专利名称：院内感染多病原体并行检测基因芯片及其利记博彩app和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子生物学技术及临床检测技术领域，特别涉及一种院内感染多病原体并行检测基因芯片及其利记博彩app和应用。背景技术：
近年来，随着医学的发展，院内感染率呈上升趋势，已经引起世界各国医院的重视，因此，对院内感染提出监控措施已成为一项综合性研究课题。国外先进国家早我国30年开展院内感染的研究，我国院内感染率为9 % 20 %，我国各级卫生行政部门极为重视，卫生部仅用3年时间建立了全国134所医院参加院内感染监控网络，并将院内感染监测标准列入医院分极管理的实施中，利用管理监测的手段推动院内感染特色分析检测等标准。对院内感染而言，医院现有的诊断技术多靠细菌或病毒培养，培养需要时间，通常是一天或几天，所以一般医生都不等培养结果出来就经验性地用药。这样做的结果是有50%以上的用药都不准确，延误真正的治疗时间，使病人住院时间不必要地延长，增加了医疗成本。可是这种“事后诸葛亮”式的诊断还不得不做，因为如果医生不开单做培养，那误诊误治产生的医疗事故就由医院和医生负责任。所以感染科医生开诊断实验单的时候很无奈，开了，对这个病人没有真正的帮助，仅仅是为了在医疗档案里面记录一笔，以防今后被告和医疗纠纷，这叫做“Defensive medicine〃或“防守医学”，不是主动进攻疾病，而是预防病人告医生。这种类型的诊断不但不能减低医疗费用，反而让费用不断增高。 落后的诊断技术是医疗费用持续增长的原因，而新的更快更准的分子鉴别诊断技术则可以让医院降低成本，也给整个社会降低医疗消耗，减少法律纠纷。iCubate技术平台集核酸提取、扩增和检测三个步骤于一体，而且提供了多重、自动、封闭(防污染)这三个临床迫切需要的关键功能，避免污染而导致的假阳性。使用这个技术平台，一个多个靶点的分子诊断可以在一个小时到一个半小时内完成。把院内感染的检测放到iCubate技术平台上来，可以做到一个标本，一个反应，多个指标。这样就能知道病人是否有合并感染，是否是其它病原体感染，是否有耐药性，应用到临床上，可以指导临床医生决定病人是否该用或者用哪种抗菌素，对临床的指导意义就更大。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种检测快速灵敏、准确性高的院内感染多病原体并行检测基因芯片及其利记博彩app和应用。本发明是通过如下技术方案实现的:
一种院内感染多病原体并行检测基因芯片，主要由固定有相关病原体特异性探针的基因芯片、特异性引物及通用引物组成，其特征在于:所述相关病原体包括鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌和热带念珠菌共14种病原体，另外还包括一个甲氧西林抗性靶点；所述基因芯片是点阵并固定有上述15种病原体特异性探针，所述特异性引物能对上述15 种病原体靶基因进行特异性扩增；所述通用引物是上述15种病原体靶基因无关的核酸序列，其中反向通用引物5’端带有荧光标记。本发明可以一次反应同时对鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌等14种医疗感染典型病原体进行快速、灵敏的检测，提供传统扩增方法无法提供的酵母和细菌共感染的检测数据，另外还包括一个甲氧西林抗性靶点，从而可以进一步实现对葡萄球菌感染的检测，这样可以让临床医生在一两个小时内就能知道病人是何种病原体感染，有没有耐药性，从而决定病人是否该用或者用哪种抗菌素，对临床的指导意义就更大。可检测病原体指标如下:
权利要求
1.一种院内感染多病原体并行检测基因芯片，主要由固定有相关病原体特异性探针的基因芯片、特异性引物及通用引物组成，其特征在于所述相关病原体包括鲍式不动杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌和热带念珠菌共14种病原体，另外还包括一个甲氧西林抗性靶点；所述基因芯片是点阵并固定有上述15种病原体特异性探针，所述特异性引物能对上述15种病原体靶基因进行特异性扩增；所述通用引物是上述15种病原体靶基因无关的核酸序列，其中反向通用引物5’端带有荧光标记。
2.根据权利要求I所述的院内感染多病原体并行检测基因芯片，其特征为，所述基因芯片中的15种探针为 鲍氏不动杆菌5’ -AAG TGT AGC TCA TCT TGA AG— 3’ ； 金黄色葡萄球菌5’ —ACT TAA TGA CTC TCA AGC T一3’ ； 绿脓假单胞菌5’ —ACT CCA CCG A CT CGA TCG TC一3’ ； 肺炎杆菌5’ -ACG TGC TGC CCG CCT ATG AA— 3’ ； 粪肠球菌5’ -TTA ATA TTT TAA ACA AAG AT— 3’ ； 屎肠球菌5’ -ATG ATA TTG AGT TAG ATG AA— 3’ ； 大肠杆菌5’ -AGG TTA AAG CGA CTG AGG TC—3’ ； 阴沟肠杆菌5’ -GGA TAT CAA A CC GTT CTT TA-3’ ； 奇异变形杆菌5’ —ATT ATG ATG AGC CAA AAA AT— 3’ ； 白色念珠菌5’ -GAA CAA AAA A AA TTT GCT AA— 3’ ； 克鲁斯念珠菌5’ -AAG AAG ATT GGT TTT CTT GA— 3’ ； 光滑假丝酵母5’ -AAG AAA TCT TGT GTT GAC TG— 3’ ； 近平滑念珠菌5’ -GTG CCA TTG ACA ATG TAT GT— 3’ ； 热带念珠菌5’ —CCA TAA TCA ACA GTA TCT TC—3，； 甲氧西林抗性5’ —ATT AAC AGC A AT GAT TGG GT-3’。
3.根据权利要求I所述的院内感染多病原体并行检测基因芯片，其特征为，所述特异性引物的序列如下 鲍氏不动杆菌5’ -GCG AGC TTC CAG AAC AAA GA,5’ —GAT GCG CTT GCA TAT GTG GT ； 金黄色葡萄球菌5’ -CAC GAT GAA GCT CAA CAA AAT GC,5’ -TGT TGC GCA TCA GCT TTT GGA ； 绿脓假单胞菌5’ —GAG TGG CAA CGT ACA CCT CA,5’ -CCG GCA CGT ATA CCA CAA GA ； 肺炎杆菌:5，-GCT GTT TAA CAA CCA GGC CG,5’ -CGG GGT ATA GTT GCG CTC TT ； 粪肠球菌5’ -ATG GGG CCA GAA AAG CTC G,5’ -GCC GCA TCA TTG TGT TCC C ； 屎肠球菌5’ -TGA CTC GGG GAT TGA TAG GC,5’ —ACT CTT GGA GCA ATC GTG TCT G ； 大肠杆菌5’ -AAG CGA CTG TTA GTG CGA CA,.5’ —CAT CAC CAC CGC TTG CTT TC ； 阴沟肠杆菌5’ -TGC TGA TCA CCG GGG TTT AC,.5’ -CAG CAG GTC GTC CGT CAT AA ； 奇异变形杆菌5’ -GCG GTT TAT CAC GAA GGG GT,.5，—ATT GGC AAA ACG AAA CGC CC ； 白色念珠菌5’ —CCA GTT TTC GGT ACA GGG GT,.5’ -ACA TTG GCA ACC CCA TGA GT ； 克鲁斯念珠菌5’ -TGT CTT TGC CTA TGC CGG TT,.5，-CAG ACC ACC CAA AGG CAT GA ； 光滑假丝酵母5’ -GCA TTT CGC TGC GTT CTT CA,.5’ -GTT GGG GGA ACG CTC TCT TT ； 近平滑念珠菌5’ -GTG TCG GAC CCA ATG GAT GT,.5’ -ATA CCC ACC ATC GTA CCC CA ； 热带念珠菌5’ —CCA CCG AAT GGC AAG TAT GGA,.5’ —ACC AAG GCT AGT GCT GTT TC ； 甲氧西林抗性:5，—ACC TCT GCT CAA CAA GTT CCA,.5’ -ACG TTG TAA CCA CCC CAA GA ； 以上所有特异性引物5’端都带有一个通用引物标签，通用引物序列如下.5’ -ACG TGT TAC TCG CAT AGT CG, . 5’ -TCC TGT ACT CTC TTA CTG AG。
4.根据权利要求I所述的院内感染多病原体并行检测基因芯片的利记博彩app，其特征为，包括如下步骤 (1)探针设计，根据15种病原体基因组的保守片段设计探针，长度20bp； (2)芯片的制备，探针合成，先在如上15条探针的5’端加上一段8-20聚的polyT，同时进行氨基修饰，用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合,使得终浓度为75 pmol/ μ I,通过cartesian microarray制作系统点阵在醒基修饰的载玻片表面，置于75%相对湿度，室温条件下48-72小时进行固定；取出后将玻片放于O. 2% SDS中震荡洗涤2 min，取出后室温充分干燥，然后将玻片放于硼氢化钠溶液中震荡5 min，以去除自由醛基；用0.2% SDS震荡洗涤I min，重复两次，最后用纯水浸泡2 min，晾干；如此，15条探针的院内感染多病原体并行检测基因芯片即制作完毕，然后将芯片固定在卡盒底部的杂交检测槽内。
5.根据权利要求I所述的院内感染多病原体并行检测基因芯片在医院、诊所或其他保健措施疗养院院内感染临床诊断上的应用。
6.根据权利要求5所述的基因芯片的应用，其特征为，主要包括如下步骤 (O芯片制备将15种院内感染病原体特异性探针点阵并固定在醛基修饰的载玻片上，芯片制备完毕将其固定在卡盒底部的杂交检测槽内； (2)核酸分离使用商业化的试剂盒提取RNA； (3)PCR扩增使用特异性引物及通用引物进行PCR扩增反应； (4)杂交反应PCR扩增完成以后卡盒内部的移液抢把所有产物都放到杂交检测槽进行杂交，杂交时芯片底部的加热器将温度控制在65°C，十五分钟杂交结束后移液抢做快速清洗； (5)信号检测清洗完的卡盒放到卡盒阅读仪里接受最后的信号检测，卡盒阅读仪里面有激光共聚焦扫描系统和光电倍增管等检测装置，读到的数据通过系统分析软件处理直接以数字的形式显现，卡盒从阅读仪中拿`出来就直接扔掉，封闭体系避免了污染的发生。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术及临床检测技术领域，特别公开了一种院内感染多病原体并行检测基因芯片及其利记博彩app和应用。本发明可以一次反应同时对鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌等14种医疗感染典型病原体进行快速、灵敏的检测，提供传统扩增方法无法提供的酵母和细菌共感染的检测数据，另外还包括一个甲氧西林抗性靶点，从而可以进一步实现对葡萄球菌感染的检测，这样可以让临床医生在一两个小时内就能知道病人是何种病原体感染，有没有耐药性，从而决定病人是否该用或者用哪种抗菌素，对临床的指导意义就更大。
文档编号C12Q1/04GK103255216SQ20131014519
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者李艳艳, 张凯宁 申请人:山东艾克韦生物技术有限公司