专利名称：一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是指一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法。
背景技术：
脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cell, AD-MSCs)的主要来源白色脂肪(white adipose tissue, WAT)在体内分布广泛,储量丰富。细胞克隆实验证明，骨髓来源的间充质干细胞(Bone-marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)仅占成人骨髓的
0.2 X IO^5-0.1 X 10_5，而脂肪组织中所获得的干细胞克隆形成率是BMSCs的100-500倍。骨髓中BMSCs的比例和增值能力均会随着年龄的增长和骨质疏松的发生率而下降，但脂肪组织中ADSCs数量不随供者年龄增加而减少。ADSC体外扩增和自我更新能力强，原代培养约5-7天后，细胞融合超过90%，一个月出现3个对数生长期，能较稳定传代20代以上；体外培养时对血清无特殊选择性，无需添加物即可良好的生长，液氮冻存和长期传代后的ADSCs细胞生长和表型均无改变。ADSCs具有多向分化能力，在不同诱导培养条件下，ADSCs能够定向分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰腺内分泌样细胞、肝脏细胞和视神经细胞等多种组织细胞。但至今不清楚它们是否能转化为造血干细胞(HSCs)。造血干细胞是治疗血液病尤其是白血病的最有效方法。白血病和其它肿瘤疾病一样，近年来在中国有着显著增长的趋势，并呈现低龄化的特点。白血病占恶性肿瘤的5%，发病以儿童和青年居多。治疗白血病的最有效的方法就是造血干细胞治疗。但目如的治疗手段是通过寻找配型的骨髓或 造血干细胞，患者家属以及社会的相关部门动用一切可调动的资源寻找配型适合的造血干细胞，能配上的微乎其微。因此催生了国家干细胞库的设立，但每个库通常要花费2亿元左右，其经济成本之高可想而知，但从技术上乃不能完全排除免疫排斥和致瘤可能。此外，由于干细胞的数量有限，无分化扩增技术的缺少，使最终优质的医疗结果得不到保证。上述种种原因急需人们去发现新的产生造血干细胞的来源和研制新的无分化扩增造血干细胞的技术和方法。近年来的研究发现不同类型的造血细胞中小RNA的表达显著不同，而且这种不同在细胞的发育过程中起着重要的调节作用。例如，miR-181和B-淋巴细胞的发育有关，miR-142和miR-223与T-淋巴细胞的发育有关，miR-221和miR-222与人的红细胞生成有关，miR-223和小鼠的粒细胞分化相关，而miR-10，miR-126和miR-17与巨核细胞减少有关。除此之外，人们还发现某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起到阻止造血干细胞分化的作用。尽管已经发现某些miRNA，例如miR-130a和miR-10a，通过作用H0XA1基因和MAFB基因的转录因子基因从而诱导细胞分化
发明内容
本发明提出一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题。本发明的技术方案是这样实现的:一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤:1)制备均质的间充质干细胞的培养基；2)多种小RNA分子的组合；3)核酸多肽纳米粒的组装和转染；4)转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基；5)激活多种造血相关的基因。作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的EGF, FGF-2, IPDGF, IGF 和 TGF-β 五因子。作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的shh, SCF，ΤΡ0, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。作为优选的技术方案，所述多种小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2, miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位点的siR-EIDl分子的序列。所述祀向EIDlmRNA不同位点的siR-EIDl分子的序列见表2。作为优选的技术方案，所述转决定后的造血干细胞培养是指在造血干细胞诱导扩增培养基中以5X 105/ml的细胞密度进行培养至少3天。核酸多肽纳米粒的组装是指不同的小RNA分子与多肽转染试剂按实例3配比、程序和时间的配制过程，通过每天一次共二次的转染以达到最佳的诱导效率。作为优选的技术方案，所述激活多种造血相关的基因是指Runxl，Bmil, HoxB4, Gatal, Gata2, Gfil, Sall4, Pu.1, Scl, Md, C-myc, C-myb, Kcl4, Cxcr4,和 Crb,但不局限于这些基因。间充干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同间充质干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。 造血干细胞诱导扩增培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括造血干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。具体配方成分见表3。使用本发明的方法获得的诱导造血干细胞，可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗。下面结合具体实例进一步说明本发明。实例1.间充质干细胞分离、培养和扩增脂肪/骨髓/脐带的获取在捐献者同意的前提下进行的。人脂肪来源干细胞的采集、分离和培养:脂肪抽吸物被分为2种成分:一种是密度小的脂质成分，另一种是密度大的水性成分，为液体部分。液体成分被用作脂肪来源干细胞的来源。无菌条件下将获取的脂肪组织用同体积的PBS液反复冲洗3到5次，加入0.1% I型胶原酶，37°C水浴振荡、消化60min，然后以含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。IOOOg离心lOmin，弃上清液及悬浮的残存组织，重悬细胞，加入2倍体积的红细胞裂解液(NH4C1154mmol/L+KHC0310mmol/L+EDTA0.lmmol/L)静置lOmin，离心、 弃上清液。用适量的PBS液清洗3次，200目筛网过滤，细胞悬液用细胞记数板记数，按每平方厘米1-3 X IO5细胞接种于150cm2的培养瓶，加20mL无血清的高糖 DMEM/F12 培养基，添加 20ng/ml EGF, 20ng/ml FGF-2, 10ng/mlPDGF-BB, 5ng/ml IGF和0.5ng/ml TGF- β混合均匀，置于37°C、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养。本发明公开的培养基是一种快速扩增无分化的间充质干细胞培养液，它能培养出高度一致的无分化的间充质干细胞，为后续的产生造血干细胞提供了可靠的保证。相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，36 48h后首次换液，以后每72h换液I次。待细胞融合超过培养瓶底80%时，常规胰酶消化传代。人脂肪来源干细胞的鉴定:取第3或4代细胞以0.25%胰酶消化后，流式细胞术分析研究发现 ADSCs 主要表达 CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD29、CD49e 和 HLA-ABC，而不表达⑶34、⑶3、⑶19、⑶45、⑶14、⑶31、⑶62L、⑶95L和HLA-DR (见
图1)。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别:大部分BMSCs表达CDlO和CD106，而表达CDlO的ADSCs仅占5% 20% ;几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。实例2.miRNAs序列、结构和合成通过生物信息学技术和相关的预测软件(Target Scan)，我们筛选和鉴定了三种miRNAs(见图2)。第一个miRNA是miRNA-138-1，其序列相对应的短的发卡DNA序列如下:CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG.
第二个miRNA是miRNA-138_2，其序列相对应的短的发卡DNA序列如下:CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGG⑶UGCAUCA第三个miRNA是miRNA_433，其序列相对应的短的发卡DNA序列如下:CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCU⑶CAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUGUUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCG ⑶⑶ UCUCCAGG这些miRNAs都可以通过化学合成的方法获得，为了加强稳定性这些小RNA的组成单体可进行全部或部分不同的化学修饰， 如甲氧或乙氧修饰。本发明中的miRNAs活性成分的制备方法如下:将4种不同的核苷酸单体经RNA/DNA合成仪按特定的设计序列合成三种不同的小RNA单链，这些小RNA单链序列如上所示。合成好的小RNA单链再经过分离纯化除去其它成分，进行退火形成三个特征的miRNAs。将这三种miRNA分子冷冻浓缩成干粉作为配方中的小核酸活性成分，在低温下保存，干粉包括miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA_433，这些miRNA中均含有一个EIDl基因的种子片段。将它们分别与含有EIDl的3‘UTR区序列的荧光素酶质粒(pRL-TK)共转染脂肪间充质干细胞，转染36小时后荧光素酶活性分析结果显示这些小RNA分子(包括siR-EIDl, shR-EIDl和sRNA_M)均能有效的下调把基因EIDl(见图3)，使不同的组蛋白乙酰化和多种转录因子乙酰化，从而激活了间充质干细胞，使其更容易向其他干细胞转化。为了加强小RNA的干扰效应，我们采用了这三种小RNA (sRNA-M)的结合战略，最终的小核酸活性成分是在miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA_433合成后根据干粉重量的1:1:1比例要求加以混合配制。实例3.小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染
分别将上述小核酸活性成分的混合物和透皮穿膜肽(从北京吉利奥生物技术发展有限公司购买)构溶解在医用级去离子水中，混合均匀lOmin，根据核酸与多肽的重量百分比:即1:10到1:100，在搅拌状态下再将小核酸活性成分的溶液缓慢滴加透皮穿膜肽的溶液中，继续搅拌使小核酸活性成分和透皮穿膜肽能充分混合，静止20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒，备用。为了提高小RNA诱导人间质干细胞向造血干细胞转决定的效率，本发明进一步优化了具体的诱导方案，这里公开的8种诱导配方见表I。从中可见方案3中的第二种诱导配方的效率最高，即通过每天一次共二次的转染，能使80%的人间质干细胞转决定成造血干细胞。比我们原来的诱导方法大为改进，使通过此技术能获得临床级的造血干细胞成为可能。进一步将可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗表1.人间质干细胞向造血干细胞转决定的诱导方案
权利要求
1.一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤: 1)制备均质的间充质干细胞的培养基； 2)多种小RNA分子的组合； 3)核酸多肽纳米粒的组装和转染； 4)转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基； 5)激活多种造血相关的基因。
2.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的EGF, FGF-2, PDGF-BB, IGF 和 TGF- β 五因子。
3.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的shh, SCF，TPO, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。
4.按权利要求 1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述多种小RNA分子是指miR-138-l，miR-138-2，miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位点的siR-EIDl分子的序列。
5.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述转决定后的造血干细胞培养是指在造血干细胞诱导扩增培养基中以5X 105/ml的细胞密度进行培养至少3天。
6.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法,其特征在于:所述激活多种造血相关的基因是指Runxl, Bmil, HoxB4, Gatal, Gata2, Gfil, Sall4, Pu.1, Scl, Md, C-myc, C-myb, Kcl4, Cxcr4,和 Crb0
7.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述的间充干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同间充质干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。
8.按权利要求1所述的一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，其特征在于:所述造血干细胞扩增用培养基配方包括0-1 μ g/ml Sonichedgehog、0_lμ g/ml DeltaUO-1 μ g/ml FGF2、0_1μ g/ml IGFBP、0_1μ g/ml SCF、0_1μ g/ml Angiopoietin、0_lμ g/mlTP0、0_lμ g/ml MBP、0_1μ g/ml LIF>0-1μ g/ml TGF-β 、0-100 μ M MTEPA、l_5mM NAC。
全文摘要
本发明提出了一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤1)制备均质的间充质干细胞的培养基；2)多种小RNA分子的组合；3)核酸多肽纳米粒的组装和转染；4)转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基；5)激活多种造血相关的基因，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题。
文档编号C12N15/87GK103088065SQ20131002887
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者殷勤伟, 黄兵 申请人:黄兵