专利名称：检测温氏附红细胞体的pcr试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因检测领域，涉及检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒。
背景技术：
附红细胞体病(Eperythrozoonsis)是由血液寄生生物-附红细胞体
(Eperythrozoon)引起的一种人畜共患病,它主要寄生于人和动物红细胞表面、血衆及骨髓中，具多形态性。感染后多呈隐性经过，急性发病时以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状。附红细胞体对畜牧养殖业和人类健康具有重要的危害性及潜在危害性，主要体现在:①破坏宿主红细胞，严重影响动物红细胞的输氧功能及免疫力，使患畜的抵抗力下降，易继发或并发其他疾病，造成严重经济损失。②该病可垂直传播，怀孕动物感染时可引起弱胎、死胎或流产，后代生长发育迟缓。③不同种动物的附红细胞体可产生交叉感染，据资料证实小鼠、家兔、以及奶牛之间存在着交叉感染，与患病畜频繁接触的饲养员或兽医，其附红细胞体感染率达到了 90%，因此，推断奶牛的附红细胞体很可能感染人，本病已成为一个不容忽视的公共卫生问题，这给人类健康带来严重的威胁。附红细胞体病流行范围广，感染的宿主种类多。目前，世界上已有30多个国家和地区报道过该病，我国已有20多个省、市、自治区相继报道发现本病流行，所感染的宿主包括牛、羊、猪、兔、马、犬、猫和人等。在已经报道的附红细胞体种类中，温氏附红细胞体(Eperythrozoon wenyonii, E.wenyonii)是引起牛发生附红细胞体病的重要病原。目前在对温氏附红细胞体病的诊断主要采用镜检，病初进行鲜血压片或涂片，染色镜检能给予检出，但受检查者对温氏附红细胞体的观察影响和检查条件的干扰，而当病畜患有贫血时，红细胞和附红细胞体均受破坏，则检出附红细胞体相对困难，此外利用此方法无法将一些立克次氏体病原如牛边缘无浆体区分开来，因而容易出现误诊。由于宿主产生的抗体是针对受破坏的红细胞而不是针对附红细胞体本身，因而在应用补体结合试验、间接血凝试验(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学方法诊断附红细胞体感染时，诊断的特异性不强。因此，探索开发简易、敏感、特异的诊断技术是当前研究附红细胞体病的首要任务。PCR检测技术以其特异性强，敏感性高、检出速度快等特点，已被广泛用于细菌、病毒等微生物的检测。但是不同种类的附红细胞体亲缘性较近，无法将温氏附红细胞体与其他种类的附红细胞体区分开。为准确和快速诊断温氏附红细胞体病，急需一种对温氏附红细胞体特异好，扩增效率高的检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，为诊断该疾病提供可靠的技术保障。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供温氏附红细胞体的PCR试剂盒，对温氏附红细胞体特异好，灵敏度高，能够准确快速的诊断温氏附红细胞体病。
为实现上述发明目的，技术方案为:
检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，包括如SEQ ID N0.1所示的上游引物和如SEQ IDN0.2所示的下游引物。优选的，所述上游引物的浓度为20 ymol/L，所述下游引物的浓度为20 μ mol/L。优选的，还含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶和双蒸水。更优选的，所述PCR缓冲液浓度为10 mmol/L, MgCl2浓度为2.5 mmol/L, dNTPs浓度为2.5 mmol/L, DNA聚合酶的浓度为5U/^L。最优选的，所述PCR试剂盒的反应体系为:每25μ 反应体系含有24μ 如下组分，
2.5 μ L 浓度为 IOmmoI/L 的 10XPCR 缓冲液，1.5 μ L 浓度为 2.5mmol/L 的 MgCl2, 2 μ L 浓度为2.5mmol/L的dNTPs, I μ L浓度为20 μ mol/L的上游引物，I μ L浓度为20 μ mol/L的下游引物，0.125μ 浓度为5U/^L的DNA聚合酶，余量为水。本发明的有益效果在于:本发明公开的温氏附红细胞体的PCR试剂盒，引物特异性好，能够特异扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列，而不能扩增猪附红细胞体、羊附红细胞体等的16S rRNA基因序列，因此能够避免假阳性，并且该试剂盒的灵敏度高，最小检测量为1.1Χ10_6μ g/mL ;与常规的温氏附红细胞体病诊断方法，如与鲜血压片或涂片染色镜检、补体结合试验、间接血凝试验(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学试验相t匕，具有灵敏度高、特异性好、操作简便、易标准化等优点，与现有PCR方法相比，特异性强、灵敏度高，降低假阳性和假阴性。
图1为对感染温氏附红细胞体的水牛、奶牛和黄牛血样PCR检测结果，其中M:DL-2000 ；S1-S3:水牛全血基因组DNA ；N1-N3:奶牛全血基因组DNA ;H1_H4:黄牛全血基因组 DNA。图2为特异性PCR电泳结果图，其中，M:DL2000 ；1:温氏附红细胞体；2:猪附红细胞体；3:羊附红细胞体；4:大肠杆菌DNA ；5:空白对照。图3为温氏附红细胞体特异性PCR敏感性图，其中M:DL-2000 ;0:阴性对照；1-8:稀释浓度分别为 55.14 μ g/mL、11.028 μ g/ mL、2.2056 μ g/ mL、0.44 μ g/ mL、8.8Χ1(Γ2μ g/ mL ml、1.76Χ1(Γ2μ g/ mL、3.529Χ1(Γ3μ g/ mL 和 7.058Χ1(Γ4μ g/ mL。图4为温氏附红细胞体特异性PCR敏感性图，其中M:DL-2000 ;0:阴性对照；9-16:稀释浓度分别为 7.058Xl(T4yg/ mL、l.412X 1(Γ4μ g/ mL、2.82 X 1(Γ5 μ g/ mL、
5.6 X 10 6 μ g/ mL、1.1 X 10 6 μ g/ mL、2.2Χ 10 7 μ g/ mL>4.4 X 10 8 μ g/ mL和 8.8Χ 10 9 μ g/mL。
具体实施例方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1
采集感染温氏附红细胞体的奶牛、黄牛和水牛血样，利用Promega公司的DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)提取全血基因组 DNA。选取GenBank中收录的牛、羊、猪、猫、兔附红细胞体的16S rRNA基因核苷酸序列，设计并合成一对扩增附红细胞体的16S rRNA的引物，理论扩增片段为446bp，引物序列如下:
上游引物 Cml:5，-cgaacgagtggaacttgttctgc-3，(SEQ ID N0.1)；
下游引物 Cm2:5，-tagtaccatcaaggcgtgctc-3’ (SEQ ID N0.2)；
弓I物序列由上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成。以制备的基因组DNA为模板，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系如表I所示:
表1、PCR反应体系组成__
权利要求
1.检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于:包括如SEQID N0.1所示的上游引物和如SEQ ID N0.2所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于:所述上游引物的浓度为20 ymol/L，所述下游引物的浓度为20 ymol/L。
3.根据权利要求1所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于:还包括10XPCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶和双蒸水。
4.根据权利要求3所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于:所述10XPCR缓冲液浓度为10 mmol/L, MgCl2浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为2.5 mmol/L，DNA聚合酶的浓度为5U/^L。
5.根据权利要求1-4任一项所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒的反应体系为:每25μ 反应体系含有24PL如下组分，2.5 μ L浓度为IOmmol/L 的 10XPCR 缓冲液，1.5 μ L 浓度为 2.5mmol/L 的 MgCl2, 2 μ L 浓度为 2.5mmol/L 的 dNTPs，I μ L浓度为20μπιΟ1/1的上游引物，I μ L浓度为20μπιΟ1/1的下游引物，0.125μ 浓度为5υ/μ 的DNA聚合酶，余量为水。
全文摘要
本发明公开了检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，含有检测温氏附红细胞体16SrRNA基因的特异引物，其中上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，该引物能够特异扩增温氏附红细胞体的16SrRNA基因，而不能扩增猪附红细胞体、羊附红细胞体及大肠杆菌的16SrRNA基因片段，并且灵敏度高，最小检测量为1.1×10-6μg/mL，将本发明公开的PCR检测试剂盒用于临床诊断，性能稳定，操作方便，易于标准化。
文档编号C12Q1/04GK103160600SQ20131011745
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者蒋勇, 胡洪平, 吴刚 申请人:四川汇博兽药科技有限公司