专利名称：一种柑桔溃疡病菌接种方法
技术领域：
本发明涉及植物病害、病原研究技术领域，特别是涉及一种柑桔溃疡病菌接种方法。
背景技术：
柑桔是世界第一大水果，在巴西、中国、美国等138个国家(地区)都有种植，总面积约800万hm2，总产量1.2亿余吨。中国是柑桔最重要的原产中心，目前柑桔栽培面积约190万hm2,年产量约2千万吨,分别居世界第一位和第二位。柑桔溃瘍病(citrus canker)是由地毪草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cirri)引起的柑桔毁灭性病害，为国内外重大检疫对象，主要侵染芸香科柑桔属、枳属及金柑属植物。该病害主要分布在亚洲、非洲及美洲的30多个国家，约占生产柑桔国家和地区的三分之一，其中以亚洲发生最为普遍。因此，对柑桔溃疡病的发生流行和防控技术研究的重要性可见一斑，而最基础的研究内容包含病原菌的致病性、菌系分化、药剂研制与筛选等，这些研究内容的必需手段之一即是病原菌的接种方法。传统的接种方法为针刺接种法，该方法通过针刺形成伤口，有助于病菌侵入，此方法虽然接种成功率高，但缺点也正是由于人为针刺形成伤口，提高了病菌的侵入可能，不能真实反应接种病菌的致病力。同时，针刺接种的发病点仅限于针刺位置，与自然发病的随机分布不符，不便于病害调查分级。
发明内容
为了克服传统接种方法的缺点，本发明的目的在于提供一种柑桔溃疡病菌接种方法，即喷雾接种法，是一种简便、高效及更符合病害发生发展客观实际的柑桔溃疡病菌接种方法。可真实反应接种用的柑桔溃疡病菌的侵入力、致病力，与田间自然发病相似，为柑桔溃疡病和其病原学的研究提供更合理的接种方法。
本发明所述的柑桔溃疡病菌接种方法依次通过下列步骤实现:
(1)用牛肉汁蛋白胨培养基(NA)培养柑桔溃疡病菌纯菌种；
(2)将培养好的菌种用无菌水稀释成浓度为IXlO8cfu/mL的菌体悬浮液；
(3)将菌体悬浮液均匀喷雾在柑桔活体植株或离体叶片上，使叶片刚好布满雾滴；
(4)接种完成后，将柑桔活体植株或离体叶片移入温度为23-28°C、相对湿度大于80%的环境中培养5天，然后移入普通环境中培养。
图1为传统针刺接种发病症状 图2为田间病害症状
图3为本发明接种发病症状 本发明的优点如下:
(I)操作简便，容易实施，实用性强。
(2)无人为创伤，病菌侵入能力、侵入途径和致病等方面更能反应真实情况。(3)接种方式与田间病菌接触寄主相似，症状表现贴近自然，更适宜于病害发病率和严重度调查。
具体实施例方式实施例1:离体叶片接种
(1)将柑桔溃疡病菌纯菌种用牛肉汁蛋白胨培养基(NA)活化培养24h ；
(2)将培养好的菌种用无菌水稀释成浓度约为IXlO8cfu/mL的菌体悬浮液；
(3)选取成熟初期的健康柑桔叶片，用70%酒精清洗表面30s，接着用无菌水冲洗1-2min，再用无菌滤纸轻轻吸干表面水分，在操作过程中保护叶柄伤口处不沾水；
(4)将步骤(2)准备好的菌体悬浮液用无菌微型喷雾器均匀喷雾在步骤(3)准备的叶片背面，以刚好布满雾滴为宜，无菌水为对照；
(5)接种完成后，将柑桔叶片移入温度为23-28°C、相对湿度大于80%的恒温箱或人工气候箱中培养，7天后可观察发病情况。
实施例2:活体植株接种
(1)将柑桔溃疡病菌纯菌种用牛肉汁蛋白胨培养基(NA)活化培养24h ；
(2)将培养好的菌种用无菌水稀释成浓度约为IXlO8cfu/mL的菌体悬浮液；
(3)选取有合适数量的初期成熟叶片的健康柑桔植株材料，且植株大小适合温室或人工气候箱培育；
(4)将步骤(2)准备好的菌体悬浮液用无菌微型喷雾器均匀喷雾在步骤(3)准备的柑桔植株叶片正反面，以无菌水作对照处理，叶片上刚好布满雾滴为宜；
(5)接种完成后，将柑桔植株移入温度为23-28°C、相对湿度大于80%的温室(或人工气候箱)中培养(也可保湿培养5天后移入常规温光环境中培养)，25天后观察症状情况。
权利要求
1.一种柑桔溃疡病菌接种方法，其特征在于依次通过下列步骤实现: (1)用牛肉汁蛋白胨培养基培养柑桔溃疡病菌纯菌种； (2)将培养好的菌种用无菌水稀释成浓度为IXlO8cfu/mL的菌体悬浮液； (3)将菌体悬浮液均匀喷雾在柑桔活体植株或离体叶片上，使叶片刚好布满雾滴； (4)接种完成后，将柑桔活体植株或离体叶片移入温度为23-28°C、相对湿度大于80%的环境中培养5天，然后移入普通环境`中培养。
全文摘要
一种柑桔溃疡病菌接种方法，先用牛肉汁蛋白胨培养基培养柑桔溃疡病菌，制成菌体悬浮液，然后喷雾接种在柑桔活体植株或离体叶片上进行培养。是一种简便、高效及更符合病害发生发展客观实际的柑桔溃疡病菌接种方法。可真实反应接种用的柑桔溃疡病菌的侵入力、致病力，与田间自然发病相似，更适宜于病害发病率和严重度调查。操作简便，容易实施，实用性强。
文档编号C12Q1/02GK103173515SQ20131009218
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者马冠华, 董国菊, 肖崇刚 申请人:西南大学