专利名称：一株用于防治烟草黑胫病的枯草芽孢杆菌的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别是涉及一株用于防治烟草黑胫病的枯草芽孢杆菌。
背景技术：
烟草是一种重要的经济作物，烟草黑胫病是世界各烟草种植区的重要病害之一。我国大部分烟草种植区均有发生，且在多个省市发生危害严重。为了迎合工业上对特色品质的需求，生产上种植的烟草品种有许多抗病性程度不高。目前对黑胫病的控制仍然以化学药剂为主，从而导致病原菌抗药性增强、环境污染及烟叶重金属含量超标等后果，影响防治效果、生态安全和人类健康。发明内容
本发明的目的是提供一株用于防治烟草黑胫病的枯草芽孢杆菌TBSCQ057，一种从健康烟株分离获得的内生细菌。从植物微生态系统角度，利用内生细菌对烟株根际生态、植株生理生化和病原菌等方面的综合作用，并以此来控制烟草黑胫病害。菌株TBSCQ057能促进土壤矿化及植株对养分的吸收，可显著降低土壤中真菌数量，提高细菌数量，尤其能提高固氮、解磷和解钾3大功能细菌数量，且对烟苗具有很好的促生作用。经平板对峙培养拮抗测试，该菌株对烟草黑胫病菌等多种病原菌有很强的抑制作用，经温室盆栽和田间小区试验，表明菌株TBSCQ057对烟草黑胫病有很好的防治效果。
TBSCQ057菌株分离纯化和筛选:采集健康烟株，对样品进行表面消毒处理，然后剥去表皮，切取内部组织捣碎，取静置液涂于牛肉汁蛋白胨平板，选取典型菌落，纯化。再在燕麦培养基上与烟草黑胫病菌进行对峙培养，获得对黑胫病菌有较强抑制作用的菌株。
TBSCQ057菌株的形态特征鉴定:菌株TBSCQ057在NA培养基上菌落边缘不整齐，扁平，乳白色，干燥，无光泽；革兰氏染色阳性，芽孢卵圆形，中生，周生鞭毛。显微观察菌体为单细胞，杆状，单生或双生，有时成链，大小为0.8 1.2 iimX1.9 4.9 ii m ;石蕊牛奶产碱、胨化，糖发酵产酸、柠檬酸盐、接触酶、V-P反应、淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化等为阳性；卵黄反应、马尿酸盐、酪氨酸、丙酸盐和苯丙氨酸脱氨酶反应均为阴性；可以在含5%、7% NaCl和pH 5.7的葡萄糖培养基上生长。根据这些特性，将TBSCQ057初步鉴定为枯草芽孢杆菌iBacillus subtilis、。
TBSCQ057菌株分子鉴定:提取菌株TBSCQ057的总DNA，将所提取的样品基因组DNA溶液稀释作为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用细菌通用引物fDl和rPl。fDl: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’-ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。以菌株TBSCQ057的基因组DNA为 模板，PCR扩增后经电泳检测，得到I条约为1.5 kb的条带，经测序分析确定16S rDNA片断长度为1397kb。结合形态特征，将TBSCQ057菌株确定为枯草芽抱杆菌subtilis0
TBSCQ057菌种的活体纯培养已于2012年06月15日保藏于‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话:010-64807355)，保藏号:CGMCC N0.6223。TBSCQ057菌株对烟草黑胫病菌的抑制作用:内生细菌TBSCQ057对黑胫病菌在平板对峙培养过程中有很强的抑制作用，菌落成椭圆形扩展。显微观察发现菌丝扭曲、分支增多。扫描电镜观察发现菌丝畸形，膨大且分支短粗，有的形成小瘤状物，多数表现出短粗的结节。TBSCQ057菌株对烟草黑胫病的防治效果:烟草黑胫病是一种土传根茎类病害，病原菌主要通过根和茎基部侵入寄主。本发明针对病原菌的侵入途径，利用TBSCQ057发酵液进行灌根处理，获得了好的防治效果。TBSCQ057发酵液对烟草黑胫病的温室防治效果为69.28% ;两年的田间小区防治效果分别为61.25%和72.49%，与对照化学药剂58%甲霜 锰锌可湿性粉剂的防治效果无显著差异0°>0.05)。TBSCQ057菌株的最佳发酵条件:菌株发酵条件单因素测定表明，菌株TBSCQ057生长和抑制黑胫病菌的拮抗物质产生的最适单因素条件分别是:发酵温度为28 °C、培养液初始pH值为7.0、发酵时间为48 h、摇瓶转速180 r/min和25 mL/500mL三角瓶装液量。进行正交试验优化后的最佳发酵条件组合为发酵温度为28 °C、培养液初始pH值为
7.0、发酵时间为72 h、摇瓶转速180 r/min和25 mL/500 mL三角瓶装液量。TBSCQ057·菌株的抗菌谱分析:该菌株能抑制多种植物病原真菌，如小麦赤霉病菌、烟草白絹病菌、番茄早疫病菌、烟草灰霉病菌、玉米纹枯病菌、棉黄萎病菌、花生黑斑病菌、烟草赤星病菌和烟草炭疽病菌，TBSCQ057菌株均表现出抑制作用，对烟草4种病原真菌(烟草赤星病菌、烟草炭疽病菌、烟草灰霉病菌和烟草白絹病菌)均有较强的抑制作用。菌株TBSCQ057的拮抗代谢产物分析:测试表明该菌株可以产生纤维素酶，蛋白酶，嗜铁素，但是不产生几丁质酶。本发明的优点
从健康烟株中分离获得的内生枯草芽孢杆菌TBSCQ057菌株，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身在平板上对烟草黑胫病菌等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草黑胫病有很好的防控效果。因为该菌株是从烟株内部分离获得，表明该菌株可以在烟株内部定殖，且该菌株对烟株有促生作用。同时，该菌株与烟株微生态有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
图1为菌株TBSCQ057菌落形态；
图2为菌株TBSCQ057杆状菌体及周生鞭毛；
图3为菌株TBSCQ057 16S rDNA的PCR扩增结果；M:100bp DNA梯度Marker ;泳道1-6:Itb57 ;泳道7、8:阳性对照；泳道9:阴性对照；泳道10:空白对照图4为菌株TBSCQ057的16S rDNA扩增序列；
图5为菌株TBSCQ057对烟草黑胫病菌的抑制效果(左:受抑制菌落，右:正常菌落)；
图6为菌株TBSCQ057对烟草黑胫病的温室防治效果(A:病原菌处理，B:甲霜 锰锌处理，C:菌株TBSCQ057处理，D:清水处理)；图7为菌株TBSCQ057对烟草赤星病菌(AltGrrmria alternate')、烟草白絹病菌lSclerotium rolfsii)、烟草灰霉病菌{Botrytis cinerea)和烟草炭疽病菌{ColIeto trichum nigrum)的抑制效果； 图8为菌株TBSCQ057的拮抗代谢产物检测A.几丁质酶，B.纤维素酶，C.蛋白酶，D.嗜铁素。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述 实施例1菌株TBSCQ057的获得及相关性状分析 1.1菌株TBSCQ057的分离纯化:采集健康烟株，对样品进行常规表面消毒处理，然后剥去表皮，切取内部组织捣碎，取静置液涂于牛肉汁蛋白胨平板，选取典型菌落，纯化。再在燕麦培养基上与烟草黑胫病菌进行对峙培养，获得对黑胫病菌有较强抑制作用的TBSCQ057菌株。
1.2菌株TBSCQ057对烟苗生长的影响:将保存在斜面培养基上的菌株TBSCQ057菌落接种到NB培养液中进行发酵培养，获得菌悬液，再将菌悬液稀释成3 X IO8 cfu/mL。取菌悬液进行以下4种处理:A (浸种处理)、B (浸种+灌根处理)、C (喷雾灌根处理)、D (空白对照-用无菌水浸种、催芽处理)。随后每钵按相同粒距播种5粒，待萌发整齐后，保持每钵2株幼苗，每处理4次重复。间苗后第30天用菌悬液对处理B的烟苗进行灌根，每钵用量10 mL ;对处理C的烟苗先喷湿叶面再将剩余菌液灌根，每钵用量10 mL ;对处理A、D的烟苗用无菌水进行灌根处理，每钵用量10 mL。所有处理在相同光照及水肥条件下培养，随机排列，每天转动位置。培养至第45天测定每钵烟草幼苗的真叶数，最大叶的长、宽，地上部鲜重和干重。以此检测菌株TBSCQ057对烟苗生长的影响。
1.3菌株TBSCQ057对烟苗根际菌群的影响:将菌悬液处理后培养的根际土壤取样，应用稀释法，将土样制成系列稀释度至10_4，分别以每皿50、50、100 u I的量接入PDA、NA和高氏一号培养基中，用以测定真菌、细菌和放线菌总量，每个样品每种培养基设3个重复。分别将真菌置25°C、细菌置28°C、放线菌置30°C温箱培养2-4d，观察并计菌落数。功能菌群分离计数采用各选择性培养基及相应培养方法。以此分析菌株TBSCQ057对土壤中真菌、细菌和放线菌数量的影响，同时检测对固氮、解磷和解钾3大功能细菌数量影响。
1.4菌株TBSCQ057对烟草黑胫病的拮抗作用:在PSA平板中心接种烟草黑胫病菌菌丝块，在距平板中心3.0 cm的两边对称划线接种菌株TBSCQ057菌悬液，设不接种拮抗细菌TBSCQ057为对照，置于28°C温箱培养。4天后观察拮抗效果。然后用刀片切取受抑制的烟草黒胫病菌菌落边缘菌丝块及对照菌丝块。经系列扫描电镜样品制备过程后，将制好的标本在扫描电镜下 观察。以此分析该菌株对黑胫病菌的抑制作用。
1.5菌株TBSCQ057的鉴定:(I)形态学观察与鉴定:将菌株TBSCQ057在NA培养平板上于28°C下培养l-3d，观察其菌落形态(形状、颜色光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘形状等)；(2)分子生物学鉴定:提取菌株TBSCQ057的基因组DNA，以细菌通用引物fDl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’ -ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’，以菌株 TBSCQ057的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测，测序；利用NCBI网站上的Blast软件和BioEdit软件进行序列同源性分析，以同属的cereus为外组群,采用Mega 4.0软件的邻近法(Neighbor -Joining)构建系统发育进化树，由此确证菌株TBSCQ057的种级分类阶元名称。确定其分类地位。
实例2.菌株TBSCQ057对黑胫病的防治效果 2.1温室控病测试；刮下在燕麦培养基上培养14d的黑胫病菌菌丝，加入0.1% KNO3溶液浸润，产孢后加无菌水捣碎，调整浓度为约I X IO4个孢子囊/mL，于8 °C下放置20 min后稀释10倍，加入I %的葡萄糖后备用。TBSCQ057发酵液是用10-100 L全自动发酵罐中发酵2天获得。将发酵液浓度调整为约IXlO8 cfu/mL。盆栽试验使用灭菌菜地土，装入10cmXIO cm盆栽钵中，移栽时和接种病原菌前10天灌施TBSCQ057发酵液，每次每株10 mL。对照药剂(58%甲霜 锰锌可湿性粉剂)以500倍液于接种病原菌前24 h灌根，每株10 mL,设清水处理为空白对照，每个处理15株，3次重复。当烟苗长至6-7片真叶时灌根接种烟草黑胫病菌，每株10 mL，接种前用少量清水湿润土壤。处理后将植株置于20 °C黑暗下24h，再置于28 1:温室培养，常规管理。7天后调查烟草植株发病情况，统计发病率和病情指数，以此分析TBSCQ057菌株发酵液对烟草黑胫病的温室控制效果。
2.2田间防治测试:选择烟草黑胫病常年发病的地块，烟苗移栽时用20%稻灵 噁霉乳油1500倍液浸根处理。从移栽开始按下列方式处理:用IXlO8 cfu/mL的TBSCQ057菌株发酵液灌根，每株250 mL,以58%甲霜 锰锌可湿性粉剂500倍液等量灌根为药剂对照，设清水灌根为空白对照。每小区面积50 m2，植烟70株，小区随机排列，3次重复，采用常规大田烟草栽培管理。于烟叶收获中期调查发病情况，统计发病率和病情指数，以此计算TBSCQ057发酵液对烟草黑胫病的田间相对防治效果。
实例3菌株TBSCQ057发酵条件 3.1培养基pH值:用无菌lmol/L NaOH或HCl将灭菌后的30g/L花生粉培养液一升的 pH 值分别调节为 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 和 11.0 等 10 种处理，每处理3次重复。按5%接种量接入TBSCQ057菌悬液，在28 °C, 18 0 r/min下，黑暗振荡培养48 h，发酵培养液用梯度稀释法稀释后，用血球计数板计数浓度以确定最佳pH值。
3.2培养温度:利用30g/L花生粉培养液分别在22、25、28、31、34和37 °C培养，按5%接种量接入TBSCQ057菌悬液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振荡培养48 h，发酵培养液用梯度稀释法稀释后。用血球计数板计数浓度，每处理3次重复，以确定最佳培养温度。
3.3通气量:利用30g/L花生粉培养液分别在装液量为25、50、75、100和150mL/500 mL三角瓶培养，按5%接种量接入TBSCQ057菌悬液，在28 V，180 r/min下，黑暗振荡培养48 h，发酵培养液用梯度稀释法稀释后。用血球计数板计数浓度，每处理3次重复。以确定最佳通气量。
3.4培养时间:利用30g/L花生粉培养液摇瓶发酵，分别培养24、36、48、60、72、96和120 h，按5%接种量接入TBSCQ057菌悬液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振荡培养48 h，发酵培养液用梯度稀释法稀释后。用血球计数板计数浓度，每处理3次重复，以确定最佳培养时间。
3.5摇床转速:利用30g/L花生粉培养液摇瓶发酵，转速分别设为90、120、150、180和210 r/min，按5%接种量接入TBSCQ057菌悬液，在28 °C, 180 r/min下，黑暗振荡培养48 h，发酵培养液用梯度稀释法稀释后。用血球计数板计数浓度，每处理3次重复，以确定最佳培养时间。
3.6发酵条件优化:以前述方法测得的各单因素最佳条件为基础，如下表设计5因素，4水平进行正交试验并测定生长量。以此分析TBSCQ057菌株的最优化发酵条件。
表I因素与水平
权利要求
1 一株用于防治烟草黑胫病的枯草芽孢杆菌Uaci77心TBSCQ057，其保藏号为 CGMCC NO. 6223。
全文摘要
一株对烟草黑胫病具有生防活性的枯草芽孢杆菌菌株TBSCQ057，属农业病害生物防治领域。此菌从自然环境寄主植物中分离获得，根据形态特征和分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。该菌对烟草黑胫病菌有很强的抑制作用，对烟草黑胫病有很好的控制效果。同时，该菌株还具有广谱拮抗活性，对烟草灰霉病菌、烟草赤星病菌、烟草白绢病菌和烟草炭疽病菌等多种病原真菌抑菌效果较好。该菌株次生代谢产物中有纤维素酶，蛋白酶和嗜铁素等。TBSCQ057菌体制剂对烟草黑胫病有很好的控制作用，经发酵菌体或次生代谢产物提取技术可生产环境友好型生物农药，具有重要的商业开发应用价值。
文档编号C12R1/125GK103224897SQ20131012432
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者王勇, 邢小军, 卢军, 马冠华, 肖崇刚, 董国菊 申请人:四川省烟草公司凉山州公司, 西南大学