一种酶解制备褐藻胶寡糖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶解制备褐藻胶寡糖的方法，所用菌株是一种无致病性的链霉菌属微生物---紫色链霉菌(Streptomyces?violaceoruber)。该菌分泌到胞外的褐藻胶裂解酶具有较高的降解活力，可降解褐藻胶生产褐藻胶寡糖。酶解液经过乙醇沉淀，离心，冷冻干燥后得到的褐藻胶寡糖主要聚合度为2-6，经过实验发现该寡糖具有促进小麦生长的生物活性。本发明的制备方法具有成本低、操作及工艺路线简单，设备少等优点。
【专利说明】一种酶解制备褐藻胶寡糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶解褐藻胶寡糖及其制备方法，属于农业应用领域。
【背景技术】
[0002] 褐藻胶寡糖（alginate oligosaccharides)是褐藻胶经水解而得到的聚合度较 小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻胶寡糖具有多种生理活性，可广泛应用在食品、 医药、农业及化妆品等领域中，因此具有巨大的应用和开发价值。褐藻胶寡糖的制备方法 主要有化学水解法以及褐藻胶裂解酶水解法。由于褐藻胶裂解酶水解法具有底物专一性 好、反应条件温和等优点，近年来备受关注。褐藻胶裂解酶在自然界中来源广泛。目前，已 报道有多种微生物具有褐藻胶裂解酶的活性，如交替单胞菌（Alteromonas sp.)，假交替单 胞菌（Pseudoalteromonas)，海洋弧菌（Vibrio sp.)等。然而，这些微生物中有许多为致 病菌，如海洋弧菌可感染哺乳动物引起败血症，因而限制了这一类微生物的应用。紫色链 霉菌（Streptomyces violaceoruber)是从土壤中分离得到的具有褐藻胶裂解酶活性且无 致病性的链霉菌属微生物（紫色链霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏编号： CPCC200534,来源：中国医学科学院医药生物技术研究所，收藏时间1970年）。该菌产生的 褐藻胶裂解酶活性较高且可分泌到胞外。本发明以褐藻胶多糖为原料，制备出主要聚合度 2-6的褐藻胶寡糖，植物实验证实其具有促生长作用，可用于制备植物促生长剂。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术制备褐藻胶寡糖过程繁琐、寡糖功效不明确的缺 陷，提供一种具有农业应用价值的褐藻胶寡糖，简称A0S(Alginate Oligosaccharides),并 提供了提取上述物质的制备方法，适用于工业化生产。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 本发明涉及一种从酶解后的褐藻胶多糖中制备褐藻胶寡糖的方法，包括以下步 骤：
[0006] (1)产酶：取菌种紫色链霉（紫色链霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保 藏编号：CPCC200534,来源：中国医学科学院医药生物技术研究所，收藏时间1970年）一环 加入液体培养基中，28°C -35°C摇床培养5-8天，摇床转速为150-200转/分。离心除去菌 体后，得发酵粗酶液。
[0007] (2)酶解：将浓度为0. 5%_2%的褐藻胶多糖溶液，加入等体积的紫色链霉菌发酵粗 酶液，反应温度为45°C -55°C，持续搅拌8h-10h。
[0008] (3 )醇沉：提取液等体积加入加乙醇调浓度至70-85%，静置12h_24h后， 8000-10000转/分离心除杂。
[0009] (4)浓缩：将糖液经过旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得褐藻胶寡糖（A0S)。
[0010] 所得的酶解褐藻胶寡糖具有如下特征：
[0011] (1)物理性状：微黄或白色粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂。
[0012] (2)组成分析：电喷雾-质谱显示其主要的聚合度为2-6。
[0013] 该酶解褐藻胶寡糖具有促进小麦根系生长、增加小麦鲜重的生物活性。
[0014] 所述褐藻胶寡糖可制成水剂，在使用时可采取喷施或灌根处理。
[0015] 本发明具有如下优点：
[0016] 1本发明采用的褐藻胶降解酶酶活力高且为胞外酶，短时间内就可将多糖降解完 全，工艺步骤少，所用设备少，成本低。
[0017] 2所得褐藻胶寡糖可检测的聚合度为2-10,主要聚合度为2-6。
[0018] 3本发明表明褐藻胶寡糖具有促进小麦根系生长、增加小麦鲜重，对环境无污染、 无残留，是一种低成本、绿色环保的新型农用促生长剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0020] 图1褐藻胶寡糖的电喷雾-质谱图；
[0021] 图2褐藻胶寡糖对小麦根系生长的影响；
[0022] 图3褐藻胶寡糖对小麦苗长的影响；
[0023] 图4褐藻胶寡糖对小麦鲜重的影响。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1紫色链霉菌发酵粗酶液的制备方法，包括以下步骤：
[0025] (1)菌体活化：将保存在-80 °C冰箱中的甘油中的紫色链霉菌（紫色链霉菌 (Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏编号：CPCC200534,来源：中国医学科学院医药 生物技术研究所，收藏时间1970年）吸取100 μ 1，均匀涂布于褐藻胶平板培养基(质量分 数分别为〇. 05%_0. 5%的蛋白胨和0. 05%-0. 5%酵母粉为氮源，0. 5%-2%褐藻胶，0. 1%-1%的 ΚΗ2Ρ04,0. 01%-0. 1%的MgS04 · 7Η20,1%-2%琼脂，余量为水）中，30°C下培养3天，直至菌落 出现。
[0026] (2)菌体发酵：取平板培养基中的紫色链霉菌一环加入褐藻胶液体培养基(液体培 养基组成：质量分数分别为〇. 2%的蛋白胨和0. 3%酵母粉为氮源，1. 4%褐藻胶，0. 4%KH2P04， 0. 06%MgS04 ·7Η20,余量为水）中，30°C摇床培养6天，摇床转速为150转/分。4000转/分 离心除去菌体后，得发酵粗酶液。
[0027] 实施例2 -种酶解褐藻胶寡糖的的制备方法，包括以下步骤：
[0028] (1)酶解：将质量浓度为2%的褐藻胶溶液，加入等体积的紫色链霉菌发酵粗酶液， 反应温度为50°C，持续搅拌10h。
[0029] (2)醇沉：酶解液加入乙醇调浓度乙醇终质量浓度至70-85%，静置12h后，8000转 /分离心除杂，得糖液。
[0030] (3)浓缩：将糖液经过旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得褐藻胶寡糖（A0S)。
[0031] 实施例3褐藻胶寡糖的聚合度检测
[0032] 其中褐藻胶寡糖的质量由配有电喷雾离子源（ESI)液相色谱-质谱联用仪测定。 色谱测定条件为：质谱模式为正离子模式；电喷雾离子源（ESI);喷雾电压4. 5kV ;传输毛细 管温度 35〇°C;鞘气（Sheath gas, N2)压力为3〇au (lau 约为 lpsi)，辅助气（Aux gas, N2) 压力为5au，离子吹扫气（Ion swe印gas, N2)压力为Oau;扫描范围：150?2000。含量采 用比色法测定。其电喷物电离质谱图谱见图1。
[0033] 经检测如图1所示，褐藻胶寡糖聚合度为2-10,其主要聚合度为2-6。
[0034] 实施例4植物实验评价酶解褐藻胶寡糖的促生长活性
[0035] ( 1)受试样品：褐藻胶寡糖糖，按照实验施例1所述的方法制备。
[0036] (2)实验植物：小麦西农979 (Triticum aestivum L.)。培养条件为：小麦种子用 75%酒精灭菌lOmin，用蒸馏水冲洗干净后，将种子浸泡在无菌的双蒸水中浸种8h，黑暗中 发芽3天，选取相同长势的麦苗在霍德兰培养液中培养3天，昼夜循环为12h/12h，温度为 25°C /20°C，相对湿度 60%，光照强度为 800 μ mol · πΓ2 · s'
[0037] (3)检测项目：小麦根长、苗长和鲜重。
[0038] (4)实验方法：设立4组处理，包括空白对照组（Control，蒸馏水喷施)，褐藻胶寡 糖处理组A0S1(质量浓度0. 01%A0S，余量为水)，褐藻胶寡糖处理组A0S2(质量浓度0. 1%A0S， 余量为水)和褐藻胶寡糖处理组A0S3 (质量浓度1%A0S，余量为水)。小麦培养至3天时，用 不同浓度褐藻胶寡糖或蒸馏水叶片喷施小麦，平均每株施用量为10mL，96h后取样测定。
[0039] (5)结果：
[0040] 褐藻胶寡糖对小麦根系生长的影响：A表示蒸馏水处理的空白对照组，B表示 1%A0S处理组。由图2所示，3个浓度的的A0S均可显著促进小麦根部生长，尤其以0. 01% 和1%浓度最佳。
[0041] 褐藻胶寡糖对小麦苗长的影响：由图3可见，所有的A0S处理组小麦苗的长势明显 商于空白对照组。
[0042] 褐藻胶寡糖对小麦鲜重的影响：图4所示，所有的A0S处理组小麦鲜重均高于空白 对照组,0. 1%和1%浓度的A0S对小麦鲜重的提高作用更加明显。
[〇〇43] 本发明在植物实验中发现，褐藻胶寡糖能够促进小麦根系生长、增加小麦鲜重。综 上结果显示褐藻胶寡糖具有促进植物生长的作用。
【权利要求】
1. 一种酶解制备褐藻胶寡糖的方法，其特征在于：由紫色链霉菌所产的褐藻胶降解酶 降解褐藻胶得到褐藻胶寡糖，褐藻胶寡糖聚合度为2-10。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：褐藻胶寡糖聚合度为2-6。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 具体过程为：紫色链霉菌经过发酵产褐藻胶裂解酶后，得到的粗酶液加入褐藻胶多糖 溶液中降解，得到的酶解液分别经过乙醇沉淀，离心，旋转蒸发浓缩，冷冻真空干燥得褐藻 胶寡糖(AOS)。
4. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于： 所用褐藻胶裂解酶具有较高的酶活力和稳定性，褐藻胶寡糖降解过程为：配制1%_5% 质量浓度的褐藻胶多糖溶液；紫色链霉菌发酵液离心除去菌体，得到紫色链霉菌发酵粗酶 液，将褐藻胶多糖与等体积粗酶液混合，45°C -55°C下持续搅拌，降解8h-10h，得酶解液。
5. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述酶解液的后处理过程为：将降解后的酶解液加入乙醇，调乙醇终质量浓度为 70%-85%，静置12h-24h，8000-10000转/分离心除去未反应的聚糖和杂质，得到上清为褐藻 胶寡糖混合液，旋转蒸发浓缩除去乙醇，浓缩后的糖液冷冻真空干燥，得褐藻胶寡糖粉末。
6. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于： 紫色链霉菌经过发酵产褐藻胶裂解酶后得到粗酶液过程为：取菌种紫色链霉一环加 入50mL-150mL液体培养基中，28°C -35°C摇床培养5-8天，摇床转速为150-200转/分；离 心除去菌体后，得发酵粗酶液；液体培养基组成：质量分数分别为0. 05%-0. 5%的蛋白胨和 0· 05%-0· 5% 酵母粉为氮源，0· 5%-2% 褐藻胶，0· 1%-1% 的 ΚΗ2Ρ04,0· 01%-0· 1% 的 MgS04 ·7Η20， 余量为水。
7. 按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于： 所述紫色链霉菌为下述菌株之一： 紫色链霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏编号：CPCC200534,来源：中国 医学科学院医药生物技术研究所，收藏时间1970年； 菌株保藏编号：SCTCC200045,来源：四川大学生命科学院，机构名称：四川省委生物资 源保藏中心，隶属单位：四川大学，收藏时间：1986年； 菌株保藏编号：CCTCC AA92074,来源：中科院微生物研究所，机构名称：中国典型培养 物保藏中心，隶属单位：武汉大学，收藏时间：1992年； 菌株保藏编号：ACCC40986,来源：湖北省生物农药工程研究中心，机构名称：湖北省生 物农药工程研究中心，收藏时间：2006年。
【文档编号】C12R1/465GK104099386SQ201310116610
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】杜昱光, 刘航, 赵小明, 尹恒, 王文霞, 刘启顺 申请人:中国科学院大连化学物理研究所