一种荷叶离褶伞原生质体制备及再生方法
【专利摘要】本发明涉及一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法。该制备方法如下：将菌龄72-96h的荷叶离褶伞菌丝用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂处理后、用含有质量浓度1%溶壁酶与0.5%蜗牛酶的混合酶液于30℃酶解2.5-3h，然后自制针管过滤器分离，得到荷叶离褶伞原生质体，原生质体得率为4.79×107个/mL即5.76×105个/mg，原生质体再生率为7.81%。本发明溶壁酶和蜗牛酶的混和酶，较单一溶壁酶作用，提高了原生质体制备及再生率，而且降低了成本；本发明采用小针管小面积过滤的方法，较常规方法降低了成本，为利用原生质体技术进行荷叶离褶伞育种奠定基础。
【专利说明】一种荷叶离褶伞原生质体制备及再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及荷叶离褶伞原生质体的制备及再生方法。
【背景技术】
[0002] 荷叶离裙伞ofecasies)属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、离裙伞属食 用真菌，其菌丝及子实体蛋白质含量高，氨基酸种类齐全，还含有多种维生素，属野生优良 食用菌。食用菌的原生质体全能性较易体现，所以原生质体诱变、融合育种技术是目前食用 菌高产菌株及新菌株选育手段中最为高效经济的方法之一。而原生质体的成功制备是原生 质体诱变、融合育种技术的必要条件。目前国内尚未进行对荷叶离褶伞原生质体制备工艺 及方法的研究，因此，采用一种高效经济的方法制备荷叶离褶伞的原生质体具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 为解决以上技术中的不足，本发明的目的在于提供一种荷叶离褶伞原生质体的制 备及再生的方法。
[0004] 本发明的目的通过以下技术方案来实现： 一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法，其特征是： (1) 供试菌种 荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在"中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心"，菌种保藏号CGMCC N01518,菌株号ZY48-1，专利号 ZL200510096405. 0 ； (2) 溶壁酶和蜗牛酶混合酶液配置 用0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为1. 6-2. 4%、 蜗牛酶质量浓度为〇. 8-1. 2%，将1. 6-2. 4%溶壁酶和0. 8-1. 2%蜗牛酶按质量份数1 :1混合， 使混和酶中溶壁酶浓度为〇. 8%-1. 2%，蜗牛酶浓度为0. 4%-0. 6%，置于8000-10000r/min离 心10-15min，取上清用0. 22// m的微孔滤膜过滤，备用； (3) 荷叶离褶伞液体菌种培养 将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25°C恒温培养箱内，连续培养 5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0. 5cm的无菌打孔器取活化后的菌落三块，接种于 80mL-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL)中，在22-25°C、120-150r/min及黑 暗条件下连续培养72h-96h，得到活化液体菌种，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有 80-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL)中，22-25°C、120-150r/min及黑暗条件 下培养72h-96h。
[0005] (4)荷叶离褶伞原生质体的制备 取2层擦镜纸衬于直径10cm漏斗，置于121°C高压灭菌30min，将（3)步骤所得荷叶离 褶伞液体菌种倒入上灭菌漏斗过滤，用无菌水冲洗5遍，用0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗 漆2遍收集菌丝体，取30mg?80mg菌丝，加入（2)步骤所得0· 12mL?0· 32mL的溶壁酶 和蜗牛酶混合酶液，置于30°C黑暗酶解2. 5-3h，每30min-40min震荡一次，得到原生质体酶 解液；准备lmL规格的玻璃针管，在针管中预置脱脂棉，用针管的推进器压紧，最终脱脂棉 高度0. 5-0. 8cm，置于121 °C高压灭菌30min，得自制针管过滤器，用lmL移液枪将得到的原 生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将〇. 8-lmLO. 6mol/L蔗糖 渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于350〇r-4000r /min离 心10-15min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离裙伞原生质体，用0. 5mL0. 6mol/L的鹿糖渗 透压稳定剂洗漆下层悬浮液2-3次，再用0. 24mL?0. 64mL的0. 6mol/L鹿糖渗透压稳定剂 重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液； (5)原生质体再生 在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将（4 )步骤所得荷叶离褶伞原生质体 稀释至104个/mL，取该悬液80-100//L，涂布原生质体再生培养基上，原生质体再生培养基 为：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾lg，蛋白胨3g，蔗糖20g，0. 6m〇L/L蔗糖渗稳剂，琼脂 20g，水1000mL，pH值自然；25°C恒温黑暗培养10-15天统计原生质体再生率。
[0006] 本发明的优点和产生的积极效果： 采用质量浓度为1%溶壁酶和〇. 5%蜗牛酶的混和酶有助于发挥酶的互补作用，降低了 用量（250mg/mL)，较单一溶壁酶作用，提高了原生质体制备及再生率，而且降低了成本，为 利用原生质体技术进行荷叶离褶伞育种奠定基础。
[0007] 常规原生质体过滤方法常采用多层镜头纸过滤，因为接触面积较大，使大量原生 质体粘在过滤擦镜纸上，使原生质体损耗较大，与常规原生质体过滤方法相比，本发明的针 管过滤器，面积小(直径=0. 5cm)，可以通过针管推进器的推压使原生质体在很小的面积过 滤下来，大大减少原生质体损耗，从而提高了制备率，这样我们只需酶解较少的菌丝（30mg) 就能获得大量原生质体，酶消耗少（1. 8mg)，大大降低了科研中荷叶离褶伞原生质体的制备 费用。原生质体释放量达到4. 79 X 107个/mL即5. 76 X 105个/mg，原生质体再生率为7. 81%， 处于较高水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1为原生质体针管过滤器照片。
[0009] 图2为菌龄对原生质体制备及再生的影响。
[0010] 图3为酶解时间对原生质体制备及再生的影响。
[0011] 图4为渗稳剂对原生质体制备及再生的影响。
[0012] 图5为荷叶离褶伞原生质体（400X)图。 图6为荷叶离褶伞原生质体（1000X)图。
【具体实施方式】
[0013] 本发明的菌种 荷叶离褶伞菌种（保藏号CGMCC1518,菌株号ZY48-1，专利号ZL200510096405. 0)由河 西学院食用菌研究所提供。
[0014] 本发明的试剂 溶壁酶(广东省微生物研究所）；蜗牛酶(北京百泰生化技术公司）；纤维素酶（美国 bettery公司）；其他试剂均为国产分析纯。
[0015] 酶液的配置 用0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为2%、蜗牛酶 质量浓度为1%，将2%溶壁酶和1%蜗牛酶按体积比1 :1混合，使混和酶中溶壁酶浓度为1%， 蜗牛酶浓度为〇. 5%，置于10000r/min离心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔滤膜过滤，备 用； 用lmL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶蜗牛酶，使蜗牛酶终浓度为1%、置于 10000r/min离心lOmin，取上清用0. 22//m的微孔滤膜过滤，备用。
[0016] 用lmL 0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶，使溶壁酶质量浓度为1%、置于 10000r/min离心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔滤膜过滤，备用； 用lmL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使混合酶中溶壁酶终浓度 为1%、蜗牛酶终浓度为1%，置于10000r/min离心lOmin，取上清用0. 22//m的微孔滤膜过 滤，备用。
[0017] 用lmL 0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使混和酶中溶壁酶终 浓度为2%、蜗牛酶终浓度为1%，置于10000r/min离心lOmin，取上清用0. 22// m的微孔滤膜 过滤，备用。
[0018] 荷叶离褶伞菌丝原生质体制备方法 将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25°C恒温培养箱内，连续黑暗 培养5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0. 5cm的无菌打孔器取活化后的菌落3块， 将3块菌落均接种于80mL马铃薯葡萄糖液体培养基于250mL三角瓶中，置于25°C、120r/ min及黑暗条件下连续培养72h，得到活化液体菌种；取上述所得活化菌液4mL加入到80mL 马铃薯葡萄糖液体培养基于250mL三角瓶，置于25°C、120 r/min及黑暗条件下，连续培养 48h-168h得到荷叶离褶伞液体菌种，无菌条件下，用灭菌2层擦镜纸过滤得到的荷叶离褶 伞液体菌种，用无菌水冲洗5遍，用渗透压稳定剂洗涤2遍收集菌丝体。
[0019] 在无菌条件下，取30mg菌丝，加入上述所得0. 12mL的酶液，置于30°C及黑暗条件 下酶解0. 5-3h，每30min震荡一次，得到原生质体酶解液；用lmL移液枪将得到的原生质体 酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将lmL渗透压稳定剂加入自制针 管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于3500r/min离心lOmin，弃上清液，收集沉淀，即 得荷叶离褶伞原生质体。用〇. 5mL0. 6mol/L渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2次，再用2倍 酶解液体积的渗透压稳定剂重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液。（整个过程 在无菌条件下进行。）原生质体适当稀释后用血球计数板计数。原生质体得率（n/mg) =原生 质体个数（η) /菌丝质量（mg) 上述步骤中自制针管过滤器见图1，做法为：准备lmL规格的玻璃针管，先在针管中放 入0. 5cm厚脱脂棉，用针管的推进器压紧，灭菌备用。
[0020] 荷叶离褶伞菌丝原生质体再生方法 在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将荷叶离褶伞原生质体稀释至1〇4个 /mL，取该悬液100//L，涂布原生质体再生培养基上。原生质体再生培养基：马铃薯200g， 麸皮30g，磷酸二氢钾lg，蛋白胨3g，鹿糖20g，0. 6moL/L的渗透压稳定剂，琼脂20g，水 lOOOmL，pH值自然。25°C恒温恒湿黑暗培养10天统计原生质体再生率。
[0021] 原生质体再生率（％)=原生质体再生个数（η) /涂板原生质体个数（η) X 100% 荷叶离褶伞菌丝原生质体制备及再生条件优化 原生质体制备及再生中渗透压稳定剂的筛选 0.6 mol/L的MgS04、NaCl、蔗糖和甘露醇做为渗透压稳渗剂，用60h菌龄的荷叶离褶伞 菌丝体，用1%溶壁酶+0. 5%蜗牛酶的混合酶液，置于30°C黑暗条件下酶解2h，制备原生质 体并再生，统计原生质体制备率、再生率。
[0022] 实验结果表明（图2)，添加硫酸镁的培养基不凝固，以蔗糖作为渗稳剂时，原生 质的制备率最高，NaCl作渗透压稳定剂原生质制备率最低。在其它条件等同的情况下， 0. 6mol/L的蔗糖和甘露醇做渗透压稳定剂的再生率都较高，NaCl做渗透压稳定剂的再生 率最低，比较各渗透压稳定剂的制备率和再生率乘积发现选用〇. 6mol/L的庶糖时，_者乘 积最大。故荷叶离裙伞原生质体制备与再生的最适渗透压稳定剂为〇.6mol/L鹿糖。
[0023] 原生质体制备及再生中酶解时间的筛选 酶解时间分别为〇. 5h、lh、l. 5h、2h、2. 5h、3h，用60h菌龄的菌丝体，用0. 6mol/L蔗糖为 渗透压稳定剂，用1%溶壁酶+0. 5%蜗牛酶混合酶液，置于30°C黑暗酶解，制备原生质体并再 生，统计原生质体制备率、再生率。
[0024] 实验结果表明（图3)，原生质体制备率在一定的酶解时间范围内，随时间延长产量 显著提高，当达到2. 5h时，酶解产量较高，之后增加不明显，3. Oh时达到最大，之后随着时 间延长，原生质体制备率呈下降趋势。原生质体再生率2. 5h时达最大，之后随着时间延长， 原生质体再生率呈下降趋势。比较不同酶解时间的原生质体制备率和再生率的乘积，也发 现酶解时间为2. 5h时，二者乘积最大。故荷叶离褶伞原生质体制备与再生的最适酶解时间 为 2. 5h。
[0025] 原生质体制备及再生中荷叶离褶伞菌丝菌龄的筛选 菌龄选用48h、72h、96h、120h、144h、168h的菌丝体，0. 6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂， 1%溶壁酶+0. 5%蜗牛酶混合酶液，在温度30°C条件下黑暗酶解2. 5h，制备原生质体并再生， 统计原生质体制备率、再生率。
[0026] 由图4可见，96h菌龄的原生质体制备率最高，其次是72h>120h >48h>144h>168h， 原生质体再生率在72h菌龄最高，其次是48h >96h >120h>144h >168h。以二者的乘积作为 参考指标，比较各菌龄的原生质体制备率和再生率乘积发现菌龄为72h时，二者乘积最大。 因而，选择72h为荷叶离褶伞原生质体制备及再生的最佳菌龄。
[0027] 原生质体制备中酶及酶浓度的筛选 酶液分别采用1%蜗牛酶、1%溶壁酶、1%溶壁酶+〇. 5%蜗牛酶、1%溶壁酶+1%蜗牛酶和 2%溶壁酶+1%蜗牛酶混合酶液，0. 6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂，用菌龄72h的菌丝体，在 温度30°C及黑暗条件下酶解2. 5h，制备原生质体，统计原生质体制备率。
【权利要求】
1. 一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法，其特征是： (1) 供试菌种 荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在"中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心"，菌种保藏号CGMCC N01518,菌株号ZY48-1，专利号 ZL200510096405. 0 ； (2) 溶壁酶和蜗牛酶混合酶液配置 用0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为1. 6-2. 4%、 蜗牛酶质量浓度为〇. 8-1. 2%，将1. 6-2. 4%溶壁酶和0. 8-1. 2%蜗牛酶按质量份数1 :1混合， 使混和酶中溶壁酶浓度为〇. 8%-1. 2%，蜗牛酶浓度为0. 4%-0. 6%，置于8000-10000r/min离 心10-15min，取上清用0. 22// m的微孔滤膜过滤，备用； (3) 荷叶离褶伞液体菌种培养 将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25°C恒温培养箱内，连续培养 5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0. 5cm的无菌打孔器取活化后的菌落三块，接种于 80mL-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL)中，在22-25°C、120-150r/min及黑 暗条件下连续培养72h-96h，得到活化液体菌种，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有 80-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL)中，22-25°C、120-150r/min及黑暗条件 下培养72h-96h ; (4) 荷叶离褶伞原生质体的制备 取2层擦镜纸衬于直径10cm漏斗，置于121°C高压灭菌30min，将（3)步骤所得荷叶离 褶伞液体菌种倒入上灭菌漏斗过滤，用无菌水冲洗5遍，用0. 6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗 漆2遍收集菌丝体，取30mg?80mg菌丝，加入（2)步骤所得0· 12mL?0· 32mL的溶壁酶 和蜗牛酶混合酶液，置于30°C黑暗酶解2. 5-3h，每30min-40min震荡一次，得到原生质体酶 解液；准备lmL规格的玻璃针管，在针管中预置脱脂棉，用针管的推进器压紧，最终脱脂棉 高度0. 5-0. 8cm，置于121 °C高压灭菌30min，得自制针管过滤器，用lmL移液枪将得到的原 生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将〇. 8-lmLO. 6mol/L蔗糖 渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于350〇r-4000r /min离 心10-15min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离裙伞原生质体，用0. 5mL0. 6mol/L的鹿糖渗 透压稳定剂洗漆下层悬浮液2-3次，再用0. 24mL?0. 64mL的0. 6mol/L鹿糖渗透压稳定剂 重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液； (5) 原生质体再生 在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将（4)步骤所得荷叶离褶伞原生质体 稀释至104个/mL，取该悬液80-100//L，涂布原生质体再生培养基上，原生质体再生培养基 为：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾lg，蛋白胨3g，蔗糖20g，0. 6m〇L/L蔗糖渗稳剂，琼脂 20g，水lOOOmL，pH值自然；25°C恒温黑暗培养10-15天统计原生质体再生率。
【文档编号】C12N5/04GK104087548SQ201310110684
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】梁倩倩, 席亚丽, 魏生龙 申请人:梁倩倩