一种浊点系统中转化植物甾醇为雄烯二酮的方法
【专利摘要】本发明属于微生物制药领域。本发明提供了一种应用浊点系统进行植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法。本发明通过在转化培养基中添加非离子表面活性剂形成浊点系统，并通过选择转化底物、转化培养基组份及其它生物转化参数，建立了植物甾醇生物降解制备雄烯二酮的新工艺。本发明涉及的方法是以浊点系统代替传统的有机溶剂两相系统或有油系统来降解植物甾醇生产雄性二酮，此方法生物转化率高，工艺简单，经济实用，对用生物法转化法生产甾体药物有着非常重要的意义。
【专利说明】一种浊点系统中转化植物留醇为雄烯二酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物制药领域，具体涉及在浊点系统中转化植物留醇为留体药物重要中间体雄烯二酮的方法。
【背景技术】
[0002]留体激素类药物是临床上不可缺少的一类药物，对机体起着非常重要的调节作用。如肾上腺皮质激素具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘和湿疹等皮肤病，可治疗和缓解胶原性疾病、过敏性休克等难治或危险性疾病，也是治疗爱迪森氏等内分泌疾病的不可缺少的药物。各类性激素是医治雄性器官衰退和某些妇科疾病的主要药物，是口服避孕药的主要成分。此外，留体激素还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。由于甾类药物具有上述独特的疗效，所以这类药物发展很快，已逐渐成为医药领域的重要门类。其世界年产量达几万吨，成为仅次于抗生素的第二大类药物。
[0003]雄烯二酮是合成留体类激素药物重要的原料和关键的中间体，被广泛应用丁风湿性关节炎、避孕利尿和各种将感染性炎症控制等临床上治疗，市场前景非常广阔，是当前国家急需解决的留体激素药物的重要原料和中间体。目前传统的雄烯二酮的制备方法主要是薯蓣皂苷途径:即从野生中药材“穿地龙”、黄姜等植物中提取薯蓣皂苷，然后进行多步的化学合成。雄烯二酮传统的化学合成生产方法的局限性在于:(I)化学工艺过程复杂，步骤繁琐，累积产率低；(2)成本高、消耗大；(3)破坏环境。目前穿地龙资源十分紧张，人们无秩序、不科学采挖，不但破坏了地表植被，还破坏了生态环境。而人工种植黄姜由于种植周期长、大量占用耕地，且 严重破坏地力，大量浪费了有限的土地资源。此外，提取皂素过程也严重污染环境，许多省份已禁止生产。雄烯二酮的另外一条合成途径是通过微生物转化技术将甾醇侧链选择性切除得到雄烯二酮。微生物降解留醇侧链生成雄烯二酮过程中所遇到的最主要的问题是留醇底物在水溶液培养基中的溶解度问题。留醇是一种疏水性化合物，在水中溶解度极低，这就使得底物与微生物细胞不能很好地接触，导致转化率偏低及转化时间延长等一系列问题。因此，留醇的微生物转化，常常在远低于底物溶解度的浓度下进行。在这种固体底物与溶解底物共存的多相体系中，转化率不仅受酶活的影响，而且受到底物溶解速度的影响，从而进一步限制了微生物降解植物留醇侧链生成雄烯二酮的工业化生产。非离子表面活性剂溶液在达到一定温度或有添加物存在的条件下，溶液自动分相而形成表面活性剂浓度很小的稀相和富含表面活性剂的凝聚层相。溶液分相时的温度称为浊点，该系统称为浊点系统(cloud point system，CPS)。浊点系统除具有常规水-有机溶剂萃取系统的特征外，还具有其独特的优越性。非离子表面活性剂在通常温度下的挥发性低而被认为是一种绿色溶剂。浊点系统特殊的相结构，使凝聚层相具有高的含水率，从而提高了生物催化剂在系统中的稳定性。
[0004]由于浊点系统在甾体生物转化过程中的独特优势，本发明公开了在浊点系统中转化植物留醇为雄烯二酮的方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的缺陷，通过设计合理的浊点系统，提供一种高效、环保的转化植物留醇为雄烯二酮的方法。
[0006]本发明所要解决的技术问题由以下技术方案来实现:
[0007]本发明中微生物菌种为分子杆菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC29472 ;转化底物是植物留醇，可选豆留醇、谷留醇和菜油留醇或它们的混合物，优先选用豆甾醇。
[0008]采用本发明方法进行转化植物留醇制备雄烯二酮时，为促进植物留醇底物更好的溶解，克服传统的有机溶剂两相分配系统生物相容性差以及对微生物生长影响大的缺点，提高转化效果，在转化系统中添加非离子表面活性剂形成浊点系统。非离子表面活性剂可选用 Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60、Span80、TritonX-100和TritonX-114，浓度为0.03%-0.1 %。转化培养基中的碳源可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合，含量为0.5%-5%;氮源可选用酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合，含量为0.1% -3% ;微生物转化过程中可适当添加一定量的镁盐、磷酸盐和钠盐等无机成分，转化pH为6.0-9.0。
[0009]本发明中采用分子杆菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC29472在池点系统中进行转化植物留醇制备雄烯二酮时，优先的转化培养基为葡萄糖0.5-2.5%、酵母膏
0.2-1.5%、玉米浆0.5-2.0%、磷酸氢二钾0.02-0.08%和氯化钠0.01-0.05% ;植物甾醇投料浓度0.5.-3.0 非离子表面活性剂采用TritonX-1OO和Tween80组合或TritonX-114和Tween80组合，质量比为2.0-5.0: 1.0-1.5，混合非离子表面活性剂的优选浓度为
5.0% -10.0% ;转化 pH 为 6.8-7.5 ;转化温度为 26_35°C，转化时间 70_130h。
[0010]本发明涉及的转化产物分析方法采用HPLC法，具体分析方法如下:
[0011]样品制备:取转化液lmL，加入等体积乙酸乙酯，震荡均匀后放置分层。取上层有机相约800 μ L，用有机膜(0.4 μ m)过滤后供HPLC检测。
[0012]色谱条件
[0013]I)色谱柱:Inertsil 0DS-3,4.6mmX 250mmX 5 μ m 或等同；
[0014]2)流动相:甲醇:水=70: 30
[0015]3)检测波长:240nm
[0016]4)流速:1.0mT ,/mi η
[0017]5)柱温:30 O
【具体实施方式】
[0018]以下通过不同具体实例对本发明做进一步描述，但本发明的内容不仅限于此。
[0019]实施例1
[0020](I) 一级种子培养基:酵母膏1.3-1.4%，葡萄糖1.2%，水，调pH为7.0-7.2。将分子杆菌(Mycobacterium fortuitum) ATCC29472从斜面接一环至20mL种子培养基中，在旋转式摇床200rpm转速下，30°C培养28h，既得适于接种的种子。
[0021](2)转化培养基:葡萄糖0.8%、酵母膏0.5%、玉米浆1.5%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钠0.01% ;植物留醇投料浓度0.5% ;非离子表面活性剂(TritonX-100: Tween80 =3.0: 1.0)7%，pH为7.0。将培养好的一级种子培养基按10% (W/W)接种量接入10mL灭菌后转化培养基，200rpm转速下，28°C震荡培养。
[0022]转化培养结束后测得转化率为85.6%。
[0023]其中转化率指摩尔转化率；组份百分含量指质量与体积之比(W/V);非离子表面活性剂的配比指它们之间的质量之比(W/W)。
[0024]实施例2
[0025](I) 一级种子培养基:酵母膏1.0%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，水，调pH为7.0。将分子杆菌(Mycobacterium fortuitum) ATCC29472从斜面接一环至20mL种子培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，31°C培养24h，既得适于接种的种子。
[0026](2)转化培养基:葡萄糖1.0 %、酵母膏0.8 %、玉米浆1.3 %、磷酸氢二钾0.04%、氯化钠0.02% ;植物留醇投料浓度0.8% ;非离子表面活性剂(TritonX-100: Tween80 =
4.0: 1.0)8%，pH为7.0。将培养好的一级种子培养基按10% (W/W)接种量接入10mL灭菌后转化培养基，200rpm转速下，29°C震荡培养。
[0027]转化培养结束后测得转化率为82.5%。
[0028]其中转化率指摩尔转化率；组份百分含量指质量与体积之比(W/V);非离子表面活性剂的配比指它们之间的质量之比(W/W)。
[0029]实施例3
[0030](1) 一级种子培养基:酵母膏1.0%，蛋白胨1.5%，葡萄糖0.5%，7jC，调PH为7.0。将分子杆菌(Mycobacterium fortuitum) ATCC29472从斜面接一环至20mL种子培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30°C培养22h，既得适于接种的种子。
[0031](2)转化培养基:葡萄糖1.3%、，酵母膏0.8%、玉米浆1.0 %、磷酸氢二钾0.03%,氯化钠0.01% ;植物甾醇投料浓度0.5% ;非离子表面活性剂(TritonX-114: Tween80 =
3.0: 1.0)7.5%，pH为7.2。将培养好的一级种子培养基按10% (W/W)接种量接入10mL灭菌后转化培养基，200rpm转速下，28°C震荡培养。
[0032]转化培养结束后测得转化率为86.8 %。
[0033]其中转化率指摩尔转化率；组份百分含量指质量与体积之比(W/V);非离子表面活性剂的配比指它们之间的质量之比(W/W)。
[0034]实施例4
[0035](1) 一级种子培养基:酵母膏1.3%，葡萄糖1.5%，水，调pH为7.0。将分子杆菌(Mycobacterium fortuitum) ATCC29472从斜面接一环至20mT,种子培养基中，在旋转式摇床200rpm转速下，32°C培养28h，既得适于接种的种子。
[0036](2)转化培养基:葡萄糖0.8%、酵母膏1.0%、玉米浆2.0%、磷酸氢二钾0.04%、氯化钠0.02% ;植物留醇投料浓度1.0% ;非离子表面活性剂(TritonX-114: Tween80 =
4.0: 1.0)9.0%，ρΗ为7.2。将培养好的一级种子培养基按10% (W/W)接种量接入10mL灭菌后转化培养基，250rpm转速下，30°C震荡培养。
[0037]转化培养结束后测得转化率为88.5 %。
[0038]其中转化率指摩尔转化率；组份百分含量指质量与体积之比(W/V);非离子表面活性剂的配比指它们之间的质量之比(W/W)。
【权利要求】
1.浊点系统在微生物转化植物留醇为雄烯二酮中的应用方法。
2.根据权利要求1所述的浊点系统在微生物转化植物留醇为雄烯二酮中的应用方法，其特征在于其浊点系统是通过在转化培养基中添加非离子表面活性剂而形成的。
3.根据权利要求1和2所述的浊点系统在微生物转化植物留醇为雄烯二酮中的应用方法，其特征在于转化培养基为葡萄糖0.5-2.5 %、酵母膏0.2-1.5 %、玉米浆0.5-2.0 %、磷酸氢二钾 0.02-0.08%和氯化钠 0.01-0.05%。
4.根据权利要求2所述，其特征在于形成浊点系统所需要添加的非离子表面活性剂由TritonX-1OO和Tween80组合或TritonX-114和Tween80组合，质量比为2.0-5.0: 1.0-1.5，优选浓度为 5.0%-10.0%。
5.根据权利要求1、2和3所述，其特征在于转化的底物为植物甾醇。
6.根据权利要求4所述，其中的植物留醇主要包括豆留醇、谷留醇、菜籽留醇、菜油甾醇和木留醇或它们的混 合物，优先选用豆留醇和谷甾醇。
【文档编号】C12P33/00GK104031969SQ201310071774
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】曾俊华, 张保国 申请人:曾俊华, 张保国