TaqMan探针。但PCV2实时定量PCR反应体系检测体系中，由于引物的特异性不够，所以需要探针来保证反应特异性。探针通常需荧光标记，即探针寡聚核苷酸(oligo nucleotide)需偶联一个突光基团(fluorophore),和一个淬灭基团(quencher)。从合成角度上看，荧光探针合成的难度比引物合成大，所以，探针在市场上的价格常高于引物十倍。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便快速的猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒。一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒，包括以下三对引物:
正向引物反向引物
PCV2a GCGTTCTGACTGTGGTTCGC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC
PCV2b GGGCGTTCTGACTGTGGTTTTC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC
PCV2c GGCGTTCTGACTGTGGTAGCC
CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC 。在SMART测定体系中，由于引物的特异性极强，所以无需要探针可以达到反应的高度特异性的要求，SMART检测体系包含具有高荧光强度、高反应特异性EvaGreen和能增强反应特异性的CrystalTaq。我们SMART检测体系包含的PCV2a，PCV2b, PCV2c引物序列中反向引物是三种基因型都共有的，而正向引物可以区分PCV2a，PCV2b，PCV2c。如图1，图2，图3所示，SMART检测体系在三种基因型之间没有交叉反应，而用普通体系(SYBR GreenERSuper Mix, Life Technologies, Carlsbad, California, USA)会存在不同程度的交叉反应。所以，常规体系必须使用价格昂贵的探针来保证反应的特异性。也就是说，SMART系统应用更为简单的系统达到了复杂系统(常规体系)的目的。而且应用探针的常规体系也会有另一个问题:其检测体系(实验试剂盒)需要包括阳性对照的样品，以检验试剂盒的反应液、引物和探针是否有效。在上述三种成分中，任何一种失效就会使反应失效。阳性对照样品通常是人造核酸来模拟实际检测目标。但是这种模拟实际检测目标一旦污染了反应系统，就无法区分阳性对照样品和实际样品(由于荧光信号都一样)。如果一定要区分，就需要打开每个反应试剂，做进一步检验，但这一步骤会增加污染的机会。而在我们的SMART检测体系，人造模拟核酸和实际靶标DNA采用同样的引物进行扩增，但长度不一样，所以有同样的PCR放大曲线，但人造模拟核酸在熔解曲线上和实际的靶标DNA不一样。依据这一点，可以准确判定是污染还是真正的阳性信号(图4)。
图1 为 PCV2a SMART PCR 反应和 SYBR GreenER 普通 PCR 检测比较；图2 为 PCV2b SMART PCR 反应和 SYBR GreenER 普通 PCR 检测比较；图3 为 PCV2c SMART PCR 反应和 SYBR GreenER 普通 PCR 检测比较；图4为人造模板和实际模板的Tm比较。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1，在实时SMART荧光定量定性PCV。步骤1:在PCR实时反应管a中，加入10μ 12X SMART Master Mix(其中包括EvaGreen荧光染料，SMART缓冲系统，SMART Taq，dNTP,镁离子)，500nM PCV2a正向引物和PCV2a反向引物，和I μ I待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20 μ I。步骤2:在PCR实时反应管b 中，加入 10 μ 12Χ SMART Master Mix,500nM PCV2b 正向引物和PCV2b反向引物，和I μ I待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20 μ I。步骤3:在PCR实时反应管 c 中，加入 10 μ 12Χ SMART Master Mix,500nM PCV2c 正向引物和PCV2C反向引物，和I μ I待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20 μ I。步骤4:把以上三个管子放置在ΑΒΙ7500 (或是ΑΒΙ7900，或是BioRad, Bioer, Roche,相似功能的仪器)里进行实时PCR放大。反应的温度条件为:95 °C 2分钟热启动，在95°C 15s 和 65°C 30s 之间循环 40 次。在65 °C检测荧光。实施例2，在实时荧光定量PCR法中SMART具有更高特异性本发明比较了 SMART PCR反应和以SYBR GreenER为代表的普通PCR的特异性。结果如图1所示。图1的上幅显示了 IOyLSMART PCR反应体系中含有250nM，用来检测PCV2a的正负引物(表I所示)，和分别为一百万个拷贝的PCV2a，或是PCV2b，或是PCV2c，或是NTC.图1的下幅显示了 10 μ L的SYBR GreenER为代表的普通反应体系中含有250ηΜ浓度用来检测PCV2a的正负引物(表I所示)，和分别为一百万个拷贝的PCV2a，或是PCV2b，或是 PCV2c,或是 NTC.
表I
权利要求
1.一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒，包括以下三对引物: 正向引物反向引物 PCV2a GCGTTCTGACTGTGGTTCGC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC PCV2b GGGCGTTCTGACTGTGGTTTTC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC PCV2C GGLGTTCTGACTGTbGTAGCCCCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC 。
全文摘要
本发明涉及了一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒。属于生物检测领域，是一种基于SMART测定体系方法的试剂盒，解决了猪圆环病毒2型(PCV2a、2b、2c、2d等)分型检测方法操作程序复杂、需要较高的实验技能、实验周期较长等的技术问题，可为猪圆环病毒2型分型提供一种快速和准确的分子诊断技术产品。本发明能用于猪圆环病毒2型快速分型的系统诊断，指导该病预防和治疗，同时可实现该病毒各型序列突变的检测，将有助于猪圆环病毒的分子流行病学调查、肉类食品检疫以及猪场饲料、水质的病毒监测等。
文档编号C12R1/93GK103225001SQ201310162390
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月6日 优先权日2013年5月6日
发明者杨毅, 忻星, 王乃东, 邓治邦, 薛立群, 湛洋, 首易君 申请人:杨毅