一种用rna病毒转化植物原生质体的方法

专利名称：一种用rna病毒转化植物原生质体的方法
技术领域：
本发明涉及一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。
背景技术：
甜菜丛根病是危害甜菜的重要病害，目前已成为世界各甜菜产区的一种毁灭性病害，尤其对甜菜产量和含糖量影响极大。近年来该病害在内蒙古、甘肃、新疆和黑龙江等主要甜菜产区都有不同程度的发生，严重影响我国甜菜制糖业的发展。该病害的病原物是甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV),该病毒是Benyvirus 属的代表病毒，由甜菜多粘菌(Polymyxa beta)传播(Tamada, T and Baba, T.Beet necrotic yellow vein virus from rhizomania-affected sugar beet in Japan.Ann PhytopatholSoc Japan. 1973，39:325-332)。BNYVV 是正义 RNA 多分体病毒，其基因组由4飞条RNA组成，分别包装在不同长度的杆状病毒粒子中。其中RNAl和RNA2编码“持家基因”，是病毒侵染各种寄主所必需的，而RNA3和RNA4不是病毒所必需的(Bouzoubaa，S.,Niesbach-Klosgen, U. , Jupin,1. , Guilley, H. , Richards, K. , and Jonard, G. Shotrenedforms of Beet necrotic yellow vein virus RNA-3and_4:1nternal deletions and asubgenomic RNA. Journal of General Virology,1991，72:259-226)。BNYVV 仅 RNAl 和RNA2就可以系统侵染本生烟，其中RNA2编码的P14是其系统运动所必需的，其他小组分RNAs的系统运动能力和致病性各有不同。分子实验证实含有RNA4的BNYVV田间分离物接种本生烟时可产生严重症状，即新生叶下卷，植株矮化(Rahim M.D.，Andika1. B. , Han C. GH. , and Tamada T. RNA4-encoded p31ofBeet necrotic yellow vein virus is involvedin efficient vector transmission, symptom severity and silencing suppressionin root. Journal of General Virology, 2007，88:1611-1619)。野生型 RNA3 在本生烟的选择压下更快地产生内部缺失型RNA3，并且缺失型的RNA3与本生烟的严重症状相关，而RNA5 则极易在系统叶上发生自 我丢失(Wang Ying, Fan Huiyan, Wang Xian-Bing, Li Min,Han Chenggui, Li Dawei, Yu Jialin. Detection and characterization of spontaneousinternal deletion mutants of Beet Necrotic yellow vein virus RNA3from systemichost Nicotianabenthamiana. Virology Journal, 2011，8:355)。之前由于接种体系的限制，BNYVV的相关研究都主要集中在田间寄主甜菜或其他一些枯斑寄主(昆诺藜或者番杏)上进行，而其与病毒系统侵染模式植物本生烟的研究还有待进一步深入。原生质体是去除细胞壁，由质膜包裹的裸露细胞。由于原生质体失去了细胞壁这一屏障，不仅使其成为植物学、细胞生物学、生物工程和作物改良的理想材料，也成为植物病毒研究的有效手段。烟草原生质体是植物病毒研究中应用最早、最广泛的植物材料，它在植物病毒的侵染、复制、病毒与寄主互作、转基因抗病毒、病毒抑制物等个方面中有着广泛的应用，为推动植物病毒学的研究起到了重要的作用。接种原生质体有用病毒粒体和病毒核酸两种方式。接种的基本要求是高浓度，侵染性强的病毒(或病毒核酸)悬液和新制备的高活性原生质体。目前转化原生质体主要有聚乙二醇(PEG)法、电激法和显微注射法等。其中PGE法可促进膜的融合，通过破环原生质体膜而协助病毒或核酸侵染，由于可以用少量的病毒核酸得到高感染率的原生质体，是目前常用的病毒RNA接种烟草原生质体的方法之一(陈占洲，李坏房.烟草原生质体在植物病毒研究中的应用.安徽农业科学，2006，34，1119-1122)。目前利用电击法将BNYVV体外转录物侵染甜菜(Joersbo M, and BrunstedtJ.1noculation of sugar beet protoplasts with beet necrotic yellow vein virusparticles by mild sonication. Journal of virological methods. 1990，29:63-69)和昆诺藜原生质体(Gilmer D.，Bouzoubaa S. , Hehn A. , Guilley H. , Richards K. , JonardG. Efficient cel1-to-celI movement of beet necrotic yellow vein virusrequires3/ proximal genes located on RNA2. Virology，992，189:40-47)以及BY-2悬浮细胞器有成功报道，但侵染系统寄主本生烟原生质体的体系尚未建立。随着BNYVV与本生烟寄主相互作用机制研究的不断深入，转化本生烟原生质体体系的建立也日渐重要。此外，由于电击转化法对实验中所用的仪器有较高的要求，从而限制BNYVV转染原生质方法的推广
发明内容
本发明的目的是提供一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。本发明所提供的用RNA病毒转化植物原生质体的方法，是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中。所述方法特别适合于所述RNA病毒为多分体RNA病毒的情况。所述多分体RNA病毒是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里，由于遗传信息分开了，单独一个粒体不能侵染，必需是一组几个同时侵染才能全部表达遗传特性。当带转化的所述RNA病毒为多分体RNA病毒时,米用上述方法，从感染了相应多分体RNA病毒的植物中提取植物总RNA，将其转化目的植物原生质体，这样的转化方法与传统转化方法(直接用病毒粒体或从病毒粒体中提取的病毒RNA，或利用病毒不同组分侵染性克隆的体外转录物混合后转化原生质体)相比，更加简化和节约成本，且对无该病毒侵染性克隆的实验室提供了开展实验的可能，其原因如下传统转化方法，转化时需要首先提纯病毒，而利用侵染性克隆体外转录物则需要摸索不同病毒核酸链的之间的配比；对于本发明所提供的转化方法来说，相应的多分体RNA病毒感染植株体后，该病毒在植物体内以其生理状态存在，所以用从感病毒的植物体中直接提取的总RNA转化目的植物原生质体不仅可以省略掉大量提纯病毒颗粒的繁琐步骤，而且避免了不同RNA组分间配比摸索这一问题。在本发明的一个实施例中，所述多分体RNA病毒具体为甜菜坏死黄脉病毒(Beetnecrotic yellow vein virus，BNYVV)。在上述方法中，所述植物原生质体可为烟草原生质体。在本发明的一个实施例中，所述烟草原生质体具体为本生烟(Nicotianabenthamiana)原生质体。更加具体的，所述本生烟原生质体来自于6-8叶期本生烟的完全展开的新叶，如第一位和第二位展开叶。所述6-8叶期本生烟的完全展开的新叶在原生质体提取体系中，是以叶面积小于等于0. 5mm2的组织块的形式存在的。
所述本生烟原生质体具体是按照包括如下步骤的方法制备得到的将所述6-8叶期本生烟的完全展开的新叶(如第一位和第二位展开叶)切碎至叶面积小于等于0. 5mm2，将切碎的叶片置于酶解液中酶解，从而获得所述本生烟原生质体。所述第一位和第二位是指从植株顶端往下数的第一片新叶和第二片新叶。所述切碎的叶片与所述酶解液的配比具体可为3g叶片5ml酶解液。所述酶解液的溶剂为水，溶质及其浓度如下纤维素酶15g/L，离析酶1.5g/L，2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)20mM，甘露醇82g/L，氯化钾20mM，氯化钙10mM，牛血清白蛋白Ig/L0所述酶解液的pH可为5. 4-5. 5。所述纤维素酶可为市售的各种纤维素酶，尤其以cellulase “Onozuka” R-1O(Yakult Honsha Co. Ltd)效果最佳，所述离析酶可为市售的各种离析酶，尤其是Macerozyme R-1O (Yakult Honsha Co. Ltd)效果最佳。在所述本生烟原生质体的制备方法中，所述酶解的时间可为3_4h。所述酶解的温度可为24°C，黑暗条件。在用RNA病毒转化植物原生质体的方法中，所述转化可为聚乙二醇转化。所述聚乙二醇转化的体系中，所述总RNA的浓度大于等于0. g/iil，如0. 5-3. Ou g/u 1，再如1. 0-3. 0 u g/ u I ;所述总RNA、所述植物原生质体和所述聚乙二醇的配比可为 2-20 u g :2X105f:135mgJn 20 u g :2 X IO5 个135mg。本发明以本生烟(Nicotiana benthamiana)烟草叶片为制备原生质体的材料,经聚二乙醇(PEG)介导将感染了 BNYVV病叶的植物总RNA接种到本生烟原生质体内，成功建立BNYVV对原生质体的侵染。本发明为研究甜菜坏死黄脉病毒与本生烟寄主间的致病机制提供了一个理想模型，对揭示`该病毒与寄主植物间互作及病毒演化具有重要的理论价值。


图1为从感染了 BNYVV的番杏叶片组织中提取的总RNA的电泳图。图2为本生烟原生质体的显微镜图片。图3为本生烟原生质体台盼兰染色的显微镜图片。图4为总量20 U g不同浓度的发病叶片植物总RNA侵染本生烟原生质体24小时取样BNYVV CP表达量情况的Western-blot检测结果。图5为浓度1. 0 ii g/ ill总量不同的发病叶片植物总RNA侵染本生烟原生质体24小时取样BNYVV CP表达情况的Western-blot检测结果。图6为浓度1. 0 ii g/ ill总量20 ii g发病叶片植物总RNA侵染本生烟原生质体不同时间取样BNYVV CP表达情况的Western-blot检测结果。图7为传统方法转化本生烟原生质体后CP表达量的检测结果。其中，CK+表示从感染了 BNYVV的番杏叶片组织中提取的总蛋白的检测结果(阳性对照)；1表示本传统方法转化本生烟原生质体后CP表达量的检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本生烟(Nicotianabenthamiana)、甜菜坏死黄脉病毒(Beet necroticyellowvein virus, BNYVV)和番杏(Tetragonia expansa):记载于 “Wang Ying, Fan Huiyan, Wangxian-B ing,Li Min, Han chenggui,Li Dawei,Yu Jial in(2011)Detect ion andcharacterization of spontaneous internal deletion mutants of Beet Necroticyellow vein virus RNA3 from systemic host Nicotiana benthamiana. VirologyJournal2011，8:3351-9” 一文中，公众可从中国农业大学获得。用于提取本生烟原生质体的酶解液(使用时需用0. 2 的滤膜过滤除菌)纤维素酶15g/L，离析酶1. 5g/L, 2-N-吗啡啉乙磺酸(MES) 20mM，甘露醇82g/L，氯化钾20mM，氯化钙10mM，牛血清白蛋白(BSA) lg/L，pH5. 4-5. 5。以上各浓度为相应组分在酶解液中的终浓度。在酶解液的配制过程中，先将除氯化钙和BSA外的其他组分配置好后，于55°C水浴IOmin,冷却至室温,再加入所述氯化钙和BSA。其中，纤维素酶为cellulase “Onozuka” R-10 (Yakult Honsha Co. Ltd),离析酶为 Macerozyme R-1O (Yakult Honsha Co. Ltd)。用于培养本生烟原生质体的培养基(IL):称取MS Salt (Sigma M5524) 4. 3g,KH2PO410mg,肌醇100mg，蔗糖10g，甘露醇75g，溶于适量蒸馏水并定容至1L，高温灭菌，PH5. 5。使用之前每升培养基加入过滤灭菌的下列溶液VB5 水溶液(1000 X ) ImL2-4-D 溶液(浓度为 2g/L) 500 U LVB5 水溶液(1000 X ) :1 IOOmg 的 VB5 加到 100ml ddH20 中。2-4-D 溶液100mg 的 2-4-D 力口 Iml 10M NaOH,再加至 50ml ddH20 中。W5 溶液154mmol/L NaCl, 125mmol/L CaCl2, 5mmol/L KCl,2mmol/L MES，溶剂为水，pH5. 7。以上各浓度为相应组分在W5溶液中的终浓度。MMG 溶液0. 4mol/L Mannitol, 1 Smmol /T, MgCl2,4mmol/L MES,溶剂为水，pH5. 7。以上各浓度为相应组分在W5溶液中的终浓度。0. 05M PB 缓冲液:9. 363g H3BO4, 33. 230g NaB4O7 IOH2O, 2ml0. 5M EDTA,加蒸馏水定溶至1L, pH8. O。RNA 抽提溶液IOOmM Tris-HCl, 0.1mM LiCl，IOmM EDTA,1. 0% (lg/100mL)SDS，溶剂为水，pH8. O。以上各浓度为相应组分在RNA抽提溶液中的终浓度。PEG4000 溶液4g PEG4000 (Fluka, cat. No. 81240),2. 5mL Mannitol (浓度为
0.8mol/L), ImL CaCl2 (浓度为 lmol/L)，3mL H2O0实施例1、病毒侵染的寄主叶片植物组织总RNA的提取本实施例采用番杏(Tetragonia expansa)作为待感染植物,用多分体RNA病毒甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)对其进行感染,提取感染后的番杏叶片组织的总RNA，以备用于原生质体的转化。具体如下(1)汁液机械摩擦接种寄主番杏扩繁BNYVV :在感染了 BNYVV的番杏叶片上均匀撒上少量金刚砂，取发病叶片或者分离出病斑，用0. 05M PB缓冲液研磨充分，双手带洁净乳胶手套蘸取少量病汁液摩擦涂抹整片叶片，5-7天后在叶片上可见黄色的圆形病斑。(2)采集发病的番杏叶片(每病叶平均病斑数为60-90个)，约8-10g植物材料加入液氮充分研磨成粉末，转入50ml离心管中，迅速加入80°C预热的IOml水饱和苯酹(pH5. 2-6. 0)和等体积的RNA抽提溶液，振荡20s ;静置5min后加入IOml的氯仿，振荡20s，放置 5min, 7000rpm 离心 lOmin。(3)取上清液至新的50ml管中，加入等体积4M LiCl水溶液，混匀后_20°C放置至少4h。8000rpm离心20min，沉淀用720 U I的DEPC水重悬，充分溶解后分别吸取360 yl上清放置在两个1. 5ml离心管中，分别加入40 ill的3M醋酸钠水溶液(pH5. 2)和800 U I的无水乙醇，混匀后_20°C放置至少2h。(4) 4°C条件下，将上述混合物12000rpm离心15min后，再用70%乙醇洗一遍，晾干，加入400 u I的DEPC水悬浮干粉，浓度测定后保存于_20°C。所提取的总RNA的鉴定结果如图1所示，所提取的RNA有如下明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNAU8S RNA和5S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。实施例2、本生烟原生质体的制备本实施例从本生烟(Nicotiana benthamiana)中制备用于转化的原生质体。具体如下(I)选取在温室(24°C，12h光照，12h黑暗)培养的6_8叶期本生烟的第一位和第二位全展叶片用于原生质体制备，将其尽量切碎(叶片面积小于等于0. 5mm2)，迅速将切碎的叶片放到酶解液(配方见上文)中。叶片与酶解液的配比为3g叶(相当于约20片完整叶)5ml酶解液。(2)于24°C黑暗处静置酶解3_4h，显微镜下观察细胞大部呈圆球状终止酶解，80rpm离心Imin,将酶解的细胞释放出来。(3)用200目的尼龙滤膜将含有原生质体的酶解液过滤到在冰上放置的50ml离心管中，除去未酶解细胞团。350 rpm离心4min(离心机的accel调到I,brake要调到0,使离心机保持较小的加速度，从而将原生质体受到的物理损伤最小化)，收集原生质体(沉淀)。(4)将上清轻轻吸出，沿管壁轻轻加入10_15ml的W5溶液(配方见上文)，轻轻将原生质体悬浮(尽量避免用枪吹打原生质体)，4°C,350rpm离心4min (离心机的accel调到I,brake要调到0，使离心机保持较小的加速度，从而将原生质体受到的物理损伤最小化)，洗涤酶解液。(5)将上清吸出，重复步骤(4)的操作一次，即用W5溶液共洗涤2次。(6)再次用W5溶液悬浮原生质体，冰上至少静置半小时(一般静置1-1. 5小时)，使原生质体再次自然沉降。(7)静置过程中，原生质体会逐渐沉到离心管底部，将上清轻轻吸出，根据原生质体的浓度加入适量的MMG溶液(配方见上文)重悬原生质体，一般要求原生质体的浓度为IXlO6个/ml (用血细胞计数板计算原生质体浓度)，显微镜图片见图2。由图1可知，酶解得到的原生质体数目较多，细胞状态良好。高质量的原生质体一般都是质膜光亮、不透明，液泡系不发达、大小均匀、呈圆球状的裸露细胞。(8)使用台盼兰染色(工作浓度为0. 5g/100ml)，吸取IOOyl步骤(7)的原生质体悬浮液，加入20 u I染色液混均匀，室温静置2min，用0. 7M甘露醇水溶液清洗2次后在显微镜下观察，活的原生质体不被染色，死亡的原生质体则被染成蓝色(台盼兰不能透过正常完整的细胞膜)。结果如图3所示。检测结果显示，其中的活原生质体占原生质体总数的90%以上，可见，通过本发明方法制备得到的原生质体具有极佳的活性。
实施例3、PEG介导的本生烟原生质体转化本实施例将利用实施例1得到从感染了 BNYVV的番杏病叶提取的植物总RNA，通过PEG介导的方法转化到实施例2制备得到的本生烟原生质体内，旨在构建转入BNYVV的重组本生烟原生质体，以备用于研究BNYVV与本生烟寄主间的致病机制。具体如下(I)将实施例1获得的适量的从被BNYVV侵染的番杏病叶中提取的植物总RNA加到2ml离心管(DEPC处理)中，加入200 u I实施例2制备的本生烟原生质体溶液(浓度为
1X IO6个/ml)，使原生质体与植物总RNA充分混合，再加入220 U I的PEG4000溶液(配方见上文)，充分混匀(动作一定要轻柔)，室温(一般为23°C )放置8-10分钟后，立即轻轻加入Iml的W5溶液(配方见上文)，轻轻混匀。(2) 4°C, 400rpm, 4min (离心机的accel调到I, brake要调到0,使离心机保持较小的加速度，从而将原生质体受到的物理损伤最小化)；轻轻吸出上清，先在六孔培养板上加入1. 5ml原生质体培养基(配方见上文)，将步骤(I)得到的含有本生烟原生质体和植物总RNA的混合液轻轻加入培养基中。常温(一般为23°C )散光培养6-48个小时。(3)根据实验目的的需要，取不同培养时间的重组原生质体，提取总蛋白，定量后利用免疫印记的方法(western-blot)检测重组原生质体中BNYVV病毒的CP蛋白表达量，从而鉴定转化效率的高低。所用一抗为Beet necrotic yellow vein virus coatingantibody (Agdia, Catalog No:CAB16301),所用二抗为 Protein A-Alaline Phosphatase(SIGMA, Catalog No:P7488_500UG)。本发明的发明人对转化体系进行了如下优化在实施例2制备的本生烟原生质体用量为2X105个(200iil，浓度为IXlO6个/ml)，PEG4000用量约为135mg (220iU，浓度为4g/6. 5ml), W5溶液用量为lmL，原生质体培养基用量为1. 5mL的前提下，对转化体系中实施例1制备的植物总RNA的浓度及总量进行了一系列优化(检测时间为病毒侵染原生质体后24小时)。详见如下(a )和(b):(a)转化体系中实施例1制备的植物总RNA的总量为20 ii g，设置浓度梯度为
0.2 u g/ u 1、0. 5 u g/u 1、1. 0 u g/u 1、1. 5 u g/u 1、2. 0 u g/ u I 和 3. 0 u g/ u I。同时设置零浓度阴性对照(记作mock)，以及以从感染了 BNYVV的番杏叶片中提取的总蛋白作为待测样本的阳性对照(记作CK+)。实验设3次重复。结果如图4所示，当植物总RNA的浓度为0. 5 ii g/iU及以上时，均有CP蛋白的表达，特别是浓度为1. Oil g/iil以上时，CP蛋白的表达量较高。这表明转化体系中当植物总RNA的浓度达到0. 5 ii g/ ill时，BNYVV即可侵染本生烟原生质体，且浓度为1. 0 y g/ yl以上时，侵染效果相对较好。本着节约成本的原则，选定1. Oii g/yl为最优植物总RNA浓度。(b)转化体系中实施例1制备的植物总RNA的浓度为1. 0 ii g/ ii 1，设置总量梯度为
2V- g、5 u g> 10 u g、15 v- g、20 u g、30 u g和40 u g。同时设置零浓度阴性对照(记作mock),以及以从感染了 BNYVV的番杏叶片中提取的总蛋白作为待测样本的阳性对照(记作CK+)。实验设3次重复。结果如图5所示，当植物总RNA的总量为2 U g及以上时，均有CP蛋白的表达，并且随着总量的增加其同一时间的CP表达量也随着增加，当RNA总量> 20 ii g时CP表达量达到最大值，并逐渐趋向于平稳。这表明转化体系中当植物总RNA的总量达到2 ii g时，BNYVV即可侵染本生烟原生质体，且总量为20 y g以上时，侵染效果相对较好。本着节约成本的原贝U，选定20 i! g为最优植物总RNA总量。另外，本发明的发明人还对在优化条件下用植物总RNA转化本生烟原生质体(SP转化体系中，植物总RNA的浓度为1. 0 ii g/ul，总量为20 u g)后，Western-blot检测CP表达情况的时间点进行了测定。设定检测时间点依次为病毒侵染原生质体后6小时、12小时、18小时、24小时、36小时和48小时。同时设置零浓度阴性对照(记作mock)，以及以从感染了 BNYVV的番杏叶片中提取的总蛋白作为待测样本的阳性对照(记作CK+)。实验设3次重复。 结果如图6所示，BNYVV侵染原生质体12h左右就可以检测到病毒CP蛋白的表达，在24h左右达到最大值，而之后随着时间的增加，CP蛋白的表达量有一定的降低，这可能与原生质体活力下降有关。建议最佳的检测时间为病毒侵染原生质体后24-36h。对比例采用传统的从BNYVV病毒粒体中提取总RNA转化本生烟原生质体，在培养24小时时检测转化后原生质体中BNYVV病毒的CP蛋白的表达量。具体的转化原生质体的方法及CP蛋白表达量检测方法参照实施例3相关步骤进行。结果如图7所示，该传统转化方法与实施例3中提取植物总RNA的方法(原生质体转化后培养24小时)相比，效果差不多。其中该传统转化方法原生质体中表达的CP蛋白相对少一点，这可能与提取的病毒粒体的活性或提取的RNA总浓度相关。这说明在病毒粒体提取过程中实验操作更繁琐，`而且存在病毒侵染力降低的风险。
权利要求
1.一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法，是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述RNA病毒为多分体RNA病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述多分体RNA病毒为甜菜坏死黄脉病毒。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物原生质体为烟草原生质体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述烟草原生质体为本生烟原生质体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述本生烟原生质体来自于6-8叶期本生烟的完全展开的新叶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述6-8叶期本生烟的完全展开的新叶在原生质体提取体系中，是以叶面积小于等于0. 5mm2的组织块的形式存在的。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述转化为聚乙二醇转化。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述聚乙二醇转化的体系中，所述总RNA的浓度大于等于0. g/yl ;所述总RNA、所述植物原生质体和所述聚乙二醇的配比为 2-20 u g :2X105 个135mg。
全文摘要
本发明公开了一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。本发明所提供的用RNA病毒转化植物原生质体的方法是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中；所述RNA病毒为多分体RNA病毒，如甜菜坏死黄脉病毒；所述植物原生质体为烟草原生质体，如本生烟原生质体。本发明以本生烟烟草叶片为制备原生质体的材料，经聚二乙醇介导将感染了甜菜坏死黄脉病毒病叶的植物总RNA接种到本生烟原生质体内，成功建立甜菜坏死黄脉病毒对原生质体的侵染。本发明为研究甜菜坏死黄脉病毒与本生烟寄主间的致病机制提供了一个理想模型，对揭示该病毒与寄主植物间互作及病毒演化具有重要的理论价值。
文档编号C12N15/87GK103060380SQ20131002954
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者韩成贵, 范慧艳, 李大伟, 于嘉林, 王颖, 张永亮, 武文琦, 王晓辉 申请人:中国农业大学