一种编码dna聚合酶的dna及其编码的酶、应用和制备方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及从超嗜热古菌中分离的DNA聚合酶基因、质粒、编码的DNA聚合酶、DNA聚合酶的制备及其应用，更具体的涉及从Pyrococcus?yayanosii中分离得到的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶、应用和制备方法；所述编码DNA聚合酶的DNA具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；（ii）在（i）限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。其编码的DNA聚合酶具有超强耐高温性能和高保真性能，优异的抗抑制剂能力，能利用粗制样品直接进行PCR反应。
【专利说明】—种编码DNA聚合酶的DNA及其编码的酶、应用和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及从超嗜热古菌中分离的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶、应用和制备方法,更具体的涉及从Pyrococcus yayanosii分离得到的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶、应用和制备方法。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)越来越广泛 地应用于基因克隆、遗传疾病和病原微生物诊断、个体分型及刑侦、考古等领域。不同应用对PCR有不同需求，如基因克隆需保证能忠实地扩增得到目的基因、分子诊断需保证扩增的灵敏度、刑侦和遗传疾病检测又需要扩增能耐受一定的抑制剂，保证各类来源的模板能顺利扩增。目前PCR反应主要是使用耐热的DNA聚合酶，如从耐热微生物Thermus aquaticus YTl中分离得到的Taq DNA聚合酶(美国专利号:4，889，818),其扩增效率高，且可使用引物探针来检测目的片段，是目前各类检测试剂盒常用的DNA聚合酶，但其扩增保真性差，容易出现非特异扩增和突变，同时对各种抑制剂敏感，如模板不纯容易导致扩增失败。另外一种Pfu DNA聚合酶，其扩增突变率大大降低且特异性得到很大提高，但该酶效率低、扩增产物少、延伸时间长(lkb/2min)，限制了其在很多领域中的应用(美国专利号:5，545，552)。
[0003]血液是常用的生物样本之一，主要用于遗传疾病、病原微生物诊断和血液分型，其中的血红素、血红蛋白、IgG、乳铁蛋白等对DNA聚合酶有极强的抑制作用，如0.2%的全血就能完全抑制Taq DNA聚合酶扩增，添加BSA、T4gp32蛋白等也仅能在2%全血中扩增。通过突变Taq DNA聚合酶能提高其抗抑制剂能力，能在20%全血体系中扩增特定DNA片段(PCT专利，W02005/113829)。植物组织含有大量的多糖、多酚等物质，会抑制一般DNA聚合酶活性，动物组织中的各类蛋白和次生代谢产物也对DNA聚合酶活性有极强的抑制作用，且动植物组织中的核酸难以释放出来。为了去除不同来源模板中的抑制剂，目前大都通过裂解组织、有机溶剂抽提、沉淀核酸等繁琐步骤纯化核酸，使用有机溶剂有一定毒害作用，且费时费力并太多样品间易交叉污染，因此使用粗制样品直接核酸扩增有极大的优势。市面上使用的基于Taq DNA聚合酶的直接PCR试剂盒，不能耐受高的变性温度，无法有效释放核酸，且对于高GC模板不能很好地扩增；另一种通过突变缺失高保真酶3’ -5’外切酶活性或与TaqDNA聚合酶按不同比例混合，使其能在全血中扩增，由于失去了校正活性，扩增错误率大大提高，对动植物组织也无法很好地扩增(PCT专利，W02009/140497)。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从超嗜热古菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其编码出的蛋白质即DNA聚合酶具有超强的热稳定性(99°C半衰期为3h)，在PCR反应中具有较高的保真能力、较高的扩增效率，且具有抗各种抑制剂能力，能利用全血、血细胞、痕量干血溃、动植物组织等直接扩增目的片段，其抗抑制剂能力能容纳到25%的全血的扩增。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]从超嗜热古菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一:
[0007](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0008](ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。
[0009]本发明还提供一种DNA聚合酶，其具有如下氨基酸序列:
[0010](i)具有序列表中SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列；
[0011](ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替换一个或多个氨基酸。
[0012]本发明的第三个目的是提供一种包含前述编码DNA聚合酶的DNA的表达载体。
[0013]本发明的第四个目的是提供一种制备前述DNA聚合酶的方法，包括用包含前述编码DNA聚合酶的DNA的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得DNA聚合酶。具体步骤如下:
[0014](I)分析基因结构，扩增成熟蛋白编码序列，通过重叠PCR得到如SEQID N0.1所述的基因片段，构建至含启动子的表达载体；
[0015](2)将表达载体转化至宿主菌，得到能生产适用于PCR反应的DNA聚合酶的重组细胞；
[0016](3)扩大培养该重组细胞,诱导后用于制备该DNA聚合酶；
[0017](4)利用凝胶介质，例如镍和肝素层析柱依次纯化该DNA聚合酶。
[0018]本发明的第五个目的是提供一种前述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
[0019]进一步的，本发明优选采用所述DNA聚合酶直接应用于未纯化的样品体系。本发明所述DNA编码出的DNA聚合酶能够直接应用于未纯化的样品体系中，包括血液、血溃、血细胞、动植物组织，动植物细胞、微生物等未经纯化提取出核酸的样品。
[0020]本发明的第七个目的是提供一种PCR扩增试剂盒，其包含有前述的DNA聚合酶。
[0021]本发明所述超嗜热古菌是指Pyrococcus yayanosii,该古菌购自日本微生物菌种保藏中心(保藏编号:JCM:16557)，其分离自大西洋中脊4100m深处一个名为“Ashadze”的热液口，生长于80-108°C，最适生长温度为98°C，具有超强嗜热生长特性(Jean-LouisBirrien 等，IJSEM，2011，61 (12):2827-2881 )。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1示本发明DNA聚合酶Pya纯化产物SDS-PAGE检测结果。泳道I为UnstainedProtein Molecular Weight Marker (Thermo),泳道 2 为透析后得到的 DNA 聚合酶 Pya。
[0023]图2示本发明DNA聚合酶Pya热稳定性。
[0024]图3示本发明DNA聚合酶Pya扩增不同模板的应用。泳道I为人基因组1.5kb片段，2为Thermus thermophilus HB8GC含量为71%的2kb片段，3为大肠杆菌16srDNA片段，
4为人 β-Actin0.7kb 片段，M 为 Trans2k plus II DNAmarker?
[0025]图4示本发明不同DNA聚合酶全血PCR扩增结果。泳道1、2为SN0Vamp?5 X PCRPremix (Snova), 3、4 为 IOXPya buffer, 5、6 为 5XPya direct PCR buffer, 7、8 为 TaqDNA 聚合酶(天根)、9、10 为 Pfu DNA 聚合酶(天根)，M 为 Trans2k plus II DNA marker。
[0026]图5示本发明DNA聚合酶Pya扩增不同浓度全血的结果。泳道1、2为10%、15%人全血，3 ~8 为 25%、20%、15%、10%、5%、2.5% 兔全血，M 为 Trans2k plus II DNA marker?
[0027]图6示本发明DNA聚合酶Pya扩增不同来源粗样品的结果。泳道I为干血溃，2为血细胞，3 为全血，M 为 Trans2k plus II DNA marker。
[0028]图7示本发明DNA聚合酶Pya在全血PCR扩增不同片段中的应用。泳道I为β-Actin片段，2为高GC片段，3为GAH)片段；4~6为基因组扩增，M为IOObp DNA Ladder。
[0029]图8示本发明DNA聚合酶Pya在不同动植物组织直接扩增中的应用。泳道1、2为油菜和白菜叶片直接扩增18srDNA约70bp片段，3、4为约IOObp线粒体片段，5为小鼠尾巴直接扩增约300bp片段。
【具体实施方式】
[0030]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方 案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0031]实施例1.Pyrococcus yayanosii DNA聚合酶基因的克隆与表达
[0032]菌种购买于日本微生物菌种保藏中心(保藏编号JCM16557)，将购买的菌种以 12000rpm 离心 5min,弃上清；细胞沉淀参照 Wizard* Genomic DNA Purificationkit (Promega公司)提取基因组DNA,简要步骤如下:细胞沉淀以600 μ L Nuclei LysisSolution (核裂解液)重悬，80°C水浴5min裂解细胞；冷却至室温后，加入200 μ L ProteinPreciptitation Solution (蛋白沉淀液)，震荡混匀，冰浴5min ;12000rpm离心5min ;吸取上清至另一个干净的离心管,加入600 μ L异丙醇，混匀后冰浴IOmin ; 12000rpm离心5min ；核酸沉淀以700 μ L70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心5min后，弃上清，室温干燥核酸沉淀IOmin至无酒精味，加入50 μ L洗脱缓冲液溶解。
[0033]根据Pyrococcus yayanosii全基因组序列，分析得到其DNA聚合酶基因,其全序列包含3942bp，编码1313aa，通过与其他物种中DNA聚合酶比对，得到其成熟蛋白由两段DNA编码，共776aa。设计并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物:BamH I PyaffF:cgcGGATCCatgattctggatgctgacta, Pya493R:cataatagctgttggccaggattttgatggcgcgctg,Pya3085F:caaaatcctggccaacag ctattatggctattatggttatgcg，PyaWR:tccGTCGACggcattctggaagtgctggag。下划线部分GGATCC代表BamH I酶切位点，GTCGAC代表Sal I酶切位点。首先扩增上下游编码区片段，以引物BamH I PyaWF和Pya493R扩增约1.5kb片段；以引物Pya3085F和PyaWR扩增约0.9kb片段，按以下体系配制PCR反应液，50 μ L体系中包含:基因组 DNA50ng，引物各 400nM，dNTPs200 μ Μ, 5 X PrimeSTARlf Buffer (Mg2+plus) 10 μ L,PrimeSTARli HS0.5 μ L(宝生物公司)。PCR 扩增程序为:98°C 2min，(94°C 10s ；55°C 20s ；68 °C 1.5min或lmin) 25cycles, 68°C延伸5min。PCR产物电泳并回收目的条带，添加相同量上下游片段，以基因两端引物BamH I PyaWF和PyaWR进行重叠PCR，拼接得到全长编码区。回收得到的全长约2.5kb片段，以BamH I和Sal I酶切，连接至同样酶切的含T7启动子载体中，转化至DH5a感受态细胞中。
[0034]通过菌液PCR和酶切鉴定，得到的阳性质粒测序验证后转化至表达菌Rosetta (DE3)细胞中。挑取单菌落培养至OD6tltl=0.4，加入0.1mM IPTG诱导4h，收集菌体超声波破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
[0035]实施例2.DNA聚合酶Pya的纯化
[0036]将能正确表达DNA聚合酶Pya的菌种按1:100接种至500mL含200mL LB培养基的锥形瓶中，加入终浓度30mg/L的卡那霉素和34mg/L氯霉素，37°C 200rpm振荡培养至0D600=0.4，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导目的蛋白表达，于30°C诱导4h ;收集诱导后菌液，12000rpm 离心 2min,弃上清，细胞用 20mL buffer A (20mM Tris-HCl (pH7.8), 0.1MKCl, 50mM NaCl)加30mM咪唑重悬，于-80°C冰箱中冻存12h ;37°C溶解细胞，超声波破碎后于70°C水浴锅处理30min，12000rpm离心10min ;上清过镍亲和介质(IDA，国家生化工程技术研究中心)，以含400mM咪唑的buffer A洗脱；洗脱液过肝素亲和介质(国家生化工程技术研究中心)，以含200mM、400mM、600mM、lM NaCl的buffer A洗脱；收集各蛋白峰经SDS-PAGE检测，含200mM NaCl的buffer A能洗脱部分目的蛋白，含400mM的buffer A大量洗脱目的蛋白，纯度达到95%以上(图1)。将得到的产物透析至Storage buffer:20mMTris HCl (ρΗ7.4)，0.1mM EDTA, 0.l%Tween20, 0.5%Nonidet P40, 0.1M KCl, 50% 甘油。
[0037]实施例3.DNA聚合酶Pya在核酸扩增中的应用
[0038]实施例2中得到的酶以72°C 30min掺入的核苷酸量确定活性，稀释为2.5u/ μ L，以荧光探针法测试其3’_5’外切酶活性，结果Pya具有较强的校正活性，说明其扩增保真性能较好。为了测试DNA聚合酶Pya的热稳定性，将酶于99°C孵育，取O、l、2、3、4h处理的酶测DNA聚合酶活性，结果DNA聚合酶Pya具有极高的热稳定性，其99°C半衰期为3h(图2)。 [0039]测试DNA聚合酶反应条件，以PUC19质粒为模板，设计引物PCR扩增约2.7kb片段确定其反应的最适pH及K+、NH4+、Mg2+离子浓度。配制IOXbuffer B:500mMTris-HCl (pH7.4 ~8.8)，15mM MgCl2,分别添加不同浓度 KCl、(NH4)2SO4' MgCl2,反应体系为 20μ L 含:10Xbuffer B (ρΗ7.4 ~8.8) 2 μ L，dNTPs (2.5mM) 1.6μ L,弓 I 物 PAs 及PAa(IOyM)各 0.5 μ L，Pya0.2 μ L, pUC19 (15ng/μ L) 0.5 μ L,按 98 °C 2min, (98 °C 10s,60°C 20s, 68°C 2min40s) 25cycles,最后 68°C延伸 5min,电泳检测确定最适 buffer。结果DNA 聚合酶 Pya 的最适反应 buffer 为:10XPya buffer:500mM Tris-HCl (pH8.4), 150mMKCl, 5mM(NH4)2SO4, 20mM MgCl20 以 IOXPya buffer 和 Pya 分别扩增 Thermus thermophilusHB8约2kb高GC片段(约72%)、人基因组DNA约0.71Λβ-ActinjP 1.5kb片段、大肠杆菌菌液为模板扩增16srDNA约1.5kb片段，结果均能很好地扩增得到目的片段(图3)。
[0040]实施例4.DNA聚合酶Pya直接扩增粗制样品的应用
[0041]以BD vacutainer真空采血管采集的人全血为模板，测试Pya用于全血直接PCR扩增效果，向体系中添加不同浓度的BSA和Betaine，结果BSA最佳终浓度为
0.01%，Betaine 终浓度为 0.35M，根据测试结果配制 5XPya direct PCR buffer:250mMTris-HCl (ρΗ8.4), 75mM KCl, 2.5mM (NH4)2SO4, IOmM MgCl2,0.05%BSA, 1.75M Betaine ;分别使用 SN0Vamp?5XPCR Premix (Snova), Taq DNA 聚合酶(天根)、Pfu DNA 聚合酶(天根)和Pya DNA 聚合酶(10XPya buffer 和 5XPya direct PCR buffer)扩增人全血约 IOObp 片段，全血终浓度为2.5%和5%。结果除Pya外，其他酶均不能扩增，IOXPya buffer能很好地扩增2.5%全血，5%全血扩增效果较差，使用5XPya direct PCR buffer均能很好地扩增得到目的条带(图4)。
[0042]以采集的兔全血为模板，分别添加终浓度为2.5%、5%、10%、15%、20%、25%全血，或终浓度为10%、15%人全血，使用5 X Pya direct PCR buffer扩增约IOObp片段，结果均能扩增得到目的条带，说明DNA聚合酶Pya能耐受约25%全血(图5)。
[0043]分别以5%血细胞(全血离心后，以相同体积TE重悬)、滤纸上的干血溃(裁剪为1mm碎片，直接加入PCR体系)和5%全血扩增人β -Actin约750bp片段，结果均能得到目的条带，DNA聚合酶Pya具有扩增痕量血液样品的能力(图6)。
[0044]以5%人全血为模板，扩增β -Actin约IOObp片段，约IOObp高GC片段(GC含量70%)和GAPD约IOObp片段，结果Pya均能扩增得到目的条带，对复杂模板也能很好地扩增(图 7)。
[0045]以10 μ L枪头戳取小块油菜、白菜叶片，直接加至PCR体系，扩增约70bpl8srDNA和IOObp线粒体DNA片段；戳取小块小鼠尾巴组织，加至反应体系直接扩增约300bp片段，结果不同来源组织均能很好地扩增得到目的片段(图8)。
[0046]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种编码DNA聚合酶的DNA，其特征在于:其具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。
2.—种DNA聚合酶，其特征在于:其具有如下氨基酸序列: (i)具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列； (ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替换一个或多个氨基酸。
3.包含权利要求1所述的DNA的表达载体。
4.制备权利要求2所述的DNA聚合酶的方法，其特征在于:包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得DNA聚合酶。
5.权利要求2所述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
6.根据权利要求5所述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，其特征在于:所述DNA聚合酶直接应用于未纯化的样品体系。
7.根据权利要求6所 述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，其特征在于:所述未纯化的样品体系为血液、血溃、血细胞、动物组织、动物细胞、植物组织、植物细胞中的任意一种。
8.—种PCR扩增试剂盒，其特征在于包含有权利要求2所述的DNA聚合酶。
【文档编号】C12N9/12GK103966244SQ201310044362
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2013年2月4日
【发明者】龙虎, 李春芳, 狄廷娣, 周裕程, 万强 申请人:思洛生物技术股份有限公司