使用来自木质纤维材料的生化转化方法的固体残留物生产酶混合物的方法

使用来自木质纤维材料的生化转化方法的固体残留物生产酶混合物的方法
【专利摘要】本发明涉及使用纤维素水解微生物在浸没培养中生产酶混合物的方法，包括两个阶段：阶段a)，使所述微生物在存在至少一种碳生长底物的情况下在封闭反应器中生长的阶段，所述碳生长底物在所述培养阶段中的浓度在10-90g/L之间；阶段b)，酶混合物的生产阶段，其中供入至少一种碳诱导底物，所述碳诱导底物是来自经过预处理步骤的木质纤维材料的酶促水解的至少一种固体残留物，所述碳生长底物在所述生产阶段中的浓度在150-400g/L之间。
【专利说明】使用来自木质纤维材料的生化转化方法的固体残留物生产 酶混合物的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及纤维素酶和半纤维素酶的生产，特别是在从纤维素或木质纤维材料生 产乙醇的情况下。 现有技术
[0002] 1970年代以来，在将组成的多糖水解为可发酵的糖之后，将木质纤维材料转 化为乙醇成为了许多研究的焦点。可研究的实例为来自National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol，Humbird等人，NREL/TP-5100_57764,2011 年 5 月） 的参考工作。
[0003] 木质纤维材料是纤维素材料，即包含按重量计大于90 %的纤维素，和/或木质纤 维材料，即由纤维素、半纤维素组成，其是主要由戊糖和己糖和木质素组成的多糖，所述木 质素是具有复合结构和高分子量的大分子，由通过醚键连接的芳香醇组成。
[0004] 木头，麦杆和玉米芯是最广泛使用的木质纤维材料，但是也可使用其它来源，专用 森林培养物（cultures forestiSres d6di6es)，产醇的糖和谷物植物的残留物，造纸工业 的产物和残留物，以及纤维素和木质素材料的转化产物。它们主要由大约35% -50%的纤 维素，20% -30%的半纤维素和15% -25%的木质素组成。
[0005] 将木质纤维材料转化为乙醇的方法包括：物理-化学预处理步骤，接下来是酶促 或化学水解步骤，释放出来的糖的乙醇发酵步骤，所述乙醇发酵和酶促水解可以同时进行， 以及回收乙醇的步骤。
[0006] 经过预处理的材料使用酸途径进行水解，或者使用酶促途径借助于纤维素酶和/ 或半纤维素酶进行水解。
[0007] 借助于强酸，特别是硫酸进行的酸途径是有效的，但需要大量的化学产品（酸， 然后是用于中和的碱）。酶促水解没有受到这些劣势的困扰：其也在温和的条件下进 行并且是有效的。相比之下，酶的价格仍然很高，占木质纤维材料转化为乙醇的成本的 30% -50%。由于这个原因，为了减少这项成本进行了许多研究：最初是通过筛选高产菌株 并通过改进所述酶的生产方法以优化酶的生产，然后是通过优化预处理阶段或通过改进那 些酶的比活性以降低水解中的酶量。
[0008] 然而，酶量的减少可能导致大部分的纤维素没有转化，包括从酶促水解步骤和/ 或发酵步骤得到的大量固体残留物的生产。当酶促水解在干物质含量高的情况下进行时， 观察到同样的效果；由重量百分比表示的样品的干物质含量是在l〇5°C干燥24小时后获得 的样品质量与样品的初始质量的比例。该固体残留物接下来必须重新处理，常规地通过燃 烧以产生蒸汽和电，或通过甲烷化以生产沼气。
[0009] 在过去十年期间，主要研究集中在理解纤维素酶的作用机制和酶的表达，以通过 使用分子生物学工具修饰菌株，分泌出最适合水解木质纤维底物的酶混合物。
[0010] 所述酶混合物是纤维素酶和/或半纤维素酶的混合物。所述酶混合物的酶包括 三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，纤维二糖酶也被称为 β-葡萄糖苷酶。
[0011] 最广泛用于生产酶混合物的微生物是真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)。在诱 导底物（例如纤维素）的存在下，野生菌株具有分泌被认为最适于水解纤维素的酶混合物 的能力。里氏木霉还生产具有对于木质纤维材料的水解不可或缺的性质的其他蛋白质，例 如木聚糖酶。诱导底物的存在是表达纤维素酶和/或半纤维素酶不可或缺的。含碳诱导底 物的性质对酶混合物的组成具有相当大的影响。在使用木糖时就是这种情况，木糖在与含 碳诱导底物（诸如纤维素或乳糖）组合时，能够明显改进被称为木聚糖酶活性的活性。
[0012] 乳糖仍然是生产酶混合物的工业方法中最合适的底物之一；然而，它的成本变化 很大，并且占酶成本价格的大约1/3或2/3。当乳糖被作为碳源使用时，酶混合物的生产方 法取决于外部碳源。由于这个原因，如果诱导性碳源易于得到，则从木质纤维材料的生化转 化方法获得的含碳底物的应用是重大的进展。
[0013] 专利申请EP1690944A1公开了在醇发酵和乙醇分离之后得到的含水相作为诱导 性碳源的用途，和用于纤维素水解微生物培养物的生长和酶的生产。蒸馏塔底部得到的残 留物被称为"淤泥"。将其过滤并将可溶生部分用于生产纤维素酶。
[0014] 专利申请W009026716A1描述了由包含来自纤维素酶生产的诱导糖的含碳底物开 始，从里氏木霉生产酶混合物。该申请公开了以重量计3%的诱导糖足够诱导纤维素酶的生 产。所描述的诱导糖是可能通过纤维素水解产生的单糖、双糖和寡糖。
[0015] 专利申请W011028554公开了经过酸处理的生物质用于培养用于生产纤维素酶的 微生物的用途，以及从半纤维素水解得到的固体残留物的用途。该固体残留物已经过木质 素提取步骤而不含木质素级分。该脱木质素固体残留物从微生物生长阶段开始使用，由于 直到酶生产开始之前培养基的高粘性，这诱导了操作上的困难。
[0016] 已知木质素，特别是组成木质素的酚化合物，对酶具有抑制作用（参见 "Inhibition of enzymatic cellulolysis by phenolic compounds, Tejirian and Xu, Enzyme and Microbial Technology vol. 48 (3) pp. 239-247, Mars2011>,) 〇
[0017] 专利US3972775公开了从由水解物和纤维素诱导剂（例如粉碎的纤维素饲料）得 到的糖液生产纤维素水解微生物和酶。所述饲料和纤维素诱导剂是纤维素废料，并且因此 不含木质素。
[0018] 专利GB1489145公开了纤维素水解微生物的培养和从纤维素残留物生产酶，所述 残留物得自纯纤维素材料或纤维素废料。因此，它们不是直接得自木质纤维材料的转化方 法。
[0019] 本发明的目的之一是提供易于得到的诱导碳源，其能够生产具有适合于水解木质 纤维材料的活性的酶混合物。本发明同样能够用于不能升级为乙醇的副产物的初步升级。
[0020] 发明概述及优势
[0021] 本发明涉及一种通过纤维素水解微生物生产酶混合物的方法，其特征在于所述方 法使用来自经过预处理步骤的木质纤维材料的酶促水解的固体残留物，以及可选地，来自 所述材料的酶促水解物的乙醇发酵的固体残留物。
[0022] 本发明的优势之一是减少或免除向用于转化木质纤维材料的生化过程添加外源 含碳底物。另一个优势在于将用于生产酶混合物的来自所述生化转化过程的固体残留物升 级。该升级意味着可以减少所产生的在排放或储存前必须经过预处理的流出物的量。
[0023] 由于将包含纤维素和木质素的所述固体残留物升级以用于生产酶混合物，降低了 所述混合物的成本。进一步，由于本发明的方法，所述残留物能够用于升级途径中，并且因 此可在酶促水解步骤中进行仅部分的水解，通过减少在所述水解步骤中使用的酶混合物的 量而获得。后一种作用还导致用于木质纤维素材料的生化转化的方法的成本降低。
[0024] 在处理的木质纤维材料难以进行酶促水解处理（例如白杨或芒）时，本发明具有 更多的优势。
[0025] 本发明的方法的额外的优势是，生产的酶混合物尤其适合在生化转化过程中转化 的经过预处理的木质纤维材料的酶促水解。所述残留物，尽管它们具有高木质素含量，却出 人意料地具有诱导作用，允许生产所述酶混合物。
[0026] 发明详述
[0027] 本发明涉及一种使用纤维素水解微生物生产酶混合物的方法，包括两个阶段：
[0028] 阶段a)，使所述微生物在存在至少一种含碳生长底物的情况下，在封闭反应器中 生长的阶段，所述生长阶段在10_90g/L范围的含碳生长底物浓度下进行；
[0029] 阶段b)，酶混合物的生产阶段，其中提供至少一种含碳诱导底物，所述含碳诱导底 物是从经过预处理步骤的木质素材料的酶促水解步骤获得的至少一种固体残留物，任选地 和从酶促水解物的乙醇发酵步骤获得的至少一种固体残留物，所述生产阶段在150_400g/L 范围的含碳生产底物浓度下进行。
[0030] 用于生产酶混合物的所述方法使用浸没培养进行。术语"浸没培养"是指在液体 培养基中培养。
[0031] 在本发明的酶混合物的生产方法中使用的微生物是属于木霉属（Trichoderma)、 曲霉属（Aspergillus)、青霉属（Penicillium)或裂裙菌属（Schizophyllum)的真菌的 菌株，优选是属于里氏木霉种的真菌菌株。表现最好的工业菌株是属于里氏木霉种，通 过突变-选择过程以改进酶混合物的经修饰的菌株，例如，如菌株IFP CL847(法国专利 FR-B-2555803)。同样可以使用通过基因重组技术改进的菌株。在搅拌通风的反应器中在 与其生长和酶生产相容的条件下培养这些菌株。
[0032] 在本发明方法的所述生长阶段a)中使用的用于所述微生物的含碳生长底物有利 地选自可溶性工业糖，优选地选自葡萄糖、乳糖、木糖、来自木质纤维材料的酶促水解物的 单糖在乙醇发酵后得到的液体残留物，和得自经过预处理的木质纤维底物的单体形式的半 纤维素级分的提取物，单独使用或作为混合物使用。依赖于其性质，将所述含碳生长底物在 灭菌前引入封闭反应器中，或分别灭菌并引入灭菌后的封闭反应器中。
[0033] 根据本发明，在所述生长阶段a)中使用的所述含碳生长底物的初始浓度在 10-90g含碳底物/升反应体积的范围。
[0034] 优选地，所述生长阶段a)进行30-70小时范围内的一段时间，优选30-40小时的 范围。
[0035] 优选地，所述生长阶段a)在pH4. 8和27°C的温度下进行。
[0036] 根据本发明，在所述生产阶段b)中使用的所述含碳诱导底物有利地是从经过预 处理步骤的木质纤维材料的酶促水解步骤获得的至少一种固体残留物，和/或从酶促水解 物的乙醇发酵步骤获得的至少一种固体残留物。
[0037] 所述固体残留物优选在部分酶促水解后得到，S卩，所述酶促水解在高干物质（DM) 含量和/或小量酶混合物下进行时。术语"高DM含量"是指以重量计大于20%的DM。术 语"小量酶混合物"是指少于l〇mg酶混合物/克在经过预处理步骤的木质纤维材料中的纤 维素。术语"部分水解"是指以重量计仅20% -70%在至水解步骤的入口处的纤维素被水 解。
[0038] 所述固体残留物有利地从酶促水解步骤的流出物分离，并且当它被使用时，从乙 醇发酵步骤的流出物分离。所述分离有利地通过过滤，离心或技术人员已知的允许分离固 相和液相的任何其它方法进行。
[0039] 因此，所述固体残留物直接从木质纤维材料的生化转化方法获得。
[0040] 所述固体残留物包含固体部分和液体部分。取决于使用的分离方法，所述固体残 留物的固体级分按重量计占所述固体残留物的10% -40%。所述固体级分由木质素、无机 化合物和未水解的纤维素组成。所述固体部分中的纤维素级分按重量计为10% -50%。 所述固体部分中的木质素级分按重量计为45% -80%。所述固体部分中的无机化合物 级分按重量计为1%-15%。所述固体残留物的液体级分包含木糖（没有被酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)发酵），其为木聚糖酶生产的诱导剂。
[0041] 优选地，所述含碳诱导底物与至少一种其它含碳底物一起作为混合物使用。
[0042] 优先地，所述其它含碳底物选自诱导糖或非诱导糖，优选选自乳糖、葡萄糖、纤维 素水解物、半纤维素水解物，纤维二糖和木糖，单独或作为混合物使用。高度优选地，所述其 它含碳底物选自非诱导糖，高度优选地来自葡萄糖、纤维素水解物和半纤维素水解物。
[0043] 这种混合物称作含碳生产底物。所述含碳生产底物包含按重量计至少5%的纤维 素。
[0044] 所述含碳生产底物以150_400g含碳底物/升含碳生产底物的浓度制备。生产阶 段b)中的含碳生产底物有利地以在35-65mg含碳底物/克微生物/小时的范围的特定流 速（specific flow rate)提供，优选35-45mg的含碳底物/克微生物/小时。
[0045] 所述固体残留物得自经过预处理步骤的木质纤维材料的酶促水解步骤。可选地， 添加得自酶促水解物的乙醇发酵步骤的固体残留物。
[0046] 木质纤维材料的预处理步骤可用于改进纤维素级分对酶促水解的易感性。优选 地，所述预处理步骤是酸预处理步骤，优选酸水解、酸蒸煮或蒸汽喷发步骤，并预先使用硫 酸水溶液浸渍所述材料。优选地，所述预处理步骤是蒸汽喷发。
[0047] 在预处理步骤结束时，有利地通过液/固分离，将固体残留物与包含糖的液体级 分（称为半纤维素水解物）分离。所述残留物也可有利地在阶段b)中作为含碳诱导底物 用于本发明的酶混合物的生产。在生产阶段b)中使用的含碳诱导底物因而可以有利地在 木质纤维材料的预处理步骤结束时分离。
[0048] 优选地，所述生产阶段b)进行多于至少30小时的一段时间，优选多于至少100小 时。
[0049] 优选地，所述生产阶段b)在3-5. 5范围的pH和20°C -30°C范围的温度下进行。
[0050] 所述生产阶段b)可以按分批补料和恒化器（chemostat)模式进行，这是技术人员 已知的。
[0051] 在优选的实施方式中，预处理的木质纤维材料在酶促水解步骤被水解。随后，将来 自该步骤的流出物在酶促水解物的单糖的乙醇发酵步骤中处理。这些处理可以在相同或不 同的装置中进行。固体残留物在酶促水解步骤后和/或在乙醇发酵步骤后被分离。
[0052] 在另一个优选的实施方式中，发酵步骤和至少一部分水解步骤同时进行。例如，这 通过在水解步骤期间添加乙醇酵母来实施。在发酵步骤结束时分离固体残留物。
[0053] 水解步骤通过添加酶混合物启动。有利地，其用量是l_60mg酶混合物/克经过 预处理步骤的木质纤维材料中的纤维素，优选5_35mg酶混合物/克所述材料中的纤维 素，并且更优选5-20mg酶混合物/克所述材料中的纤维素。所述水解步骤使用按重量计 10% -40%的DM进行，优选按重量计15% -25%的DM。
[0054] 下述实施例阐述了本发明，但不限制其范围。
[0055] 实施例1 :用葡萄糖生产酶混合物（没有根据本发明）
[0056] 在机械搅拌式反应器中生产酶混合物。无机培养基（称为4N)具有如下组 成：K0H1. 66g/L，85 % H3P042mL/L，（NH4)2S0 42. 8g/L，MgS04. 7Η200· 6g/L，CaCl20. 6g/L， MnS043. 2mg/L，ZnS04. 7H202. 8mg/L，C〇C12104. Omg/L，FeS04. 7H2010mg/L，玉米浆 1. 2g/L，消 泡剂 0. 5mL/L。
[0057] 液体预培养
[0058] 通过使用浓度为30g/L的葡萄糖作为含碳生长底物，来培养微生物（里氏木霉 CL847菌株）。预培养的无机培养基是4N培养基，补充5g/L邻苯二甲酸钾用于缓冲pH。接 种物生长持续3天，并在30°C的搅拌培养器中进行。如果剩余葡萄糖浓度低于15g/L，则进 行至反应器转移。
[0059] 生长阶段
[0060] 将包含4N培养基的反应器在120°C下灭菌20分钟。葡萄糖含碳生长底物在120°C 下灭菌20分钟，随后以无菌的方式加入反应器，从而产生30g/L的浓度。反应器以10% (v/ v)接种里氏木霉CL847菌株的液体预培养物。操作条件为温度27°C，pH4. 8 (使用5. 5M氨水 调节）。通风量为0. 5vvm，并且搅拌增加至200和800rpm之间，作为维持在30%的p02 (溶 解氧压力）的函数。
[0061] 生产阶段
[0062] 当反应器的含碳生长底物耗尽时，将250g/L的葡萄糖含碳生产底物以35mg/g微 生物/小时的流速持续注入164小时。操作条件为：温度25°C，pH4(使用5. 5M氨水调节， 氨水还提供了分泌蛋白质的合成所必须的氮）。通过调整搅拌使溶解氧含量维持在30%。
[0063] 通过测定细胞外蛋白质监测酶混合物的生产，其中，在通过过滤或离心分离出菌 丝体后使用Lowry法和标准BSA测定细胞外蛋白质。
[0064] 对最终汁液进行的分析检测提供如下结果：
[0065] 。生物质（g/L) 15. 2
[0066] 。蛋白质（g/L) 2.9
[0067] 。qp(mg/g/h) 1.2
[0068] 其中qp是指酶混合物的特定生产率。
[0069] 实施例2 :用乳糖生产酶（没有根据本发明）
[0070] 在与实施例1同样的条件下生产酶混合物。用于生长和生产的含碳底物是纯的乳 糖。乳糖是酶混合物生产中的重要诱导剂。
[0071] 生长30小时后，在含碳生长底物耗尽后，将分批补料溶液，250g/L，以35mg微生物 /小时的流速持续注入164小时。
[0072] 对最终汁液进行的分析检测提供如下结果：
[0073] 。生物质（g/L) 13. 5
[0074] 。蛋白质（g/L) 37.8
[0075] 。qp(mg/g/h) 17
[0076] 清楚地观察到通过乳糖诱导酶混合物的生产（蛋白质浓度和高qp)
[0077] 实施例3 :固体残留物和各种含碳底物的诱导作用
[0078] 在使用相同的预培养，在烧瓶中对各种含碳底物的诱导作用进行了研究。烧瓶由 一式两份组成，并且使用的含碳生产底物是葡萄糖（酶混合物生产的抑制剂），乳糖（诱导 剂），纤维素（诱导剂），和两种不同浓度的固体水解残留物。固体残留物由在酸性条件下 通过蒸汽喷发而预处理的小麦秸杆的部分水解（70% )得到。将这种残留物清洗并压缩到 30 % DM。它具有如下组成：19 %纤维素，59 %木质素，2. 9 %半纤维素，0. 6 %乙酰基化合物， 11%灰分，7. 5%nd(未测定）。
[0079] 里氏木霉真菌在预培养中的生长在10g/L浓度的葡萄糖上进行。接种物的生长 持续3天，在30°C的Infors培养器中，并在搅拌（150rpm)下，在两个350mL有效容积的 Fernbach烧瓶中进行。两个烧瓶在预培养结束时混合。剩余葡萄糖浓度是0. 3g/L。
[0080] 烧瓶的组成详见表1。它们在接种前被灭菌。
[0081] 表 1
[0082]
【权利要求】
1. 一种使用纤维素水解微生物生产酶混合物的方法，包括两个阶段： 阶段a)，使所述微生物在存在至少一种含碳生长底物的情况下，在封闭反应器中生长 的阶段，所述生长阶段在10_90g/L范围的含碳生长底物浓度下进行； 阶段b)，酶混合物的生产阶段，其中提供至少一种含碳诱导底物，所述含碳诱导底物是 从经过预处理步骤的木质纤维材料的酶促水解步骤获得的至少一种固体残留物，所述生产 阶段在150_400g/L范围的含碳生产底物浓度下进行。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述固体残留物在部分酶促水解后得到。
3. 根据权利要求1的方法，其中所述固体残留物的固体部分中的木质素部分按重量计 为 45% -80%。
4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述固体残留物从酶促水解步骤的流出物 分离。
5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述含碳诱导底物与选自诱导糖或非诱导 糖的至少一种其它含碳底物一起作为混合物使用。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述其它含碳底物选自乳糖、葡萄糖、纤维素水解物、 半纤维素水解物、纤维二糖和木糖，其单独使用或作为混合物使用。
7. 根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述含碳生产底物包含按重量计至少5% 的纤维素。
8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述生产阶段b)中使用的含碳生产底物 以在35-65mg含碳底物/克微生物/小时的范围的特定流速提供。
9. 根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述含碳诱导底物在木质素材料的预处理 步骤结束时被分离。
10. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述水解步骤以l-60mg酶混合物/克经 过预处理步骤的木质纤维材料中的纤维素启动。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述水解步骤在按重量计10% -40%的DM下进行。
12. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述纤维素水解微生物选自属于木霉属、 曲霉属、青霉属或裂褶菌属的真菌的菌株。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述纤维素水解微生物属于里氏木霉种。
14. 根据前述任一项权利要求的方法，其中所述含碳诱导底物包括从酶促水解物的乙 醇发酵步骤获得的至少一种固体残留物。
【文档编号】C12N9/42GK104160021SQ201280062033
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2011年12月14日
【发明者】F·本沙巴纳, S·卢雷 申请人:Ifp新能源公司