专利名称：一种以废弃泡沫为载体的固定化细胞催化剂的制备方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物催化和生物质能源技术领域，具体涉及一种以废弃泡沫为载体的固定化细胞催化剂的制备方法及其应用。
背景技术：
生物柴油又称脂肪酸甲酯或乙酯，是以油料作物、野生油料作物和工程微藻类的水生油料植物，以及动物油脂、废弃餐饮油等为原料通过与甲醇或乙醇的酯交换反应制成的甲酯或乙酯燃料，具有减少尾气含硫物质污染，无需改良现有发动机，减少温室效应等优点。生物柴油的生产方法有物理法、化学法和生物法三种。物理法主要有直接混合法和微乳化法，由于物理法生产的生物柴油在使用过程中会产生严重的碳沉积和凝胶而损害发动机，所以目前已基本不被采用。化学法由于具有设备简单、生产成本低、得率高、反应时间短的优点，而广泛使用，但是其生产过程中具有对原料要求高，耗能大，腐蚀设备，环境污染比较严重等缺点。与传统的化学法相比，生物酶催化法具有原料要求低，反应条件温和，污染小等优点，但是生物酶制剂价格昂贵，提取、分离、纯化工艺复杂，在成本上限制了其发展。固定化全细胞催化法是利用一定的载体固定微生物细胞制备成全细胞催化剂，可减少酶的提取、分离、纯化过程从而降低生产成本，而且便于回收重复利用，为日后生物柴油工业化新技术的发展提供了有效的技术储备。固定化细胞是指利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域，使其保持活性并可反复使用的一种技术，主要有包埋法和吸附法两种。包埋法是用物理方法将细胞包裹在凝胶的网格结构中或包裹在半透性聚合薄膜内，实现对细胞的固定。常用凝胶载体有海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、琼脂、聚丙烯酰胺、明胶等，具有固定细胞多，制备条件温和等优点，也具有形成的催化剂通透性较差影响传质效果，材料强度差，易变形破裂等缺点。吸附法是通过静电吸引或利用载体对细胞的亲和性将细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法。其操作简单，反应条件温和。但是其固定效果不强，细胞容易脱落。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种以废弃泡沫为载体的固定化细胞催化剂的制备方法，利用多孔的废弃泡沫固定米根霉菌丝，菌丝缠绕空隙生长，使其具有固定效果好，菌体基本不脱落，而且操作简单等特点，提高催化剂的重复利用性。本发明的另一目的是提供上述固定化细胞催化剂的应用，用于催化油脂的转酯化，实现生物柴油的高效、清洁和经济性制备生产。技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种以废弃泡沫为载体的固定化 细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤:(1)用米根霉发酵培养基，灭菌后接种来自于斜面培养的米根霉孢子，于25-34V、180rpm摇床培养48-72h，作为种子液备用；其中，米根霉发酵培养基配方为:1_2%胰蛋白胨、1-3% 大豆油、0.l%NaN03、0.1%ΚΗ2Ρ04、0.05%MgS04，初始 pH 为 5.5 ;
(2)泡沫载体的预处理
将废弃聚氨酯泡沫裁剪成边长为5-15mm的立方体,用蒸懼水浸泡漂洗数次,121°C下高温灭菌20min，再更换蒸馏水重复灭菌两次，取出后干燥备用；
(3)细胞的培养与固定化
取250mL三角瓶加入80mL米根霉发酵培养基和0.5 1.0g预处理后的废弃泡沫，灭菌后接种0.5mL由步骤(I)得到的米根霉种子液，置于180rmp、28°C摇床中培养48_72h ;培养过程中细胞吸附在泡沫孔隙内生长，培养及固定化结束后，取出用清水漂洗数次，室温干燥，即可。上述方法所制备的固定化细胞催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。所述的应用:在反应体系溶剂为水的情况下，加入占油脂重5 10%的固定化细胞催化剂，反应温度20 45°C，摇床转速200rmp，每8 12h按醇油摩尔比1:1分批添加甲醇，添加3 7次，催化油脂转酯化制备生物柴油。采用水作为溶剂，水占油脂重量的10 80%。所述的油脂包括大豆油、菜籽油等可食用油脂、麻风树籽油和橡胶籽油等非食用木本油脂，以及废弃油脂。有益效果:与现有技 术相比，本发明的以废弃泡沫为载体的固定化细胞催化剂制备方法及其应用，利用废弃泡沫对米根霉细胞进行固定，制成全细胞催化剂，固定方法简单，成本低廉。利用制备的固定化细胞催化剂催化大豆油、麻疯树籽油和橡胶籽油等植物油脂的甲酯化得率达到90%以上。以大豆油为原料，反应溶剂体系为水，甲醇添加方式为8 16h —次，添加3 7次，反应温度20 45°C，摇床转速200rmp，最高甲酯得率可达95%，催化剂不经过任何处理重复使用5次，甲酯化得率依然可以达到80%以上，表明了该固定化全细胞催化剂具有较好的重复使用性能，减少了脂肪酶的分离、提取、纯化过程，在工艺上降低了生物柴油的生产成本，能实现生物柴油的高效、清洁和经济性制备生产。
图1是以废弃聚氨酯泡沫为载体制备得到固定化细胞催化剂的外观 图2是固定化细胞催化剂内部结构扫描电镜图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。实施例1米根霉固定化细胞催化剂的制备
(1)米根霉种子液的制备
用米根霉发酵培养基，灭菌后接种来自于斜面培养的米根霉孢子，于25-34 0CUSOrpm摇床培养48-72h，作为种子液备用；其中，米根霉发酵培养基配方为:1_2%胰蛋白胨、1-3% 大豆油、0.l%NaN03、0.1%ΚΗ2Ρ04、0.05%MgS04，初始 pH 为 5.5 ;
(2)泡沫载体的预处理将废弃聚氨酯泡沫剪成边长为5-15mm的立方体，用蒸馏水浸泡漂洗数次，121°C下高温灭菌20min，再更换蒸馏水重复灭菌两次,取出后干燥备用。(3)细胞的培养与固定化
取250mL三角瓶加入80mL培养基和0.5 1.0g预处理后的聚氨酯泡沫，灭菌后接种入0.5mL米根霉种子液，置于180rmp、28°C摇床中培养48_72h。培养过程中细胞吸附在泡沫孔隙内生长，培养及固定化结束后，取出用清水漂洗数次，室温干燥2 3天备用。以废弃聚氨酯泡沫为载体制备得到的固定化细胞催化剂照片，如图1所示；固定化细胞催化剂内部结构扫描电镜图，如图2所示；可见，菌丝缠绕在泡沫空隙生长，具有固定效果好，菌体基本不脱落。实施例2固定化全细胞催化剂催化可食用油脂甲酯化反应
在IOOmL具塞三角瓶中，加入IOg大豆油(可食用油脂)、0.6g按实施例1制备的固定化细胞催化剂，并添加20% (占油重)蒸懼水作为反应溶剂，每8 12h按醇油摩尔比1:1添加甲醇，分批添加，20 45°C、200rmp摇床内反应，定期取样气相色谱分析。其中在32°C、200rmp的反应条件下，每12h按醇油比1:1添加甲醇，添加5次，反应60h，甲酯得率可达93%。在扩大为96.5g大豆油的反应体系中，催化剂重复使用5次的甲酯得率分别为92%、93%、89%、85%、82%。
实施例3固定 化全细胞催化剂催化非食用木本油脂甲酯化反应
(1)麻风树籽油和橡胶籽油的提取、精制及理化性质分析
分别对两种木本油料作物种子做去壳处理，测定种仁含水率，粉碎后按如下步骤用石油醚(60 90°C)抽提:50g粉碎原料加入抽提器中，用250mL石油醚于90°C水浴中浸泡提取10 24h。提取液经旋转蒸发回收石油醚，得到麻风树籽粗油和橡胶籽粗油，并称重计算粗油得率。为去除粗油中的游离脂肪酸、胶质、色素及水分等杂质制备精制木本油脂，采取如下精制步骤:称取50g粗油，加入油重0.2%的H3PO4,于65°C水浴中搅拌15min，加入油重5%的水，继续搅拌30min，加入重油0.9%的NaOH，同时放慢搅拌速度并升温至80°C，达到80°C停止搅拌，保温lh。取出后用蒸馏水洗涤，9000rmp离心分离，取上层油象继续水洗离心分离2次，下层水相弃之。上层油相置于90°C水浴中加热，加入油重5%的活性白土并搅拌20min,然后离心15min,上层即为精制油。粗油和精制油分别测定酸值、皂化值、平均分子量，结果如表I所示。表I麻风树籽油和橡胶籽油的主要性质
权利要求
1.一种以废弃泡沫为载体的固定化细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用米根霉发酵培养基，灭菌后接种来自于斜面培养的米根霉孢子，于25-34°C、180 rpm摇床培养48-72h，作为种子液备用；其中，米根霉发酵培养基配方为:1_2%胰蛋白胨、1-3% 大豆油、0.l%NaN03>0.1%ΚΗ2Ρ04、0.05%MgS04，初始 pH 为 5.5 ; (2)泡沫载体的预处理 将废弃聚氨酯泡沫裁剪成边长为5-15mm的立方体,用蒸懼水浸泡漂洗数次,121°C下高温灭菌20-30min，再更换蒸馏水重复灭菌两次，取出后干燥备用； (3)细胞的培养与固定化 取250mL三角瓶加入80mL米根霉发酵培养基和0.5 1.0g预处理后的废弃泡沫，灭菌后接种0.5mL由步骤(I)得到的米根霉种子液，置于180rmp、28°C摇床中培养48_72h ;培养过程中细胞吸附在泡沫孔隙内生长，培养及固定化结束后，取出用清水漂洗数次，室温干燥，即可。
2.权利要求1所制备的固定化细胞催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:在反应体系溶剂为水的情况下，加入占油脂重5 10%的固定化细胞催化剂，反应温度20 45°C，摇床转速200rmp，每8 12h按醇油摩尔比1:1分批添加甲醇，添加3 7次，催化油脂转酯化制备生物柴油。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:采用水作为溶剂，水占油脂重量的10 80%。`
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述的油脂包括可食用油脂、非食用木本油脂和废弃油脂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述的可食用油脂包括大豆油和菜籽油。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述的非食用木本油脂包括麻风树籽油和橡胶籽油。
全文摘要
本发明公开了一种以废弃聚氨酯泡沫为载体的固定化细胞催化剂的制备方法及其应用，该方法包括用米根霉发酵培养基培养米根霉、泡沫载体的预处理和细胞的培养与固定化步骤。应用为制备的固定化细胞催化剂在制备生物柴油中的应用。本发明利用废弃泡沫对米根霉细胞进行固定，制成全细胞催化剂，不仅可以回收利用废弃聚氨酯泡沫，且细胞固定方法简单，成本低廉。利用制备的固定化细胞催化剂催化大豆油、麻疯树籽油和橡胶籽油等植物油脂以及废弃油脂的甲酯化得率达到90%以上，具有较好的重复使用性能，减少了脂肪酶的分离、提取、纯化过程，在工艺上降低了生物柴油的生产成本，能实现生物柴油的高效、清洁和经济性制备生产。
文档编号C12N11/08GK103103179SQ20131006698
公开日2013年5月15日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者王飞, 何琦阳, 李治林, 李迅 申请人:南京林业大学