专利名称：一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用的利记博彩app
技术领域：
:本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用。
背景技术：
:纤维素是世界上最多的可再生生物质资源。每年由植物体光合作用生成的生物质高达1500亿吨，但是由于纤维素的结构复杂，目前这一巨大资源的绝大部分还不能被人类所综合利用。纤维素是以葡萄糖为单元通过3-1，4-糖苷键连接而成的大分子。纤维素酶能将纤维素降解并最终转化成葡萄糖的一类酶的总称，包括内切纤维素B|(endo-l, 4- ^ -D-glucanase, EC3.2.1.4，简称EG)；外切纤维素酶(exo-1, 4_ P -D-glucanase, EC3.2.1.91,简称 CBH) -葡糖苷酶(P -D-glucosidase,EC3.2.1.21，简称86)。内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶，其作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解￠-1,4-糖苷键，产生大量的短链的小分子纤维素物质，即纤维素末端，可为外切葡聚糖酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖；外切纤维素酶作用于纤维素分子的末端，以两个葡萄糖残基为单位依次从纤维素分子的末端切下，生成纤维二糖；3 -葡糖苷酶作用于纤维二糖，将其水解成葡萄糖，葡萄糖进行发酵很容易就可以转化成各种有用的化工产品。纤维素的转化利用对解决世界能源危机、粮食问题、环境污染等有着重要的意义。获取纤维素酶的传统方法是从纯培养微生物出发，筛选高产纤维素酶菌株，通过发酵进行产酶，这在工业中获得了重要的应用，但是严峻的能源危机使得对新型工业用酶的需求日益旺盛。自然环境中99%的 微生物在目前的实验条件下不易获得纯培养，未培养微生物也是地球上最大的尚未开发的生物资源。近年来出现的宏基因组学不依赖于微生物培养，以特定环境中微生物总DNA为对象，增加了获得新的生物活性物质的机会，是一条找寻新基因及新酶的新途径。红树林处于周期性遭受海水浸淹的环境，兼有陆地和海洋的性质但又与二者不同，具有沼泽化和盐溃化等特征，其植物凋落物非常丰富，纤维素、木质素等有机质含量高，造就丰富又不失特色的微生物资源，通过构建宏基因文库，可以从中筛选到新颖的性质优良的纤维素酶基因
发明内容
:本发明的目的是提供一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用。本发明通过构建红树林宏基因组文库，利用纤维素酶活性平板筛选方法，获得了新的纤维素酶MgCel44及其编码基因mgcel44，该编码基因mgcel44可在宿主细胞中大量表达以生产纤维素酶MgCel44，用于纤维素的降解，从而实现了本发明的目的。本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶的编码基因mgCel44，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其由1947个碱基组成。本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其由648个氨基酸组成，自N端的第33-87位氨基酸为多配体聚糖区域，自N端的第147-399位氨基酸为家族44糖基水解酶功能域。纤维素酶MgCel44与其它内切葡聚糖酶具有一定的相似性，与Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纤维素酶、Streptomyces bingchenggensis BCff-1 的内切葡聚糖酶、Amycolatopsismediterranei U32的内切葡聚糖酶有最高一致性，一致性为48%，所以纤维素酶MgCel44是一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶。本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，含有上述新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶的编码基因mgcel44。本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，含有上述表达载体的原核细胞或真核细胞。所述的原核细胞可以为各种细菌，如大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还提供·了上述新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44在纤维素降解中的应用。本发明得到了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44及其编码基因mgCel44，该新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44能够水解纤维素，因此本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44可以在纤维素的水解中具有广泛的用途。
:图1为从红树林土壤中提取的总DNA，I =AMix (片段从大到小依次为48.5kb, 38.4kb, 33.5kb, 29.9kb, 24.5kb, 24.0kb, 19.4kb, 17.lkb, 15.0kb, 12.2kb, 10.lkb, 8.6kb, 8.3kb) ；2:入-Hind III digest (片段从大到小依次为23.lkb, 9.4kb, 6.6kb) ；3:红树林土壤总DNA。图2为用限制性内切酶BamH I对红树林土壤微生物宏基因文库克隆进行酶切分析以判断文库质量，Ml:入Mix (片段从大到小依次为48.5kb, 38.4kb, 33.5kb, 29.9kb, 24.5kb, 24.0kb, 19.4kb, 17.lkb, 15.0kb, 12.2kb, 10.lkb, 8.6kb, 8.3kb) ；M2: A -Hind III digest(片段从大到小依次为23.lkb,9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb);其他泳道分别为文库克隆。图3为文库中纤维素酶活性阳性克隆的筛选。图4为能降解羧甲基纤维素的文库克隆质粒FosSCSIOI的BamH I酶切带型，I:入-Hind III digest (片段从大到小依次为 23.lkb, 9.4kb, 6.6kb, 4.4kb, 2.3kb, 2.0kb) ；2:DL2000 (片段从大到小依次为 2.0kb, 1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.lkb)；3:FosSCS101/BamH I。图5为重组质粒pET_mgcel44转化大肠杆菌后的转化子能降解羧甲基纤维素(上)，而空载体转化大肠杆菌后的转化子不能降解羧甲基纤维素(下)。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，提供的实施例是为了更好地理解本发明，而不应该被解释为限制本发明。
在本发明的实施例中所用到的材料包括:红树林土壤样品，EPI300-T1R菌株、Copycontrol PCC2Fos载体购自Epicentre公司，限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Takala、Sigma。实施例1:红树林土壤微生物宏基因组文库的构建1、红树林土壤微生物总DNA的提取(I)称取5g红树林土壤样品，放置于50mL无菌离心管中；(2)加 A 13.5ml 红树林土壤 DNA 提取缓冲液:(IOOmmol Tris-HCl, IOOmmolEDTA[乙二胺四乙酸钠],100mmo1 sodium phosphate [憐酸钠]，1.5mol/L NaCl,1%CTAB [十六烷基三甲基溴化铵]，2%PVPP [交联聚乙烯吡咯烷酮]，其余为水，pH8.0)，漩涡震荡5-10min，使土壤颗粒充分分散于缓冲液中；(3)将震荡后的样品置于摇床中，常温下振摇45min，使得土壤匀质化，加入
1.5mL20%SDS，轻柔颠倒混匀，65°C水浴3h，每隔30min轻柔颠倒混匀样品；(4)水浴裂解后，冷却至室温，IOOOOg离心IOmin离心取上清液；(5)加入预冷的氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀，室温下IOOOOg离心IOmin.收集上清，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇,室温下沉淀40min ；(6)室温下，IOOOOg离心15min收集核酸沉淀；(7)核酸沉淀用70%冰乙醇洗涤2次，IOOOOg离心5min，重悬于100 U I无菌TE缓冲液，得红树林土壤总DNA，0.8%电泳检测(见图1)。2、插入片段的切割及末端修复对提取的红树林土壤总DNA用枪头反复吹打进行机械性切割，使得其大小在35kb左右，脉冲场电泳进行DNA片段的分离(脉冲场电泳设置为电压:6V/cm,脉冲值:5_15s,温度:16°C，时间16h)，回收35kb左右的DNA片段，对回收的片段进行末端修复反应，在冰上依次向微量离心管中加入:8iillOX ii末端修复缓冲液，8iU2.5mM dNTP混合物，8 u IlOmMATP, 20 u g插入片段，4ii I末端修复酶,加去离子水至总体积为80 y I。在室温下反应45min，然后转移至70°C水浴IOmin以灭活末端补平酶，沉淀并回收DNA。3、连接及 Copycontrol Fosmid 克隆的包装连接反应的体系为:1 iillOx快速连接缓冲液，I U I ATP, I U I PCC2Fos预处理好的克隆载体(0.g/iil)，插入DNA(0.25 u g of ^ 35kb步骤2的回收DNA)，Iyl快速连接酶，加去离子水至体积为lOiil，16°C连接20h，将反应体系转移到70°C，lOmin，使快速连
接酶失活，得到连接反应液。Copycontrol Fosmid克隆的包装的步骤如下:(I)冰上融化I管噬菌体包装提取物用于连接反应，该连接反应可以扩大或缩小反应体系； (2)在融化过程中，立即转移25iil噬菌体包装提取物到另一个1.5ml的离心管中；(3)加入10 U I连接反应液至25 U I已经冰上融化了的噬菌体包装提取物中；(4)用移液枪轻轻混匀液体数次，注意避免产生气泡，短暂离心使溶液都到小管底部;(5 ) 30 °C 下包装 90min ；
(6)加入剩余的25 U I噬菌体包装提取物至管中；(7) 30°C下额外包装 90min ；(8)加入噬菌体稀释缓冲液至1ml，温和混匀，每管加入25 Ul氯仿，得到包装好的
噬菌体。4、文库的评估将包装好的噬菌体侵染大肠杆菌EPI300，共获得100,000个克隆的文库，随机挑取18个克隆，经过诱导，使其产生高拷贝质粒后提取质粒DNA，然后用内切酶BamH I酶切，脉冲电泳检测(见图2)。结果所有质粒除了都有一个8.1kb的载体片段外，都含有插入片段，而且带型各不相同(见图2)，说明文库含有随机的插入片段，插入片段大小在20-55kb之间，平均长度约为30kb，文库容量达3Gb，说明文库的容量非常大，质量非常好。实施例2:表达纤维素酶活性阳性克隆的筛选将保存在96孔板中的文库克隆子挑取到含有1%的羧甲基纤维素钠(CMC)的卡那霉素抗性LA平板上，将平板在37°C培养箱中培养72h，用0.5%刚果红溶液染色20min，IMNaCl溶液脱色15min，检测平板上是否有透明圈，结果筛选到I个CMCase阳性克隆子(见图3)，该阳性克隆的质粒命名为fosSCSIOl。为了证实fosSCSIOl确实含有纤维素酶基因，用提取的fosSCSIOl质粒重新转化大肠杆菌EPI300，结果重组子在含羧甲基纤维素钠的平板上检测到清晰的水解圈，而不含质粒的大肠杆菌EPI300在平板上则没有检测到水解圈，说明fosSCSIOl质粒上确实含有纤维素酶基因。用限制性内切酶BamH I完全酶切fosSCSIOl后，电泳检测分析，结果除了有一个8.1kb的载体片段外，还有另外6条片段，大小分别为
6.0kb、5.0kb、4.lkb、3.5kb、3.0kb、2.2kb (见图 4)，说明 fosSCSIOl 含有约 23.8kb 的插入片段。
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实施例3:纤维素酶基因的获得提取纤维素酶活性克隆fosSCSIOl质粒，用Sau3A I进行酶切，酶切体系为:5u 110X酶切缓冲液，适量质粒DNA，0.5iil稀释100倍的内切酶Sau3A I，加入ddH20至总体积为50 u 1，37°C反应3min，回收长度为l_5kb的DNA片段。同时PUC19载体进行BamH I酶切，酶切后再进行去磷酸化反应，反应体系为:2iillOX缓冲液，适量酶切后TOC19载体，
IU I CIAP，加入ddH20至总体积为20 ill。磷酸化处理后的TOC19载体与回收的Sau3A I酶切的质粒酶切片段进行连接，然后转化大肠杆菌宿主细胞，利用刚果红平板进行纤维素酶活性阳性克隆子筛选，用琼脂糖凝胶电泳对阳性克隆子质粒大小进行分析，如果插入片段过大，则重复以上步骤进行下一轮亚克隆，直到阳性克隆子质粒大小符合测序要求。最终获得一个插入片段长度为3kb左右的阳性克隆子，将该片段送去华大基因进行测序，经过拼接得到完整的含有mgCel44基因的片段。实施例4:纤维素酶基因mgcel44的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件如ORF finder, Blast对步骤3的测序的完整的含有mgcel44基因的片段进行序列分析。纤维素基因mgCel44的开放阅读框由1947个脱氧核苷酸组成，序列如SEQ ID N0.1所示，其中起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。实施例5:纤维素酶基因mgcel44编码产物纤维素酶MgCel44的氨基酸序列分析利用密码子规则，纤维素酶基因mgcel44编码一个含648个氨基酸的蛋白质，其序列如 SEQ ID N0.2 所不，命名为纤维素酶 MgCe144,使用 Blast (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/)搜索GenBank数据库,纤维素酶MgCel44属于糖苷水解酶44家族,与其它内切葡聚糖酶具有一定的相似性，与Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纤维素酶、Streptomyces bingchenggensis BCW-1 的内切葡聚糖酶、Amycolatopsis mediterraneiU32的内切葡聚糖酶有最高一致性，一致性为48%，因此纤维素酶MgCel44是一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶。用组件结构研究工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析MgCel44的组件结构，自N端的第33_87位氨基酸为多配体聚糖区域，自N端的第147-399位氨基酸为家族44糖基水解酶功能域。实施例6:纤维素酶基因mgcel44的克隆和表达用上游引物mgcel44-S:CTCCGGAAITCATGGGITTGGCCCTGGATGC，下游引物mgcel44-A:CTCCGCTCGAGTCTAATGACGATTGAGTGCCGAAAG,以实施例 3 的纤维素酶阳性克隆子质粒为模板PCR扩增纤维素酶基因mgCel44 (经测序验证，PCR扩增得到的片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，为纤维素酶基因mgcel44)，用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切扩增产物，与经相同内切酶酶切的pET-22b表达载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a中，涂布到含50ii g/ml卡那霉素的LB培养基平板上筛选阳性克隆，进一步提取质粒DNA，双酶切验证正确后命名重组质粒为pET-mgCel44，该重组质粒是将纤维素酶基因mgcel44插入pET_22b表达载体中。将质粒pET_mgcel44转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，转化子用IPTG诱导后，在平板上能降解羧甲基纤维素，而含有未插入纤维素酶基因mgCel44的pET-22b空载体的大肠杆菌转化子则不能降解羧甲基纤维素(图5)，由此说明纤维素内切酶基因mgcel44在大肠杆菌中成功表达,该纤维素酶基因mgcel44的表达产物纤维素酶MgCel44能够降解羧甲基 纤维素。
权利要求
1.一种纤维素酶MgCel44，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的纤维素酶MgCel44的纤维素酶基因mgCe144，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.—种表达载体,其特征在于,含有权利要求2所述的纤维素酶基因mgcel44。
4.一种宿主细胞,其特征在于,含有权利要求3所述的表达载体的原核细胞或真核细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的原核细胞为细菌。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL2UDE3)。
7.权利要求1所述的纤维素 酶MgCel44在纤维素降解中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用。本发明得到了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)及其编码基因mgcel44(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44能够水解纤维素，因此本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44可以在纤维素的水解中具有广泛的用途。
文档编号C12R1/19GK103232984SQ201310124139
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者张偲, 麦志茂, 杨键, 李洁 申请人:中国科学院南海海洋研究所