专利名称：一种中孢短芽孢杆菌及利用其制备低聚果糖的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，涉及一株产菊粉酶的微生物菌株一中孢短芽孢杆菌iBrevibacillus cefltnospo/YAs),以及将它用于生产低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚果糖(Fructiooligosaccharides,简称F0S),又称寡聚果糖或鹿果三糖族低聚糖，是指在蔗糖分子的果糖残基上通过β (2-1)糖苷键连接广3个分子果糖基而成的鹿果三糖(Ι-Kestose,简称GF2),鹿果四糖(Nystose,简称GF3)和鹿果五糖(l-F-β -Fructofranosyl nystose,简称GF4)及其混合物。天然的或者酶法生产的低聚果糖属于果糖与葡萄糖构成的直链低聚糖，其结构式表示为GFn (G为葡萄糖基，F为果糖基，n=2 )。低聚果糖具有优越的生理功效和加工性能，在业界受到极大的重视，在日本、欧洲等许多发达国家已经批准作为功能性食品添加剂使用。2002年美国FDA批准功能性低聚果糖作为公认级安全食品配料进入美国市场。低聚果糖具有以下优越的生理性能:①排毒养颜，防止便秘。低聚果糖可协调双歧杆菌作用，形成直肠排便反射，起到排毒作用，排除人体有害物质。②非胰岛素依赖性糖。食用低聚果糖不会引起血糖和胰岛素升高，对受胰岛素控制的肝糖原的合成没有影响，可作为糖尿病和高血压患者的保健甜品剂。③促进机体对矿物质的吸收。低聚果糖能促进钙、镁、铁等元素的吸收，食用低聚果糖可以防止胃切除手术后的贫血症，效果良好。④良好的双歧因子改善肠道菌群结构。低聚果糖是超强双歧因子，能被大肠中双歧杆菌等细菌选择性利用，同时低聚果糖能抑制沙门氏菌及其它一些腐败菌的生长，从而改善肠道菌群结构，使双歧杆菌成为肠道优势菌。⑤低聚果糖提供的能量很低，食用低聚果糖不会引起肥胖。⑥食用低聚果糖可增强人体免疫力。低聚果糖还可以降低甘油三酯水平，降低总胆固醇，适宜于婴儿、孕妇和老年人使用，在医药保健品、食品饮料、饲料领域的研究和应用越来越广泛。随着人们对健康重视程度的增加，低聚果糖的需求量将会越来越高。目前，生产低聚果糖的方法主要有两种，一是由蔗糖经过糖基转移酶合成而得为GFn型；二是利用菊粉水解酶局部水解菊粉而得为GFn与Fm的混合型。前法中，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量< 55飞0%，该法是目前低聚果糖生产的主要方法，但工艺复杂、生产成本高。而酶解菊粉生产低聚果糖是近些年发展起来的，该法是单酶反应，工艺简单，且低聚果糖含量高达80%以上，在低聚果糖工业化生产中具有很强的竞争力。近年来，国外在这方面做了大量研究，而我国则刚刚起步。目前国内许多人正致力于寻找高活性可工业化生产的菊粉酶。自然界中已发现许多微生物能产生菊粉水解酶。研究表明，许多微生物所产生的菊粉酶为混合酶，多表现为外切活性，其水解菊糖产物以果糖为主。因此，筛选出仅产内切酶的微生物或找到抑制混合酶中外切酶活性的方法或能有适合工业生产规模的分离纯化内切酶的方法，将是利用菊粉生产低聚果糖的关键。许多人在筛选或纯化内切菊粉酶上做了大量的工作。如江南大学的王静等人对菌株产生的混合酶系进行分离获得内切酶，通过反应72h，菊粉酶解率可达74%，低聚果糖得率为50%以上。如南京林业大学的郑重等人对黑曲霉NL02菌株产生的混合酶分离纯化获得内切酶，水解1%菊糖24h，菊糖水解率为86.94%，低聚果糖得率为52.29%，低聚果糖占总糖57.91%。如周帼萍等人利用Psmdomorms的内切酶水解菊粉，水解5%菊糖48h，低聚果糖产率为75.6%。以上这些方法所提及的生产菌产生的菊粉酶水解菊糖转化低聚果糖的转化率不到80%，转化率低，且副产物较多，不利于产品的分离纯化，增加生产成本。此外,大部分菌株产生的菊粉酶为混合酶，需要分离纯化，成本较高，满足不了工业生产的要求。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种高产内切菊粉酶的中抱短芽抱杆菌(Brevibacillus centrosporus)。本发明的另一个目的是提 供利用上述中孢短芽孢杆菌所产的菊粉酶制备低聚果糖的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
本发明的一种中孢短芽孢杆菌，其分类命名为中孢短芽孢杆菌{Brevibacilluscentrosporus) ZF-9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏日期为2012年6月21日，其保藏编号是:CGMCC N0.6267。该菌株以下简称:中孢短芽孢杆菌ZF_9。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的联系资料如下:
电话:010-64807355 传真:010-64807288 E-mail:cgmcciim.ac.cn，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101。 中孢短芽孢杆菌ZF-9菌株具有下述性质:
(I)菌落形态学特征:
在BP培养基(蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，调pH值至7.(Γ7.2)上生长24小时，形成的菌落较小，菌落直径不超过10mm，呈椭圆形，凸起，边缘整齐，呈乳白色或微黄色，显微镜16X100倍观察菌体形态为单细胞、短杆状，染色均匀，可形成内生芽孢。(2)生理与生化特性:
a.培养温度:25 35°C，最适温度为30°C；
b.在pH2 8范围生长；
c.色素产生:不产色素；
d.耐NaCl浓度:在5%浓度可以生长。(3)营养特征:
中孢短芽孢杆菌ZF-9菌株的培养基中不需要添加生长因子。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。(4) 16S rDNA 序列分析
ZF-9菌株的遗传学特征:采用16S rRNA测序进行分类学分子鉴定。提取ZF-9菌株基因组。采用两种合成的通用引物PCR扩增16S rDNA单一条带，引物如下:27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID N0.2)；
1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQ ID N0.3)。PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定，通过测序分析得到该菌株的16S rDNA序列，全长为1440bp (其序列如SEQ ID N0.1所示)。将所测序列送GenBank数据库中得相关种进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明:ZF-9菌株与centrosporus NBRC 15540(GenBank登录号为:AB680893)菌株同源性最高，同源性达99.7%。结合形态、生理生化特征试验及16S rDNA全序列分析的系统发育研究结果，可以将ZF-9菌株的分类定位为中孢短芽抱杆菌，具体为centrosporuss ZF-9。本发明另外还提供了利用上述的中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，将菌株ZF-9接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，离心或超滤获得含菊粉酶的细胞，进而采用游离的或经股固定化的含菊粉酶的细胞转化菊粉生成低聚果糖。所述的培养基中，各组分用量为:碳源用量为2(Tl00g/L，氮源用量为l(T80g/L，无机盐用量为0.:T20g/L,其余为水。培养基中，所述碳源为菊糖、菊粉水解液、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽粉、尿素、(NH4)2S04和NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。将菌株ZF-9进行培养的条件是:培养基的初始pH范围为4.0~8.0，发酵温度为25 35°C，摇床转速 100~250r/min，培养 24 72h。采用超滤的方法获得含菊粉酶的细胞，所述超滤孔径为0.01~0.1 μ m，操作压力为
0.1~0.5MPa，超滤膜截留分子量为105 106道尔顿。所述含菊粉酶的细胞转化菊粉生产低聚果糖是将游离细胞或固定化后的细胞填充至反应器中，加入20~100g/L的菊粉进行酶转化反应，反应温度35 70°C，转化时间9~24h ;或者将固定化细胞装入填充式柱反应器中，柱体积不限，该反应器以0.5~5mL/min单向流加或循环连续流加20~l00g/L的菊粉溶液，在35 70°C的条件下进行酶转化反应，每批转化时间12 24h。所述固定化细胞是采用海藻酸钙或卡拉胶作为固定化载体。本发明的有益效果:现有技术中生产菌产生的菊粉酶水解菊糖转化低聚果糖的转化率不到80%，转化率低，且副产物较多，不利于产品的分离纯化，增加生产成本。且大部分菌株产生的菊粉酶为混合酶，需要分离纯化，成本较高，满足不了工业生产的要求
本发明筛选得到一种能够高效转化菊粉生成低聚果糖的菌株，采用本发明的制备方法，菊粉水解率最高可达99%，低聚果糖的得率可达70%。本发明的生产成本低廉，可满足工业化的大规模生产，具备显著的经济效益。
具体实施方式
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本发明利用中孢短芽孢杆菌ZF-9菌株生产菊粉酶进而生产低聚果糖的方法是将该菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好氧培养，离心或超滤获得含菊粉酶的发酵液，利用游离酶或固定化酶催化水解菊粉获得低聚果糖。产酶条件:
将中孢短芽孢杆菌ZF-9菌株斜面活化一天后(斜面培养基成分除含有碳源、氮源之夕卜，还含有2%的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中。培养基中各组分的含量为重量体积比，即g/L培养基，以下同。碳源用量与培养基之比2(Tl00g/L，氮源用量与培养基之比l(T80g/L，无机盐用量与培养基之比0.l 20g/L，其余为水。培养基中的碳源为菊糖、菊粉水解液、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。培养基的初始PH范围为4.(Γ8.0，发酵温度为25 35°C，摇床转速10(T250r/min，培养24 72h，细胞湿重达5 20g/L，发酵液酶活达25飞OU/mL，然后离心或超滤获得含菊粉酶的细胞，离心条件:室温条件下，600(Tl2000r/min，l(T30min。采用超滤法时，所用超滤膜孔径0.θΓθ.1 μ m，操作压力0.Γθ.5MPa，超滤膜截留分子量为IO5IO6道尔顿。菊粉酶酶活测定方法:
发酵液于8000 r/min离心10 min，收集细胞，取Ig湿菌体，加入5ml反应底物(菊粉20g/L,用0.2mol/L, pH4.6的醋酸缓冲液配制)，55 摇床100r/min条件下反应20min,离心除去菌体，用DNS法测定还原糖产生量，计算酶活。酶活单位定义:在上述条件下，以每克菌体每分钟转化底物产生I μ moL还原糖需要的酶量为一个酶活单位(U)。酶法转化方法:
将游离的含菊粉酶的细胞或固定化后含菊粉酶的细胞填充至反应罐中，加入2(Tl00g/L的菊粉，反应温度35 70°C，转化时间9 24h ;或者将固定化细胞装入填充式柱反应器中，柱体积不限，该反应器可以0.5 5mL/min单向流加或循环连续流加2(Tl00g/L的菊粉溶液，在35 7(TC的条件下进行酶转化反应，每批转化时间12 24h，通过调整流速，控制菊粉水解率在85 100%之间，收集流出液，经离交分离后浓缩结晶得到低聚果糖。含菊粉酶的细胞进行固定后的方法为:配制f 3%(即l(T30g/L)浓度的海藻酸钠，加入1(Γ25%的细胞(即每IOOmL海藻酸钠溶液中加入l(T25g的细胞)，并添加5 10%的硅藻土(即每升海藻酸钠溶液中加入5(Tl00g的硅藻土)，再用浓度为f 5%的CaCl2溶液(l(T50g/L)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以用卡拉胶、甲壳素等载体包埋细胞。以下列举几个实施例，进一步阐述本发明，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:
斜面培养基:葡萄糖50g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏10g/L，pH6.5，琼脂20g/L。发酵培养基:葡萄糖50g/L，菊粉10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，Na2HPO410g/L, NaH2PO4 5g/L, pH6.5。把中孢短芽孢杆菌ZF-9菌株在斜面培养基上30°C培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30°C培养72h，摇瓶转速220r/min，得到的发酵液中菌体含量为20g/L，产酶达40U/mL，以游离细胞转化，称取Ig离心后的湿细胞加入IOmL 50g/L的菊粉溶液中(细胞添加量按每IOOg细胞转化IL 50g/L 的菊粉溶液计)，在50°C条件下，于摇瓶中振荡(转速120r/min)转化产低聚果糖，反应时间12h，反应中止后测底物水解率和产物浓度。菊粉转化率为99%，低聚果糖得率达65%，低聚果糖浓度为32.5g/L。
实施例2:
斜面培养基:菊粉50g/L，蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L，pH6.5，琼脂20g/L。发酵培养基:麦芽糖30g/L，菊粉 20g/L，黄豆饼粉 10g/L，K2HPO4 8g/L，NaH2PO4 6g/L，pH6.5。将中孢短芽孢杆菌ZF-9在斜面培养基上30°C培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌于摇瓶培养基中，28°C培养48h，转速为200r/min，得到的发酵液中菌体含量为15g/L，产酶达55U/mL。离心收集发酵液中的菌体，生理盐水洗涤两遍备用。配制1.5%的海藻酸钠胶体溶液，与生理盐水调制的菌悬液混合均匀后，加入8%的硅藻土吸附后，用注射器滴入2%的CaCl2溶液中固化，制成直径3 4_的球状固定化细胞，于4°C冰箱中静置数小时，然后倾去上清液，经蒸馏水洗涤2次，将2g经离心的湿细胞以海藻酸钠包埋得到IOg固定化细胞，在55°C条件下，在摇瓶中以此转化20ml 100g/L的菊粉溶液(转速200r/min)，每批次转化时间18h，转化20批次，得到菊粉的平均转化率为95%，低聚果糖的平均得率为60%，低聚果糖浓度为60g/L。实施例3:
斜面培养基同实施例2。
种子培养基:葡萄糖20g/L，菊粉10g/L，玉米浆15g/L。发酵培养基:葡萄糖40g/L，菊粉20g/L，玉米浆10g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 IOg/L，pH6.5。将葡萄糖140g，菊粉70g，玉米浆35g，酵母膏17.5，K2HP0435g, pH6.5，用水定容至3.5L,配成培养基,装入5升搅拌发酵罐中，121°C蒸汽灭菌15min。将将中孢短芽孢杆菌ZF-9接一环于种子培养基中，32°C培养12h得种子液，将种子液按发酵液体积5%的接种量接入冷却后的发酵培养基中，32 °C培养(通风量l.0vvm，搅拌转速为400r/min) 48h，得到的发酵液中菌体含量为18.5g/L，产酶达56.5U/mL。将发酵液在超滤器内进行过滤处理，超滤膜截留分子量为IO6Da,操作压力为0.2MPa，控制温度为50°C，膜面速度4m/s，将截留得到的IOOg菌体按实施例2的方法固定化后，装入IL的反应罐中，加入80g/L的菊粉溶液600mL,反应温度55°C，搅拌转速100r/min，反应时间14h，菊粉转化率为98%，低聚果糖得率达70%，低聚果糖浓度为56g/L。实施例4:
斜面培养基同实施例2。种子培养基同实施例3。以60g/L淀粉水解液和40g/L菊粉为碳源，20g/L蛋白胨为氮源，培养基其它成分和菌体培养条件同实施例3，得到的发酵液中菌体含量为20g/L，产酶达60U/mL。称取50g湿菌体，加入50mL无菌水，于32°C水浴保温；称取6g卡拉胶,加入150mL无菌水，充分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺板，于4°C冰箱放置30min，凝固后切成2X2X2cm左右大小的颗粒，置于2mol/L KCl溶液中浸泡30min，使其充分凝固。过滤，颗粒用生理盐水洗涤2 3次，4°C保存备用。所得菌体形成固定化细胞150g，装入Φ4Χ25 的填充床柱式反应器中，该反应器以0.5mL/min的流速单向循环流加100g/L的菊粉溶液，50°C下进行酶转化，24h为一个批次，该装置连续运行30d，转化菊粉溶液10L，得到菊粉转化率为97%，低聚果糖得率达67%，低聚果糖浓度为67g/L。
权利要求
1.一种中孢短芽孢杆菌，其特征在于:其分类命名为中孢短芽孢杆菌{Brevibacilluscentrosporus) ZF-9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号是:CGMCC N0.6267。
2.利用权利要求1所述的中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:将菌株ZF-9接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，离心或超滤获得含菊粉酶的细胞，进而采用游离的或经股固定化的含菊粉酶的细胞转化菊粉生成低聚果糖。
3.根据权利要求2所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:所述的培养基中，各组分用量为:碳源用量为20-100g/L，氮源用量为10-80g/L，无机盐用量为0.l_20g/L，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:培养基中，所述碳源为菊糖 、菊粉水解液、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、豆饼粉、棉籽粉、尿素、(NH4)2SOJP NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:将菌株ZF-9进行培养的条件是:培养基的初始pH范围为4.0-8.0，发酵温度为25_35°C，摇床转速 100-250r/min，培养 24_72h。
6.根据权利要求2所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:采用超滤的方法获得含菊粉酶的细胞，所述超滤孔径为0.01-0.ιμπι，操作压力为0.1-0.5MPa，超滤膜截留分子量为IO5-1O6道尔顿。
7.根据权利要求2所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于:含菊粉酶的细胞转化菊粉生产低聚果糖是将游离细胞或固定化后的细胞填充至反应器中，力口入20-100g/L的菊粉进行酶转化反应，反应温度35-70°C，转化时间9_24h ;或者将固定化细胞装入填充式柱反应器中，柱体积不限，该反应器以0.5-5mL/min单向流加或循环连续流加20-100g/L的菊粉溶液，在35-70°C的条件下进行酶转化反应，每批转化时间12_24h。
8.根据权利要求2或7所述的利用中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法，其特征在于固定化细胞是采用海藻酸钙或卡拉胶作为固定化载体。
全文摘要
本发明公开了一种中孢短芽孢杆菌，其分类命名为中孢短芽孢杆菌(Brevibacilluscentrosporus)ZF-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCCNo.6267。本发明还公开了利用上述中孢短芽孢杆菌制备低聚果糖的方法。本发明筛选得到的菌株能高效转化菊粉生成低聚果糖，采用本发明制备方法，菊粉转化率最高可达99%，低聚果糖得率可达70%，转化液中低聚果糖浓度可达67g/L。
文档编号C12P19/14GK103074288SQ20131003618
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者朱宏阳, 冯珊, 王金海, 李泳宁, 林伟铃 申请人:福建卫生职业技术学院