专利名称：一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术：
2010年4月以来，我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。在疫病流行初期，根据主要病变和临床特点，将该流行性疾病称为鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis,DH0)。随着病原学研究的深入,该病被确诊是由一种新型黄病毒——鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)引起。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”。我们从某大型鸭场的发病种鸭群中分离到一株病毒，经初步鉴定该病毒为有囊膜的RNA病毒。RT-PCR扩增测序显示该病毒与黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒亲缘关系最近，随将该病毒称为鸭坦布苏病毒WFG36 株。由于对该新型流行疾病无特效治疗方法，疫苗的研制开发是控制该疾病的首选措施。 目前已有灭活疫苗的研究报道，此前，申请人已经于2011年8月31日提交了灭活疫苗的发明专利申请，申请号为201110254517.X。但在实际应用中，活疫苗相比灭活疫苗有着产生抗体快、副反应小等优势，目前，申请人通过人工驯化，获得了鸭坦布苏病毒的弱毒株，可用于制备鸭坦布苏病毒活疫苗的制备。申请人将鸭坦布苏病毒WFG36株，在CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)上经人工连续传代培养，病毒对实验鸭的致病力显著降低，并保持了良好的免疫原性和遗传稳定性，命名为“鸭坦布苏病毒WF100株”。
发明内容
本发明的目的在于利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株鸭坦布苏病毒WFG36株，在CEF细胞上连续传代致弱而筛选出具有良好免疫保护率的弱毒疫苗株WF100株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前中国流行鸭坦布苏病毒的攻击提供良好免疫保护效力。本发明技术方案1..本发明所涉及的鸭坦布苏病毒活疫苗，含有经人工致弱的鸭坦布苏病毒(DuckTembusu virus)病毒株WF100株,该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCN0.7306。2.鸭坦布苏病毒活疫苗的制备方法是将鸭坦布苏病毒WF100株接种生长良好的CEF细胞、VERO细胞和BHK21细胞中任一种细胞单层繁殖，连续观察72 96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制备成鸭坦布苏病毒活疫苗。
3.一种鸭坦布苏病毒活疫苗的应用是给鸭接种有效剂量的一种鸭坦布苏病毒活疫苗能使接种鸭获得对鸭坦布苏病毒产生有效预防的免疫力。
具体实施例方式1.疫苗生产用弱毒株的培育使用9 10日龄活力良好的SPF鸡胚制备CEF细胞，待细胞长成单层后，用鸭坦布苏病毒(DTMUV)WFG36强毒株·按照5%接种量接种细胞，观察细胞病变情况，72 96小时后，无菌收集细胞悬液，进行下一次传代。连续传至100代，进行致弱评价试验，如下:将WFG36株P40、P60、P80、P100代毒分别接种230日龄左右产蛋鸭(产蛋率85% 90%)，每只肌肉注射1ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭群的发病情况、采食量和产蛋量。WFG36株P40、P60代毒接种产蛋鸭后第2天，采食量明显下降，第7 8天采食开始恢复，第11 12天采食恢复正常水平，产蛋率在接种后第9日降至30%，此后开始回升，21日时恢复至约60%。P60代毒接种产蛋鸭后第2天，采食量下降约50%，第6 7天采食基本恢复正常水平，产蛋率在接种后第6日降至约42.5%，第7天又开始回升，21日时恢复至约80%。P40、P60代毒接种产蛋鸭后有部分鸭只表现走路摇晃、站立不稳，排绿色稀便。剖检可见卵泡膜充血、出血，卵泡变形、变性，输卵管炎性病变等病理变化。P80、P100代毒接种产蛋鸭后，采食量无明显下降，产蛋量仅表现一过性下降，4天后恢复正常。剖检未见卵泡膜充血、出血，卵泡变形、变性，输卵管炎症等特征性病理变化，与对照鸭一致。说明P80、P100代毒已经致弱，对产蛋鸭没有致病性。选取PlOO代毒作为疫苗研制的候选毒株，命名为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)WF100株(简称DTMUV WF100株),该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCN0.7306。2.病毒株特性(I)病毒培养将DTMUVWF100株病毒样品按5%比例接种CEF细胞单层，置37°C、5%C02培养箱中静置培养，每天观察CPE，72 96小时后，当细胞出现病变达80%时收获，置_20°C保存。传代毒液作毒价测定。病毒含量稳定维持在106_ 5TCID5cZml 107_°TCID5(l/ml。(2)免疫原性取20只I日龄SPF鸭随机分成2组，每组10只，于负压隔离器中隔离饲养。5日龄时，其中一组肌肉注射DTMUVWF100株细胞毒0.5ml, IO4-5TCID50/只，另一组作为对照，每只肌肉注射生理盐水0.5ml。14日后以相同途径和剂量进行二次免疫，自接种之日起，每天观察记录鸭群发病情况。二免后21天，将2组雏鸭用鸭坦布苏病毒WFG36强毒株进行攻毒，肌注0.5ml/只。攻毒后第5天，剖杀，采集每只鸭的脾脏组织，适当处理后，脾脏研磨滤液分别经卵黄囊接种6 7日龄易感鸡胚5枚，0.2ml/胚，进行病毒再分离。免疫组1/10只鸭病毒分离阴性，对照组10只鸭病毒分离阳性。以上实验经过2次重复，结果一致。说明WF100株毒具有良好的免疫保护性。(3)纯净性按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011)附录进行，0了11爪^^100株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病
毒污染。(4)特异性将毒种用DMEM液稀释100倍(DTMUVWF100株毒种病毒含量为:106 0TCID50/1.0ml)，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37°C中和I小时，接种已长成单层的CEF细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。另设病毒感染对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37°C、含5%C02培养箱中培养，连续观察120 144小时。中和组和正常细胞对照组未出现细胞病变效应(CPE)。病毒对照孔全部出现CPE。3.鸭坦布苏病毒活疫苗的制备将DTMUVWF100株 接种良好细胞单层，连续观察72 96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，用最适合此毒株的冻干曲线进行冻干，制备鸭坦布苏病毒活疫苗。具体有以下制备步骤:( I)选择鸭坦布苏病毒WF100株作为疫苗生产用种毒；(2)选择CEF细胞或Vero细胞或BHK21细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料；(3)抗原的制备，可通过以下3种途径实现:I)选择CEF细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，按5%接种到单层CEF细胞，放置于转瓶机上培养；接毒后每12h观察一次，当细胞典型病变时，继续培养至72 96h，至细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于_20°C保存。2)选择VeiO细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种到单层的Vero细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养，接毒后每12h观察一次,培养至72 96h,收获毒液,将接毒细胞置于-20。。。3)用BHK21细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种到单层BHK细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养，接毒后每12h观察一次，培养至72 96h，细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于_20°C保存。(4)制备的抗原(收获的病毒液)，应按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》)附录逐瓶作无菌检验和外源病毒，并抽样I份测定病毒含量(TCID5tl),应无菌生长，无外源病毒污染，每0.1ml病毒含量应> IO5'0TCID50O(5)疫苗制备经无菌检验和病毒含量测定合格的细胞毒液与牛奶冻干保护剂按1:1配苗。配苗过程中应使冻干保护剂和病毒液充分混匀。疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。4.鸭坦布苏病毒活疫苗的检验(I)性状:疫苗呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验:按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。(3)支原体检验:按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。(4)鉴别检验:将疫苗用含1%新生牛血清的维持液稀释至I羽份/ml后再做10倍稀释，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37°C中和I小时，接种已长成单层的CEF细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至I羽份/ml后再做10倍稀释，与等量含1%新生牛血清的维持液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37°C、含5%C02培养箱中培养，观察120 144小时。中和组和细胞对照组应不出现细胞病变效应(CPE)，不中和对照组应全部出现CPE。(5)外源病毒检验:按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。(6)安全检验:取I 2周龄SPF鸭(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗I头份，观察14天，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。(7)效力检验:将疫苗用灭菌生理盐水稀释至0.5ml含I羽份，肌肉接种3 7日龄健康易感鸭或SPF鸭10只，每只0.5ml,同时设对照鸭10只。一免后14日，按照同样剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫，二免后21日每只肌肉注射lmlWFG36株强毒(约含10X104 °ELD50)o攻毒后观察5日，剖杀，取脾脏进行病毒分离。对照组应至少8只病毒分离阳性，免疫组应至少7只病毒分离阴性。本发明涉及微生物的资源信息本发明人将自行分离鉴定获得的鸭坦布苏病毒WFG36株(CGMCCN0.4718)，通过在CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)上经人工连续传代培养，病毒对实验鸭的致病力显著降低，并保持了良好的免疫原性和 遗传稳定性，命名为“鸭坦布苏病毒WF100株”经人工致弱的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)病毒株WF100株,该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCN0.7306。本发明的积极意义本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法。本发明利用一株人工致弱的鸭坦布苏病毒WF100株(保藏号是CGMCCN0.7306)作为生产病毒株，制备一种安全、有效的预防和控制鸭坦布苏病毒病的活疫苗。相比灭活疫苗具有免疫后动物副反应更小及可用于动物发生鸭出血性卵巢炎时的紧急免疫等优点。实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1免疫攻毒对比试验疫苗A:鸭坦布苏病毒活疫苗(WF100株)疫苗B:鸭坦布苏病毒灭活疫苗(WFG36株)取2周龄SPF鸭30只，平均分为三组，一组、二组分别颈部皮下注射疫苗A、疫苗B各I头份，三组为对照组不注射疫苗。14日后以相同途径和剂量进行二次免疫，二免后14日，三个组各取5只用鸭坦布苏病毒强毒WFG36株攻毒，肌注0.5ml/只；免疫后21天，将三个组各剩余的5只用鸭坦布苏病毒强毒WFG36株攻毒，肌注0.5ml/只，攻毒保护结果见表。表I鸭坦布苏病毒活疫苗(WF100株)和灭活疫苗(WFG36株)攻毒对比试验
权利要求
1.一种鸭坦布苏病毒活疫苗，其特征该疫苗中含有经人工致弱的鸭坦布苏病毒WFlOO株，该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCN0.7306。
2.如权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒活疫苗的制备方法，其特征是，其特征将鸭坦布苏病毒WF100株接种生长良好的CEF细胞、VERO细胞和BHK21细胞中任一种细胞单层繁殖，连续观察72 96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制备成鸭坦布苏病毒活疫苗。
3.如权利要求2所述的一种鸭坦布苏病毒活疫苗的制备方法，其特征在于其中用于鸭坦布苏病毒WF100株繁殖的细胞是CEF细胞、VERO细胞和BHK21细胞中任一种细胞。
4.如权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒活疫苗的应用，其特征在于给鸭接种有效剂量的一种鸭坦布苏病 毒活疫苗能使接种鸭获得对鸭坦布苏病毒产生有效预防的免疫力。
全文摘要
本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法。本发明利用一株人工致弱的鸭坦布苏病毒WF100株(保藏号是CGMCCNo.7306)作为生产病毒株，制备一种安全、有效的预防和控制鸭坦布苏病毒病的活疫苗。相比灭活疫苗具有免疫后动物副反应更小及可用于动物发生鸭出血性卵巢炎时的紧急免疫等优点。
文档编号C12N7/00GK103143008SQ20131007196
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者鲍海忠, 王蕾, 徐龙涛, 张青婵, 李晓静, 彭建云, 张中波, 陈茹, 薛原, 巩志宏 申请人:齐鲁动物保健品有限公司