南方红豆杉ssr-pcr反应体系及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq?DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多个水平上进行优化试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR?20μL最佳反应体系：引物2μM、dNTP?40μM、Taq?DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA?75ng。该体系的建立能很好地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础。
【专利说明】南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其 应用。
【背景技术】
[0002] 南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei )为裸子植物亚门（Cymmospermai ) 松杉纲（Coniferopside)红?杉目（Taxales)红?杉科（Taxaceae S. F. Gery)红?杉属 (Taxus Linn.)植物，是中国红豆杉属植物中分布最为广泛的一个种，自然分布于亚热带各 省区。红豆杉树皮中因含有抗癌药物成分紫杉醇导致其被大量砍伐或破坏，现已处于濒危 状态，在1999年我国国务院公布的《国家重点保护植物名录(第一批)》中被列为国家一级 保护植物。南方红豆杉材质优异，是高档珍贵用材，其紫杉醇含量虽稍低于喜马拉雅红豆杉 等，但因早期速生、生物收获量大，适宜短周期作业而具有巨大的药用开发利用价值。
[0003] SSR (简单重复序列，又称微卫星DNA，Simple Sequence Repeats或 Microsatellite DNAs)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记 技术。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在鉴定上显示了独特的优越 性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的 信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验 室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享；且操作简便、稳定 性、重复性好。已成为目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。
[0004] 因此，建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研 究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供优化的南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，所述反应体系总 体积20uL，其中，上、下游引物各2μΜ、dNTP 40yM、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+1.0mM和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配制。
[0007] 其中，上游引物 F :5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下游引物 R : 5 ^ -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3 ^。
[0008] PCR 扩增程序为：94°C 5min ;94°C 45s，56°C 45s，72°C 45s，35 个循环；60°C 30min〇
[0009] 其中，模板DNA的提取包括以下步骤：
[0010] (1)取-7(TC保存的南方红豆杉嫩叶0· 5?lg，放入经液氮预冷的研钵中，加入液 氮研磨成粉末；
[0011] (2)将粉末快速转移到2mL离心管中，加入lmL 65°C预热的CTAB提取液，充分混 匀，65°C水浴30?45min。其间不时摇动离心管使之混匀；
[0012] (3)取出离心管，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清到新离心管中；
[0013] (4)加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和异戊醇混 合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 :24 :1)轻轻地颠倒混匀，放置lOmin， 4°C 12000rpm 离心 lOmin;
[0014] (5)重复步骤（4);
[0015] (6)吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的_20°C预冷无水乙醇和1/10体积醋 酸钠，混匀，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ;
[0016] (7)4°C 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500yL 去离子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ;
[0017] (8)溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇（即氯仿和异戊醇的混合液，二者体积比为24: 1)抽提一次；
[0018] (9)沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50 μ L去离子水；
[0019] (10) 1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，_20°C保存。
[0020] 本发明还提供所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的 应用。
[0021] 本发明建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR 反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA)在多个水平上进行优化 试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR 20 μ L最佳反应体系：弓丨 物2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+l. OmM和模板DNA75ng。该体系的建立能很好 地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分 析奠定了一定基础。
[0022] 通过建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研 究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等奠定基础，为开展植物分子辅助育 种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据，从而为科学制定南方红豆 杉遗传保育策略及种质资源利用提供分子遗传学数据。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明提取样品的总DNA检测结果；其中，Μ为DL15000DNA Marker :从上 到下分别为 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp，1-93 泳道为样本。
[0024] 图2为本发明引物浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker，1? 5 引物浓度分别为 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5μΜ。
[0025] 图3为本发明dNTPs浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker，l? 5dNTPs 浓度分别为 10、20、30、40、50 μ Μ。
[0026] 图4为本发明Taq DNA聚合酶浓度对SSR-PCR扩增结果；其中，Μ为DNA Marker， 1 ?5Taq DNA 聚合酶浓度分别为 0· 1、0· 25、0· 5、0· 75、L OU。
[0027] 图5为本发明对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNAMarker，1?5Mg2+浓度 分别为 〇· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5U。
[0028] 图6为本发明模板DNA浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker， 1?5模板DNA浓度分别为65、70、75、80、85ng。
[0029] 图7为本发明SSR-PCR引物对南方红豆杉的个体扩增结果。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031] 实施例南方红豆杉SSR-PCR反应体系的优化
[0032] 1材料与方法
[0033] 1. 1样品材料
[0034] 由中国林业科学研究院林业研究所邱德有教授提供的南方红豆杉作为优化实验 材料。
[0035] 1. 2基因组DNA的提取
[0036] 用改良CTAB法提取基因组DNA。提取的总DNA用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及 完整性，结果如图1所述。核酸蛋白分析仪Nanodrop 8000测定结果显示，A260/A280值位 于1. 7-1. 9之间。结果表明，用改良的CTAB方法提取，能够得到高质量的DNA，可直接用于 SSR-PCR 反应。
[0037] 其中，模板DNA的提取包括以下步骤：
[0038] (1)取_70°C保存的南方红豆杉嫩叶0. 5?lg，放入经液氮预冷的研钵中，加入液 氮研磨成粉末；
[0039] (2)将粉末快速转移到2mL离心管中，加入lmL 65°C预热的CTAB提取液，充分混 匀，65°C水浴30?45min。其间不时摇动离心管使之混匀；
[0040] (3)取出离心管，4°C 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；
[0041] (4)加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比25 :24 :1)轻轻地颠倒混 勻，放置 l〇min，4°C 12000rpm 离心 10min;
[0042] (5)重复步骤（4);
[0043] (6)吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的_20°C预冷无水乙醇和1/10体积醋 酸钠，混匀，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ;
[0044] (7)4°C 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500yL 去离子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ;
[0045] (8 )溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇(体积比24 :1)抽提一次；
[0046] (9)沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50 μ L去离子水；
[0047] (10) 1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，_20°C保存。
[0048] 1.3 SSR-PCR 程序
[0049] PCR反应在GeneAmp 9600 PCR仪上进行。PCR反应扩增程序：94°C预变性5min， 94°C变性45s，56°C复性45s，72°C延伸45s，进行35个循环，最后60°C延伸30min。
[0050] 1.4 SSR-PCR 体系
[0051] 为得到扩增稳定可靠、重复性好的SSR-PCR反应体系，对影响PCR的5个主要因 素(模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物）分别进行了单因子多水平的优化实验。 SSR-PCR反应的主要因素水平见表1。
[0052] 表1 SRAP-PCR反应的因素与水平
[0053]
【权利要求】
1. 南方红豆杉SSR-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积20uL，其中，上、 下游引物各 2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA 聚合酶 lU、Mg2+l. OmM 和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配 制； 其中，上游引物 F:5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下游引物 R: 5' -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3'。
2. 根据权利要求1所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，PCR扩增程序为：94°C 51^11;941：458,561：458,721：458,35个循环；6〇1：3〇11^11。
3. 根据权利要求1或2所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，模板DNA的提取包括以 下步骤： (1) 取-70°C保存的南方红豆杉嫩叶0. 5?lg，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研 磨成粉末； (2) 将粉末快速转移到2mL离心管中，加入lmL 65°C预热的CTAB提取液，充分混匀， 65°C水浴30?45min。其间不时摇动离心管使之混勻； (3) 取出离心管，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清到新离心管中； (4) 加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇轻轻地颠倒混匀，放置10min，4°C 12000rpm离心lOmin ;其中，Tris平衡酚、氯仿、异戊醇的体积比为25 :24 :1 ; (5) 重复步骤（4); (6) 吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20°C预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠， 混匀，-20°C放置30min以上，沉淀DNA ; (7) 4°C 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500yL去 离子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ; (8) 溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一次；其中，氯仿、异戊醇的体积比为24 :1 ; (9) 沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50 μ L去离子水； (10) 1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20°C保存。
4. 权利要求1-3任一项所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种 中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104099319SQ201310117573
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月7日 优先权日:2013年4月7日
【发明者】付伟, 任鹤, 朱振营, 黄新 申请人:中国检验检疫科学研究院