专利名称：抑制细胞增殖的蛋白质cgref1、其表达序列及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是，特别是表达可抑制细胞增殖的蛋白的核苷酸序列、其所编码的蛋白质及其应用。
背景技术：
转录因子激活蛋白-1 (AP-1 ；activator proteinl)是亮氨酸拉链蛋白，由Jun 蛋白家族(Jun, Jun-B, Jun-D)(例如参见 Ryder K，Lanahan A, Perez-AlbuerneE，Nathans D.jun~D:a third member of the jun gene family.Proc Natl Acad SciUSA1989, 86:1500-1503 ；Hartl M，Hutchins JTj VogtPK.The chicken junD gene and itsproduct.0ncogene 1991;6:1623-1631 ;Hirai SI, Ryseck RP，Mechta F，Bravo R，YanivM.Characterization of junD:a new member ofthe jun proto-oncogene family.EMBOJ1989;8:1433-1439)、Fos 蛋白家族(Fos，FosB，Fra_l，Fra_2)(例如参见 Nishina H，SatoH, Suzuki T，Sato M，Iba H.1solation and characterization of fra_2，an additionalmember of the fos gene family.Proc Natl Acad Sci USA1990;87:3619-3623)、ATF蛋白家族(ATF-a，ATF-2，ATF-3)及 JDP 蛋白家族(JDP-1，JDP-2)(例如参见 AronheimA，Zandi E，Hennemann H，Elledge SJ，Karin M.1solation of an AP-1 repressorby a novel method for detecting protein-protein interactions.Mol CellBioll997; 17:3094-3102)组成。胞外剌激如细胞因子、生长因子、胁迫、感染、致癌剌激等生理或病理信号，通过丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)级联信号通路引起AP-1 二聚体组份如Fos、Jun等表达上调或磷酸化修饰改变而促进AP-1的转录活性，启动多种与细胞增殖、存活、分化和转化等相关基因的转录(例如参见Virna D.Leaner, HowardDonninger, ChadA.Ellis, Geoffrey J.Clark, and Michael J.Birrer.p75-Ras-GRFl Is ac-Jun/AP-1 Target Protein:1ts Up Regulation Results in Increased Ras Activityand Is Necessary for c-Jun—Induced Nonadherent Growth of Ratla Cells.MolCell Biol.2005April;25(8):3324 - 3337 ；Shen Q, Uray IP, Li Y,Krisko TI, StreckerTE，Kim HTj Brown PH.The AP-1transcription factor regulates breast cancer cellgrowth via cyclins and E2F factors.0ncogene.2008Jan10;27(3):366-77 ；HessJ，Angel P，Schorpp-Kistner M.AP-1subunits: quarrel and harmony among siblings.J Cell Sc1.2004Decl ;117(25):5965-73.)D 研究表明，AP-1 的激活与炎症反应、免疫应答、细胞增生、转化、 肿瘤侵润、转移和细胞凋亡等重要的生理病理过程密切相关(例如参见 Ozanne BWj Spence HJj McGarry LCj Hennigan RF.Transcription factorscontrol invasion:AP-1 the first among equals.0ncogene.2007 Jan4;26 (I):1-10 ;Zenz R，et al.Activator proteinl (Fos/Jun)functions in inflammatory bone andskin disease.Arthritis Res Ther 2008Janl8;10 (I):201 ;Libermann TA，ZerbiniLF.Targeting transcription factors for cancer gene therapy.Curr GeneTher.2006Feb;6(I):17-33 ；Wagner EFj Eferl R.Fos/AP-lproteins in bone and theimmune system.1mmuno I Rev.2005Dec; 208:126-40.) 肿瘤侵袭和转移性生长的显著特点是形态上从上皮到间皮的转变和细胞极性的丧失，Jun和Fos参与该过程。(例如参见 ReichmannE, Schwarz H，Deiner EM, Leitner I, Eilers M, Berger J, BusslingerM, Beug H.Activation of an inducible c-Fos ER fusion protein causes loss ofepithelial polarity and triggers epithelial-fibrobla-stoid cell conversion.Cell 1992;71:1103-1116 ;Fialka I, Schwarz H, Reichmann E, 0ft M, Busslinger M,Beug
H.The estrogen-dependent c-Jun ER protein causes a reversible loss of mammaryepithelial cell polarity involving a destabilization of adherens junctions.JCell Bioll996; 132:1115-1132)。研究证明，以AP-1为靶标，通过抑制细胞中AP-1活性，进而抑制相关基因的表达，可以达到疾病治疗的目的(例如参见Shen Q, Uray IP1Li Y, KriskoTI,Strecker TE, Kim HT,Brown PH.The AP-1transcription factor regulates breastcancer cell growth via cyclins and E2F factors.0ncogene.2008Janl0;27(3):366-77.)。这提示我们，如能找出细胞内抑制AP-1的蛋白，在肿瘤等疾病的早期设法阻断AP-1的活性，将有助于对疾病进展的控制，为肿瘤等疾病的治疗带来新希望。随着人类基因组计划完成，基因组数据库资源十分丰富，为高通量、高内涵筛选人类功能新基因及对新基因功能研究提供了捷径(例如参见Pinhasov A, et al.Geneexpression analysis for high throughput screening applications.Comb Chem HighThroughput Screen.2004Mar;7( 2):133-40.)。在本领域中，有使用基因组数据，通过生物技术以及生物信息学等手段获取抑制AP-1通路活性从而抑制细胞增殖的关键调控因子的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供可以有效抑制细胞增殖的调控因子及其应用。在本发明的第一方面，提供了编码可抑制细胞增殖的蛋白质CGREFl的核苷酸序列SEQ ID NO:1或者与其互补的核苷酸序列。在本发明的第二方面，提供了表达可抑制细胞增殖的蛋白质CGREFl的核苷酸序列SEQ ID NO:2或者与其互补的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供了包含如第一方面或第二方面所述的核苷酸序列的重组载体。在本发明的第四方面，提供了包含如第三方面所述的重组载体的重组细胞。在本发明的第五方面，提供了可抑制细胞增殖的蛋白质CGREF1，所述蛋白质CGREFl 的序列为 SEQ ID NO:3。在本发明的第六方面，提供了如第一方面或第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的蛋白质在抑制细胞增殖中的用途。其中，所述用途可以为抑制激活蛋白-1 (AP-1)通路的活性。其中，所抑制的细胞为表达蛋白质CGREFl的人源细胞，优选地所述人源细胞可以选自由骨髓瘤细胞、脑瘤细胞、脊髓瘤细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、人胚肾细胞、宫颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞和食管癌细胞所组成的组，更优选地所述人源细胞可以为293T和Hela细胞。
在本发明的第七方面，提供了如第一方面或第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的蛋白质在用于诊断和/或治疗与细胞增殖相关的疾病的药物的制备中的用途。其中，所述疾病可以是癌症和/或炎症，其中优选地，所述癌症可以选自由骨髓瘤、脑瘤、脊髓瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、人胚肾、宫颈癌、神经母细胞瘤和食管癌组成的组。
图1显示CGREFl能够明显抑制AP-1通路的活性；图2显示CGREFl为经典途径分泌型蛋白；图3显示CGREFl能够明显抑制细胞的增殖；图4显示CGREFl对细胞AP-1通路下游分子的影响；图5显示蛋白质N端测序结果；图6显示瞬时转染CGREFl后，与空白对照组比较，该序列能够明显抑制AP_1(A)、c-Jun (B)及c-Fos (C)报告基因的活性；图7显示纯化后的蛋白对AP-1通路的抑制；图8显示CGREFl对细胞增殖的抑制作用，A为在HEK293T细胞中检测，B为在HCTl 16细胞中检测；图9显示CGREFl对AP-1通路相关基因蛋白水平的影响，A为对c-Jun抗体的检测，B为对MAPK通路相关分子p38，JNK, ERK的磷酸化及总蛋白抗体的检测。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。筛诜体系将pAP-1-Luc信号转导通路报告质粒转染293T细胞，同时共转染内参质粒p RL-TK-LUC (thymidine kinase romoter-Reni I la luciferase)以便归一化数据，消除细胞的存活情况以及细胞的转染效率对实验造成的误差，增加数据的可靠性。利用此筛选体系，对本实验室克隆得到的1000个未知功能的人类基因进行了规模化细胞筛选，得到一个明显抑制pAP-1-Luc信号转导通路的基因(实施例1)。进一步的蛋白免疫印记结果表明其为经典分泌型蛋白CGREFl (实施例2)。本发明中的各种质粒可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，PCR可扩增出目的片段，利用分子克隆技术将其构建到载体上。 CGREFl (cell growth regulator with EF-hand domainl)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其具有301个氨基酸。可用于表达CGREFl蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。所述核苷酸序列除了包含CGREFl的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5’或3’端的非编码序列等2。所述核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。SEQ ID NO:2全长1887个核苷酸，编码序列为第270 1175位核苷酸。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CGREFl蛋白序列，例如SEQ ID NO:1所示的编码序列。本领域普通技术人员已知，本发明的CGREFl的编码序列可以完全相同于如SEQ ID NO:1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。本发明的可表达CGREFl的核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到的多核苷酸可以克隆到合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可以通过标准DNA合成技术得到。本发明的CGREFl蛋白可以通过常规方法获得，例如通过转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CGREFl蛋白，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。CGREFl在抑制细朐增葙中的应用由于本发明CGREFl可以抑制细胞增殖中，因此可以将CGREFl作为抑制肿瘤细胞生长的新靶点，例如提供本发明CGREFl蛋白或表达其的核苷酸序列，用于治疗肿瘤。本发明通过CGREFl抑制AP-1通路的活性达到抑制肿瘤细胞生长的目的。本发明CGREFl可以抑制293T和Hela细胞的增殖，本发明的实施例3证明了这种促进作用，因而CGREFl可以抑制肿瘤的生长，例如骨髓瘤 细胞、脑瘤细胞、脊髓瘤细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、人胚肾细胞、宫颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞、食管癌细胞。本发明还提供了检测CGREFl抑制细胞增殖时，细胞内AP-1通路下游分子的表达情况。所述引物如实施例4中所示。检测方法也是本领域已知的，例如利用本发明CGREFl蛋白特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，利用免疫荧光法、免疫印记等进行检测。免疫印迹是借助十二烷基硫酸钠(SDS)存在下高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将抗原根据其分子量大小不同而有效分成许多蛋白区带，将分离后的蛋白带经不同途径转移至一种固相支持体如硝酸纤维膜或PVDF膜上，然后以抗体为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白抗原表位发生特异性反应，结合于固相支持体的抗体可用酶标的二抗如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶偶联的第二抗体等检测。免疫印迹可鉴定出混合物中未知蛋白及其分子质量。免疫组织化学是在组织切片中进行的抗原抗体反应，可以检测抗原在组织中的含量和定位。本发明的CGREFl的蛋白或表达其的核苷酸序列可以作为抑制肿瘤细胞生长的靶标。因此，可以利用双报告检测手段、免疫印记等方法或它们的组合，间接反映体内CGREFl的表达及作用。下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中未标明来源的试剂和材料均可商购获得。实施例1CGREF1在各细胞系中的表达情况实施例1.1双萤光素酶报告系统的检测
HEK293T细胞(购自美国ATCC)常规传代培养于含10%胎牛血清(HyClone，SH30084.03)的 DMEM 培养基(HyClone, SH30022.01B)中，37。C，5%C02 孵箱中培养。按照1.2X IO6细胞/ml的密度，接种于96孔板，每孔100 yl，置于孵箱培养18小时 24小时，使细胞密度达到40%飞0%，以备转染。按照说明书，使用VigoFect阳离子转染试剂(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)分别将50ng pAP-l-Luc、5ng pRL-TK-LUC和50ng待筛基因或者对照质粒共转入J1EK293T细胞。转染pcDNA3.l/myC-His(-)B(pCDB)空载体的细胞作为空白对照。转染p⑶B-mekk基因的细胞作为激活pAP-1-Luc表达的阳性对照。每种待筛质粒设6个复孔。其中3个复孔在收板前六小时加入刺激剂佛波酯和离子霉素(PMA和离子霉素(1nomycin),购自sigma, P-8139 ;和Calbiochem, #407952),以观察目的基因对通路的抑制作用，培养24小时后检测萤光素酶活性。按照双萤光素酶报告系统(Promega，E1960)的说明书裂解细胞后，利用多功能微孔板检测系统GENios Pro (Tecan)检测萤光素酶强度。转染空载体对照p⑶B的细胞的相对萤光值设为100%。结果取3个复孔的平均值。结果参见图1，筛选了 1000个基因对pAP-1-Luc相对萤光素酶活性的影响，其中，空载体对照组转染PCDB相对萤光素酶活性为I ;CGREF1相对萤光素酶活性为0.5，通路激活后的抑制率为0.3。实施例2经典分泌型CGREFl的检测一般的分泌蛋白在其N端都具有信号肽序列，可以通过经典的内质网-高尔基体途径进行运输，并最终分泌到细胞外.而Brefeldin A，简称BFA，是一种常用的蛋白转运抑制齐U，可以特异性地可逆地阻断蛋白质从内质网(ER)转运到高尔基体(Golgi)t5BrefeldinA处理后，高尔基体会很快被破坏，并融合到内质网上，将最终导致蛋白不能分泌到细胞外。将H印G2、H1299、HeLa 细胞以 30 万 / 孔铺于六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常规培养24小时，分别将3 u g p⑶B (阴性对照)、CGREFl的表达质粒(p⑶B载体)按照说明书，使用VigoFect (Vigorous公司)阳离子转染试剂将质粒分别转入细胞。继续培养24小后分别收集细胞培养上清及细胞。直接取20ul培养上清加入5ul5*loading buffer，95度变性，待上样。细胞用冰预冷的PBS洗涤细胞两次，加入RIPA裂解液(0.15M NaCl, 1%NP40,
0.5%sodium deoxycholic acid,0.1%SDS, 50mM Tris-HCl 以及现用现加的蛋白酶抑制剂cocktail)，冰上裂解细胞lh，细胞裂解液用离心机16000g，4°C离心20min，取上清用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40 ii g的总蛋白及25ul培养上清使用12.5%的SDS-PAGE进行电泳，用IBLOT Gel transfer system( Invitrogen,美国)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶(TBS-T配置)封闭2h，加入ant1-Myp抗体(购自MBL公司)封闭过夜。用TBS-T洗膜后，用相应的IRDyeTM800标记的二抗(1: 10，000)，室温下避光孵育lh，用TBS-T洗膜后，用红外扫描系统Odyssey Infrared Imager (LIC0R,美国)检测信号。结果参见图2，在3种不同细胞的培养上清中检测到的条带与细胞内检测到的目的条带抑制。将293T细胞以30万/孔铺于六孔板中常规培养24小时，转染CGREFl质粒(pCDB载体)，转染 18 小时后分别加入 lug/ml BFA (购自 Cell Signaling Technology, #9972),IOuM wortmannin作用2小时后收上清检测CGREFl的分泌情况，以DMSO作为对照组。免疫印迹检测同前。一抗使用ant1-Myp抗体(购自MBL公司)。
结果参见图3所示，经BFA处理后的细胞，与对照组比较，上清中检测到的目的条带减弱，细胞内的量有所增加。而经wortmannin处理后的细胞,未有变化。实施例3信号肽对CGREFl分泌的影响利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)软件对 CGREFl 信号肽保守切割位点的分析显示，CGREFl在N端有一个明显的信号肽序列，切割位点在19位和20位氨基酸之间。以CGREFl 的表达质粒为模板，用上游引物 Pl (5’-TGGAATTCCACCATGTTACCTTTGACGATGACA-3’ )及下游引物 P2 (5，-TGGGTACCACGATCTCATCAITCTCCACTTGAAC-3’ )进行扩增。N 端截短体 CGREFl- A SP 用上游引物 P3 (5，-GGAAITCCCACCATGTGCCCCAAAGGATG-3’ )及下游引物P2进行扩增。PCR产物片段回收后，用EcoR I和Kpn I双酶切，插入到pcDNA3.1/myc-His (-)B,构建成融合 myc 标签的 pcDB-CGREFl- A SP。将293T细胞以30万 /孔铺于六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常规培养24小时，将pcDB-CGREFl- A SP和pcDB-CGREFl分别转染细胞，继续培养24小后分别收集细胞培养上清及细胞。直接取20ul培养上清加入5ul5*上样缓冲液，95度变性，待上样。细胞用冰预冷的PBS洗涤细胞两次，加入RIPA裂解液(0.15M NaCl,l%NP40,0.5%去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholic acid), 0.1%SDS, 5OmM Tris-HCl 以及现用现加的蛋白酶抑制剂 cocktail),冰上裂解细胞lh，细胞裂解液用离心机16000g，4°C离心20min，取上清用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40 ii g的总蛋白及25ul培养上清使用12.5%的SDS-PAGE进行电泳，用IBLOT Gel transfer system (Invitrogen,美国)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶(TBS-T配置)封闭2h，加入ant1-Myp抗体(购自MBL公司)封闭过夜。用TBS-T洗膜后，用相应的IRDyeTM800标记的二抗(1:10，000)，室温下避光孵育lh，用TBS-T洗膜后，用红外扫描系统Odyssey Infrared Imager (LIC0R,美国)检测信号。结果参见图4，正常的CGREFl质粒转染入细胞后，在上清中能够检测到该蛋白的表达。而去掉信号肽的截短体质粒转染细胞后，在上清中未检测到蛋白表达条带。 实施例4蛋白质N端测序将293-6e细胞铺到150mm细胞培养皿中(NEST)，待细胞融合度达到90%进行转染。将25ugpcDB-CGREFl质粒与169ul线性PEI混合，15分钟后瞬转入细胞。转染18小时后，更换Freestyle293Expression Medium (Invitrogen,)无血清的培养基培养细胞。3天后收获上清。离心后的细胞培养上清加入终浓度IOmM的咪唑及500mM的NaCl，用N1-S印haroseTM6Fast Flow (GE)进行纯化。用平衡缓冲液(IOmM咪唑，500Mm NaCl,IXPBS PH7.4)洗涤柱子，以洗去未结合的杂蛋白。用洗脱液(IOOmM咪唑，500Mm NaCl,IXPBS PH7.4)分次洗脱结合的蛋白，每次lml，共收集IOml洗脱液。经超滤浓缩后用PAGE检测蛋白纯化效果，并定量。取SOug蛋白，加入5*loading buffer后95度变性10分钟，PAGE上样电泳，浓缩胶80V，分离胶120V电泳。将蛋白转到PVDF膜上，稳压160V，转3小时。将PVDF膜放入考马斯亮蓝染液中考染10分钟。脱色I小时，将膜晾干后送公司进行N端测序。结果见图5A-J，通过蛋白质N端测序检测，该蛋白在第19和第20位氨基酸之间确实发生切割。实施例5CGREF1质粒对AP-1及其两个相关蛋白c_Jun、c-Fos的荧光素酶活性的影响HE293T细胞(购自美国ATCC)按每孔1.5X104个细胞接种至96孔板中，24小时后96孔板每孔细胞共转染50ng的筛选质粒，50ng的含有萤火虫荧光素酶的报告基因质粒AP-l-luc，4ng的含有海肾荧光素酶的报告基因质粒pRL-TK。转染24小时后，加入PMA(100ng/ml)和1nomycin (IyM)的刺激。刺激6小时后，弃培养上清,加入lysis buffer裂解细胞。用 GENios Pro reader (TECAN,瑞士)，按照 Dual-luciferas repoter assaysystem的说明书分别检测细胞裂解液中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。转染c-Jun及c-Fos反式报告基因时,96孔板每孔加入50ng的质粒，45ng的表达萤火虫荧光素酶的pFR-luc，5ng的pFA-c-Jun，4ng的含有海肾荧光素酶的报告基因质粒PRL-TK0实验方法如前所述。实验结果见图6A-C，瞬时转染CGREFl后，与空白对照组比较，该序列能够明显抑制AP-1、c-Jun及c-Fos报告基因的活性。实施例6纯化后的蛋白对AP-1通路的影响 HE293T细胞(购自美国ATCC)按每孔1.5X104个细胞接种至96孔板中，24小时后96孔板每孔细胞共转染50ng的筛选质粒，50ng的含有萤火虫荧光素酶的报告基因质粒AP-l-luc，4ng的含有海肾荧光素酶的报告基因质粒pRL-TK。转染16小时后，加入不同浓度的纯化蛋白，蛋白总量分别为:25ng，50ng，100ng，200ng。加入蛋白作用24小时候，力口A PMA (100ng/ml)和1nomycin (I PM)的刺激。刺激6小时后,弃培养上清,加入Iysisbuffer 裂解细胞。用 GENios Pro reader (TECAN,瑞士)，按照 Dual-luciferas repoterassay system的说明书分别检测细胞裂解液中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。结果见图7，在加入的蛋白量达到200ng时，能够看到蛋白对AP-1通路有一定的抑制作用。实施例7CGREF1对细胞增殖状况的影响HEK293T细胞(购自美国ATCC)及HCT116细胞(北京大学医学部馈赠)常规传代培养于含 10% 胎牛血清(HyClone, SH30084.03)的 DMEM 培养基(HyClone, SH30022.01B)中，37° C，5%C02孵箱中培养。按照2X103细胞/ml的密度，接种于96孔板，每孔100 yl，置于孵箱培养18小时 24小时，使细胞密度达到40%飞0%，以备转染。按照说明书，使用VigoFect阳离子转染试剂(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)分别将20ng p⑶B (阴性对照)、CGREFl表达质粒(pCDB载体)、Hras (pCDB载体，阳性对照)转入HEK293T细胞，每种待筛质粒设3个复孔。继续培养分别于培养后24h、48h、72h、96h、120h和144h时加入CCK-8 (Cell Counting Kit_8，购自日本同仁化学CK04)每孔加入10ul，利用多功能微孔板检测系统GENios Pro (Tecan)测定各孔的吸光度值。结果如图8A-B所示，可以看出，CGREFl对细胞的增殖有抑制作用。实施例8观察CGREFl对AP-1通路相关基因蛋白水平的变化AP-1是一类重要的真核细胞转录因子，主要由Jun、Fos、ATF及JDP亚家族组成，亚家族单体以同源或异源二聚体形式结合DNA靶序列，参与靶基因调节。哺乳动物中AP-1的主要成分是Jun和Fos，通过碱性亮氨酸拉链(bZIP)与DNA结合(例如参见 Libermann TA, Zerbini LF.Targeting transcription factors for cancer genetherapy.Curr Gene Ther, 2006，6 (I): 17-33.)。AP-1 正常情况下活性很低或无活性，但经细胞因子、生长因子、感染、致癌刺激等生理或病理信号刺激，通过丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)等信号传导通路激活Jun N末端激酶(JNK)，使JNK从细胞质易位到胞核，并使Jun磷酸化而激活AP-1，活化后的AP-1与DNA序列结合，启动多种与细胞分裂和增殖相关基因的转录，从而参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。AP-1活性失调与炎症和肿瘤等多种疾病的发生和发展直接相关(例如参见Shaulian E, Karin M.AP-1as a regulatorof cell life and death.Nat Cell Biol, 2002, 4(5):E131-136 ；ffagner EF, Eferl R-Fos/AP-1proteins in bone and the immune system.1mmunol Rev,2005, 208:126-140 ；MacianF, Lopez-Rodriguez C, Rao A.Partners in tran-scription:NFAT and AP-1.0ncogene, 2001, 20:2476-2489.)。免疫印记检测HEK293T细胞内AP-1下游基因的蛋白表达量。根据培养要求按转染试剂说明书分别将3 u g p⑶B (阴性对照)、CGREFI表达质粒(p⑶B载体)转染入6孔板的一个孔细胞中。培养24小时后细胞用冰预冷的PBS洗涤细胞两次，加入RIPA裂解液(0.15MNaCl, 1%NP40,0.5%sodium deoxycholic acid, 0.1%SDS, 5OmM Tris-HCl 以及现用现加的蛋白酶抑制剂cocktail)，冰上裂解细胞lh，细胞裂解液用离心机16000g，4°C离心20min，取上清用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40 ii g的总蛋白及25ul培养上清使用12.5%的 SDS-PAGE 进行电泳,用 IBLOT Gel transfer system (Invitrogen,美国)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶(TBS-T配置)封闭2h，一 抗分别使用p38、JNK、ERK的总蛋白及磷酸化抗体和c-Jun的抗体(均购自Cell Signaling公司)封闭过夜。用TBS-T洗膜后，用相应的IRDyeTM800标记的二抗(1: 10，000)，室温下避光孵育lh，用TBS-T洗膜后，用红外扫描系统Odyssey Infrared Imager (LIC0R,美国)检测信号。结果如图9A-B，与MEKK阳性对照组相比，CGREFl均能引起AP-1通路相关基因蛋白水平的下调。
权利要求
1.编码抑制细胞增殖的蛋白质CGREFl的核苷酸序列SEQID NO:1或者其互补序列。
2.表达抑制细胞增殖的蛋白质CGREFl的核苷酸序列SEQID NO:2或其互补序列。
3.包含如权利要求1或2所述的核苷酸序列的重组载体。
4.含有如权利要求3所述的重组载体的重组细胞。
5.一种抑制细胞增殖的蛋白质CGREFl，所述蛋白质CGREFl的序列为SEQ ID NO:3。
6.如权利要求1或2所述的核苷酸序列，如权利要求3所述的重组载体、如权利要求4所述的重组细胞或如权利要求5所述的蛋白质在抑制细胞增殖中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述用途为抑制激活蛋白-1(AP-1)通路的活性。
8.如权利要求6或7所述的用途，其中，所抑制的细胞为表达蛋白质CGREFl的人源细胞，优选地所述人源细胞选自由骨髓瘤细胞、脑瘤细胞、脊髓瘤细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、人胚肾细胞、宫 颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞和食管癌细胞所组成的组，更优选地所述人源细胞为293T和Hela细胞。
9.如权利要求1或2所述的核苷酸序列，如权利要求3所述的重组载体、如权利要求4所述的重组细胞或如权利要求5所述的蛋白质在用于诊断和/或治疗与细胞增殖相关的疾病的药物的制备中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述疾病是癌症和/或炎症，其中优选地，所述癌症选自由骨髓瘤、脑瘤、脊髓瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、人胚肾、宫颈癌、神经母细胞瘤和食管癌组成的组。
全文摘要
本发明公开了表达抑制细胞增殖的蛋白质CGREF1及其表达序列，所述蛋白质和所属表达序列可用于抑制细胞增殖以及诊断和/或治疗与细胞增殖相关的疾病的药物的制备。
文档编号C12N15/63GK103215273SQ20131002698
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者邓唯唯, 石太平, 雄英, 李静, 马大龙 申请人:北京诺赛基因组研究中心有限公司