结直肠和乳腺癌诊断方法中的dna甲基化的利记博彩app

结直肠和乳腺癌诊断方法中的dna甲基化的利记博彩app
【专利摘要】本发明一般地涉及这样的核酸分子，对于所述核酸分子之DNA甲基化水平的变化指示赘生物的发生或发生倾向。更特别地，本发明涉及这样的核酸分子，对于所述核酸分子之DNA甲基化水平的变化指示大肠或乳腺赘生物(例如腺瘤或腺癌)的发生和/或进展。本发明的DNA甲基化状态可用于一系列应用，包括但不限于涉及诊断和/或监测结直肠或乳腺赘生物(例如结直肠或乳腺腺癌)的那些应用。因此，在一个相关方面中，本发明涉及通过筛选一种或更多种核酸分子的DNA甲基化中的调节来筛选赘生物的发生、发生倾向和/或进展的方法。用于本发明中诊断的核酸分子是来自LOC100526820(随后命名为CAHM，结直肠腺癌高甲基化)的序列。
【专利说明】结直肠和乳腺癌诊断方法中的DNA甲基化
【技术领域】
[0001]本发明一般地涉及这样的核酸分子，对于所述核酸分子之DNA甲基化水平的变化指示赘生物(neoplasm)的发生或发生倾向。更特别地，本发明涉及这样的核酸分子，对于所述核酸分子之DNA甲基化水平的变化指示大肠或乳腺赘生物(例如腺瘤或腺癌)的发生和/或进展。本发明的DNA甲基化状态可用于一系列应用，包括但不限于涉及诊断和/或监测结直肠或乳腺赘生物(例如结直肠或乳腺腺癌)的那些应用。因此，在一个相关方面中，本发明涉及通过筛选一种或更多种核酸分子的DNA甲基化中的调节来筛选赘生物发生、发生倾向和/或进展的方法。
【背景技术】
[0002]结直肠癌包括结肠、直肠和阑尾中的癌性生长。全世界每年有655，000例死亡，其是美国第四常见的癌症形式并且是西方世界癌症相关死亡的第三大主要原因。结直肠癌产生于结肠中的腺瘤性息肉。这些蘑菇形生长物通常是良性的，但是有一些随时间发展为癌症。局部结肠癌通常通过结肠镜检查来诊断。限制在结肠壁内的侵袭性癌(--ΜΙ期和II期)可通过外科手术治愈。如果未经治疗，则它们扩散至局部淋巴结(III期)，其中多至73%可通过外科手术和化学治疗来治愈。虽然化学治疗可延长存活，并且在罕见的情况下外科手术和化学治疗一起使患者得到治愈，但是转移至远端部位的癌症(IV期)通常是不可治愈的(Markowitz 和 Bertagnolli, 2009,N.Engl.J.Med.361 (25):2449-60)。对直肠癌使用辐射。
[0003]乳腺癌是起源于乳腺组织(最常起源于乳管的内衬或为所述管供应乳汁的小叶)的癌症类型。起源于导管的癌症称为导管癌，而起源于小叶的那些癌症称为小叶癌。虽然绝大多数情况发生在女性中，但是也可发生男性乳腺癌。
[0004]在全世界范围内，乳腺癌在女性中占据所有癌症的22.9 %，并且在女性中比在男性中常见100倍，但是男性由于诊断延迟而倾向于具有更不良的后果。乳腺癌的预后和存活率根据患者的癌症类型、分期、治疗和地理位置变化很大。西方世界的存活率较高；例如，在英格兰诊断有乳腺癌的10名妇女中有多于8名(84%)存活至少5年。但是，在发展中国家中，存活率要差得多。
[0005]许多癌症之前是腺瘤。腺瘤是上皮来源的良性肿瘤或赘生物，其来源于腺组织或者表现出明确限定的腺结构。一些腺瘤显示出可识别的组织元件，如纤维组织(纤维腺瘤)和上皮结构，而其他腺瘤例如支气管腺瘤产生可引起临床综合征的活性化合物。
[0006]腺瘤可发展变为侵袭性肿瘤，则称为腺癌。因此，腺癌定义为起源于腺结构(其是身体许多器官的构成部分)的恶性上皮肿瘤。术语腺癌也适用于显示出腺生长模式的肿瘤。这些肿瘤可根据它们产生的物质被亚分类为例如黏液分泌性腺癌和浆液性腺癌，或者根据其细胞微观排列成的模式亚分类为例如乳头状腺癌和滤泡状腺癌。这些癌可以是实体的或囊性的(囊腺癌)。每种器官可产生表现出多种组织学类型的肿瘤，例如卵巢可产生黏液腺癌和囊腺癌。[0007]不同器官中的腺瘤表现得不同。一般来说，存在于腺瘤内的癌(即，发生在良性病变内的癌症灶)的总体几率为约5%。但是，这与腺瘤的大小有关。例如，在大肠(具体为结肠和直肠)中，在小于I厘米的腺瘤中发生腺瘤内癌症十分罕见。这种发生在大于4厘米并且显示出某些组织病理学改变(如绒毛改变或高等级非典型性增生(dysplasia))的腺瘤中估计为40%至50%。具有更高程度异型增生的腺瘤具有更高的癌发病率。在任意给定的结直肠腺瘤中，器官中现在存在癌症或将来发生癌症的预测指标包括大小(尤其是大于9_)、由管状形态改变为绒毛形态的程度、高等级异型增生的存在以及描述为“锯齿状(serrated)腺瘤”的形态变化。在任意给定的个体中，另一些特征(年龄增加、结直肠腺瘤或癌的家族性发生、男性或腺瘤多样性)预测了器官中癌症未来提高的风险——所谓的癌症风险因素。除了腺瘤的存在及其大小之外，这些因素都不是客观定义的，并且除数目和大小之外的所有那些因素具有观察者误差并且具有对于所涉特征之精确定义的混乱。因为这些因素可能难以评估和定义，其值作为癌症现在或将来风险的预测指标是不精确的。
[0008]一旦形成了散发性腺瘤之后，新腺瘤发生的机会在26个月内为约30%。
[0009]结直肠癌的症状取决于肿瘤在肠中的位置以及其是否已转移。遗憾的是，许多症状也可出现在其他疾病中，因此症状可能不是结直肠癌的决定性诊断。
[0010]如果肿瘤更接近于肛门，则局部症状的可能性更大。可出现排便习惯(bowelhabit)改变(在不存在另一种原因的情况下的新发便秘或腹泻)、排便不尽的感觉和粪便直径减小。里急后重(tenesmus)和粪便形状改变均是直肠癌的特征。下胃肠道出血(包括粪便中排出鲜红色血液)可指示结直肠癌，正如黏液的存在提高可指示的一样。黑粪症(melena)(具有焦油状外观的黑色粪便)通常在上消化道出血(例如，来自十二指肠溃疡)中发生，但是有时也在结 直肠癌中遇到(当疾病位于大肠开端时)。
[0011]大得足以充满整个肠腔的肿瘤可导致肠梗阻。这种情况的特征在于便秘、腹痛、腹胀和呕吐。这偶尔会导致梗阻和膨胀的肠穿孔并导致腹膜炎。
[0012]当结直肠癌变为更晚期时，将发生该疾病的某些局部效应。大的肿瘤更可能基于腹部感觉而被注意到，并且其可在体检时被医生注意到。该疾病可侵袭其他器官，并且可导致尿道或阴道排出物中有血液或空气。
[0013]如果肿瘤导致了慢性潜隐性出血，则可发生缺铁性贫血。这可感觉到疲乏、心悸并且观察到面色苍白(pallor)。结直肠癌还可导致体重减轻，这一般由食欲降低引起。
[0014]更不寻常的全身症状是不明原因发热和数种副肿瘤综合征(paraneoplasticsyndrome)之一。最常见的副肿瘤综合征是血栓形成，通常为深静脉血栓形成。
[0015]结直肠癌最常扩散至肝。虽然这可能会被忽视，但是肝中大的沉积物可导致黄疸和腹痛(由于被膜拉伸)。如果肿瘤沉积物阻塞了胆管，则黄疸可伴随有胆道阻塞(例如浅色粪便)的其他特征。
[0016]结直肠癌的发生可需要很多年，并且结直肠癌的早期诊断极大地改善了预后。对实施结直肠癌筛选方法作出的即便适度的努力也可导致癌症死亡的下降。尽管如此，结直肠癌筛选率仍然很低。因此，对处于风险提高的个体推荐进行疾病筛选。目前有多种不同测试可用于该目的:
[0017].肓肠指检:医生将经润滑的带有手套的手指插入直肠中以感觉异常区。虽然其仅检测大得足以在直肠远部中感觉到的肿瘤，但是可用作初步筛选测试。[0018].大便潜血测试(Faecal occult blood test):粪便中血液的测试。两种类型的测试可用于检测粪便中的潜血，即基于愈创木脂(guaiac)的测试(化学测试)和免疫化学测试。免疫化学测试的敏感性优于化学测试的敏感性并且没有不可接受的特异性降低(ffeitzel JN(Decemberl999).“Genetic cancer risk assessment.Putting it alltogether”.Cancer86 (11 增刊):2483-92)。
[0019].内窥镜检查:
[0020]O乙状结肠镜检杳:将光探头(Iitprobe)(乙状结肠镜)插入直肠和降结肠中以检查息肉和其他异常。
[0021]O结肠镜检杳:将光探头(称为结肠镜)插入直肠和整个结肠中以寻找息肉和可由癌症造成的其他异常。结肠镜检查的优点在于如果在所述方法期间发现息肉，则可立即将其移除。还可对组织进行活检。
[0022]?双.对比_贝灌肠(double contrast barium enema, DCBE):首先，采取i寸夜准备Pj净化结肠。施用含有硫酸钡的灌肠剂，然后将空气吹入结肠中，使其膨胀。结果是在结肠的内衬上形成基于X射线胶片可视的钡薄膜。可通过该方式检测癌症或癌前期息肉。该技术可能漏掉(较不常见的)扁平息肉(flat polyp)。
[0023].虚拟结肠镜检杳代替具有专门计算机断层扫描的双对比钡灌肠(上述)中的X射线胶片，并且需要专门的工作站软件用于放射科医师解释。该技术在对息肉的敏感性方面接近结肠镜检 查。但是，发现的任何息肉仍必须通过标准结肠镜检查移除。
[0024].标准计算机轴向断层扫描是可用于确定癌症扩散程度的X射线基础，但是其敏感性不足以用于筛选。因其他原因进行的CAT扫描中发现一些癌症。
[0025].血液测试:测量患者血液中某些蛋白质的升高水平可给出肿瘤负荷的指示。特别地,血液中高水平的癌胚抗原(carcinoembroynic antigen,CEA)可指示腺癌的转移。这些测试经常是假阳性或假阴性的，不推荐用于筛选，并且其可用于评估疾病复发。CA19-9和CA242生物标志物可指示e-选择素相关转移风险，帮助追踪治疗进展，并且评估疾病复发。最近，用于在血浆中检测隔蛋白(Septin)9基因甲基化序列的测定也变得可用于辅助诊断结直肠癌。
[0026].lH电子发射断层扫描(positron emission tomoRraphy, PET)是将放射性糖注入患者中的3维扫描技术，在具有高代谢活性的组织中收集糖，并通过测量来自糖的辐射发射形成图像。因为癌细胞通常具有非常高的代谢速率，所以这可用于区分良性和恶性肿瘤。PET不用于筛选并且在结直肠癌病例的常规病情检查(workup)中(尚)未具有位置。
[0027].全身PET成像是用于检测复发结直肠癌的最准确诊断测试，并且是区分可切除疾病与不可切除疾病的合算的方法。每当主要管理决策有赖于肿瘤存在和程度的准确评价时，需要进行PET扫描。
[0028].粪便DNA测试是筛选结直肠癌的新兴技术。恶变前腺瘤和癌症使DNA标志物从其细胞中排出，其在消化过程期间不降解并且在粪便中保持稳定。捕获，然后进行PCR使DNA扩增至可检测水平用于测定。
[0029].高的C-反应蛋白水平作为风险标志物
[0030](http://www.sciencedaily.com/reIeases/2010/04/100419150831, htm)。
[0031]尽管存在这些测试，但是诊断仍然成问题。大多数更敏感的测试是非常侵入性和昂贵的，因此患者很少被患者采用。因此，仍然需要开发更简单且信息性更大的诊断方案或者能够在更可能已患腺瘤或癌的人中引导结肠镜检查的诊断辅助手段。简单且准确的筛选测试将使得能够建立可更广泛地应用的筛选系统。类似地，对于乳腺癌，如果在早期诊断出癌症，则预后显著更好，这通常难以可靠地实现，因为除了 BRCA基因测试作为侵略性癌症亚组的预后指标之外，仍然主要依赖于乳房X线检查(mammogram)和自身检查来鉴定肿瘤，所述两种技术对于可靠检测非常早期的癌症都是不足够敏感的。
[0032]在本发明之前的工作中，已确定了 L0C100526820(特别是L0C100526820的两个特定区域)的甲基化改变指示大肠赘生物(例如腺瘤和腺癌)的发生。另外，鉴定变为高甲基化的特异性基因组DNA胞嘧啶核苷酸使得能够开发非常简单和特异的扩增反应用于诊断情况下的常规使用。
[0033]发明概述
[0034]贯穿本说明书和所附权利要求书，除非上下文另有需要，否则词语“包括”及其变体“包含”和“含有”将理解为意指包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤的组。
[0035]本文中使用的术语“来源于”应认为指示特定的整数或整数组起源于所指定物种，但是不一定直接由所指定来源获得。此外，除非上下文另有明确规定，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
[0036]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同含义。
[0037]本说明书包括本文在文献目录之后示出的使用程序Patentln3.5版准备的核苷酸序列信息。在序列表中，通过数字指示符〈210〉然后是序列标识符(例如，〈210>1、〈210>2等)来确定每个核苷酸序列。数字指示符字段〈211〉、〈212〉和〈213〉提供的信息分别指示序列(DNA等)的长度、类型以及每条序列的来源生物。本说明书所提及的核苷酸序列由指示符SEQ ID NO:然后是序列标识符(例如，SEQ ID NO:USEQ ID NO:2等)来确定。本说明书所涉及的序列标识符与序列表中数字指示符字段〈400〉后面是序列标识符(例如，〈400>1、〈400>2等)提供的信息相关联。即，本说明书中详述的SEQ ID NO:1与序列表中指不为〈400>1的序列相关。
[0038]本发明的一个方面涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834097-163834982限定的DNA区域的甲基化状态，并且其中相对于对照水平，所述DNA区域较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0039]在另一个方面中，提供了一种在人中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834097-163834982限定的DNA区域的甲基化状态，并且其中相对于对照水平，所述DNA区域较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0040]本发明的又一个方面涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA 区域选自由 Hgl9 坐标 Chr6:163834295-163834500 或 Chr6:163834621-163834906 限定的DNA区域之一或二者，其中这些DNA区域之一或二者较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0041]在再一个方面中，提供了一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域选自由 Hgl9 坐标 Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的DNA区域之一或二者，其中这些DNA区域之一或二者较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0042]在本发明的再一个方面中，提供了一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估一个或更多个选自以下的胞嘧啶残基或相反DNA链上第n+1位处对应的胞嘧啶的甲基化:
[0043]Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
[0044]Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
[0045]Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
[0046]Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
[0047]Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
[0048]Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
[0049]Chr6:16383467 5 Chr6:163834678 Chr6:163834681
[0050]Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
[0051]Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855
[0052]Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
[0053]Chr6:163834872
[0054]其中相对于对照样品中对应残基的甲基化水平，一个或更多个所述残基较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0055]在另一个方面中，使用包括以下步骤的方法确定本发明DNA区域中提高的甲基化:
[0056](i)在足以诱导诱变的条件下用使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理来源于生物样品的DNA ；
[0057](ii)使用设计成扩增由SEQ IDNO:1、2、3或4之一限定的DNA区域的引物扩增步骤⑴的DNA ；
[0058](iii)对步骤(ii)的扩增产物进行测序，以确定相对于来自对照样品的DNA中的对应突变残基，来自所述测试样品的DNA中未经历突变的一个或更多个胞嘧啶残基的存在。
[0059]在另一个方面中，用亚硫酸氢盐或等效试剂诱导所述诱变并且非甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。
[0060]本发明的另一个方面涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hg 19坐标Chr6:163834295-163834500限定的DNA区域的表达水平，并且其中相对于对照水平，所述DNA区域较低的表达水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0061]本发明的另一个方面提供了用于测定生物样品的诊断试剂盒，其包含用于检测本发明标志物的一种或更多种物质以及可用于帮助所述物质进行检测的试剂。还可包含另一些装置，例如以接收生物样品。所述物质可以是任意合适的检测分子。
[0062]在一个实施方案中，所述试剂盒包含对应于SERQ IDNO:5、6、7、8、9、10、11或12的一种或更多种核酸分子或者基本上相似的核酸分子。如上文详述的，这些序列可用作评估由测试样品扩增的产物的标准(对照)。
[0063]在另一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或更多个扩增引物组(primer set),所述引物组对应于如下序列:
[0064](i) SEQ ID NO:13和14或者基本上相似的序列；
[0065](ii) SEQ IDNO: 13、14和15或者基本上相似的序列；
[0066](iii) SEQ ID NO:18和19或者基本上相似的序列；
[0067](iv) SEQ ID NO:20和21或者基本上相似的序列。
[0068]附图简述
[0069]图1:指示了甲基化位置的SEQ ID NO:1。
[0070]红色线:在10个结直肠癌标本中测量的甲基化比例 [0071]蓝色线:在10个正常结肠标本中测量的甲基化比例
[0072]图2:指示了甲基化位置的SEQ ID NO:2。
[0073]红色线:在10个结直肠癌标本中测量的甲基化比例
[0074]蓝色线:在10个正常结肠标本中测量的甲基化比例
[0075]图3描绘了 SEQ ID NO:1和2序列以及L0C100526820的染色体位置编号。
[0076]发明详述
[0077]本发明部分基于阐明表征大肠和乳腺赘生物的DNA甲基化状态来进行预测。该发现现已帮助开发了基于相对于对照水平L0C100526520DNA区域提高的甲基化来筛选大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向的常规方法。根据本发明，已确定该DNA区域受到调节，关于其甲基化水平的差异性改变的调节，取决于所讨论细胞是否是赘生性的。应理解，所讨论的DNA区域通过参照其名称及其染色体坐标二者在本文中进行了描述。就列出对应于DNA区域的染色体坐标来说，其与2009年2月推出的人基因组数据库Hg 19版本(本文称为“Hg 19坐标”)相一致。
[0078]因此，本发明的一个方面涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834097-163834982限定的DNA区域的甲基化状态，并且其中相对于对照水平，所述DNA区域较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0079]提及“大肠”应理解为提及来源于大肠的八个解剖学区域之一的细胞，所述区域开始于回肠的末端区域之后，这些区域是:
[0080]⑴盲肠；
[0081](ii)升结肠；
[0082](iii)横结肠；
[0083](iv)降结肠；
[0084](V)乙状结肠；
[0085](vi)直肠；
[0086](vii)脾曲；和[0087](viii)肝曲。
[0088]本发明不受限于任何一种理论或作用模式，哺乳动物乳腺是随年龄、月经周期和生殖状况变化的结构上动态的器官。其是表现出分泌腺泡的分枝状管泡状腺，所述分泌腺泡通过内小叶分组并流入小叶内导管中，进而流入小叶间导管中。小叶组织成15至20个叶，其各自注入隔开的输乳管道中并从那里注入输乳管中。小叶内基质由小叶上皮组分周围具有激素敏感性纤维母细胞区带的疏松结缔组织组成。这些被认为在形态发生和分化期间参与上皮/基底膜/基质诱导性相互作用。乳腺在个体的多个生命周期阶段期间经历独特的分化和增殖发育。因此，应理解，提及乳腺是提及包括其发育的任何阶段(青春期前、青春期、产前、产后/哺乳和绝经后阶段)中的乳腺的细胞。在这一点上，还应理解，任何给定的细胞群体仅可瞬时存在于乳腺中，例如为了有助于哺乳在妊娠期间生成的那些细胞群体。
[0089]提及“赘生物”应理解为提及包含赘生性细胞的病变、肿瘤或其他包封或未包封肿块或其他生长形式。“赘生性细胞”应理解为提及表现出异常生长的细胞。术语“生长”应以其最广意义理解并且包括提及增殖。在这一点上，异常细胞生长的一个实例是细胞的不受控增殖。另一个实例是细胞中的凋亡失败，从而延长了其通常的寿命。赘生性细胞可以是良性细胞或恶性细胞。在一个优选实施方案中，对象肿瘤是腺瘤或腺癌。本发明不受限于任何一种理论或作用模式，腺瘤一般是上皮起源的良性肿瘤，其来源于上皮组织或表现出清晰界定的上皮结构。这些结构可具有腺外观。在腺瘤中可包含恶性细胞群体，例如随着良性腺瘤或良性赘生性病变进展发生恶性腺癌。
[0090]优选地，所述赘生性细胞是腺瘤或腺癌，并且甚至更优选是结直肠或乳腺腺瘤或腺癌。 [0091]提及“DNA区域”应理解为提及基因组DNA的特定部分。参照一组染色体坐标来说明这些DNA区域，这些坐标是本领域技术人员所理解的。如上文所详述的，本文所述DNA区域的染色体坐标对应于基因组的Hgl9版本。一般来说，常规地可参照基因的染色体位置鉴定基因，通过染色体位置可常规地得到其序列。还应理解，提及DNA区域Chr6:163834097-163834982与在本文中提及名称L0C100526820是可互换的。SEQ ID NO:17中提供了该基因座的886个核苷酸反向链序列。
[0092]本文中公开了落入该基因座的另一些DNA区域。这些DNA区域如下:
[0093](i)Chr6:163834295-163834500，其核苷酸序列为:
[0094]atctgtaaaa atgttgactt ctgcttttca gactacgcgc acagcctctt tatttcctactgcggcttca ttccctcacg gaacactgac gccatcgcga aggaagcatt tcgagcacga ctgacgctccccttattatt tgctaagccg ctgcgctcgg gtctggctac gatttgcttt cagaataacg ggaaggtgcaacaaga(SEQ ID NO:1)；
[0095](ii)Chr6:163834621-163834906，其核苷酸序列为:
[0096]gccgtgctgc tttccagcct ctcagcaaat cacgaacacc gaaagaagcc acggcggcgacgggaggggc gtcgcgcgtg cttccctcgg cgacaaagcg ggagccgggc gcgccggccg agggcgcccggcgcagagtc ccgcagaggc ggacgccgcg gcacgcgcct cgaaaagcct caaactctta tcctcggctctcccgcccca cctccgcccc gcagccaaga cccgcgccgt ggcgggcccg acggccaagg aaagcccaccagccctccgc accgtg(SEQ ID NO:2)；[0097](iii)Chr6:163834393-163834455，其核苷酸序列为:
[0098]gaaggaagcatttcgagcacgactgacgctccccttattatttgctaagccgctgcgctcggg(SEQ IDNO:3)；
[0099](iv)Chr6:163834393-163834519，其核苷酸序列为:
[0100]gaaggaagcatttcgagcacgactgacgctccccttattatttgctaagccgctgcgctcgggtctggctacgatttgctttcagaataacgggaaggtgcaacaagatcgcttccctagaggcgcg(SEQ ID NO:4).[0101]SEQIDN0:1和2表示L0C100526820基因座中的两个不同区域。SEQ ID NO:3和4表示SEQ ID NO:1中的两个区域，并且SEQ ID NO:3区域实际上落入较长的SEQ ID NO:4区域。下文中更详细地讨论了所有的这些区域。
[0102]提及每一个以上详述的DNA区域，应理解为提及分子的所有形式及其片段或变体。如本领域技术人员所理解的，已知一些DNA区域在个体之间表现出等位基因变异或单核苷酸多态性。SNP包括不同大小的简单序列重复(例如二核苷酸和三核苷酸重复)的插入和缺失。变体包括来自相同区域的享有至少90%、95%、98%、99%序列同一性(即相对于本文所述DNA区域具有一个或更多个缺失、添加、替换、逆序序列等)的核酸序列。因此，应理解，本发明延伸至这样的变体，尽管事实上在个体之间可存在真实核酸序列之间很小的遗传变异，其在目前的诊断应用方面也实现相同结果。因此，应理解本发明延伸至由任意其他突变、多态性变异或等位基因变异产生的DNA的所有形式。
[0103]应理解，是测试对象的“个体”可以为任意人或非人哺乳动物。非人哺乳动物的实例包括灵长类、家畜动物(如马、牛、绵羊、猪、驴)、实验室测试动物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、宠物(如狗、猫)和俘获的野生动物(如鹿、狐狸)。优选地，哺乳动物是人。
[0104]根据该实施方案，提供了一种在人中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834097-163834982限定的DNA区域的甲基化状态，其中相对于对照水平，所述DNA区域较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0105]本发明不受限于任何一种理论或作用模式，虽然测量L0C100526820的甲基化水平可诊断大肠肿瘤或乳腺病症，但是已确定L0C100526820中的两个不同区域在这一点上是特别有用的，因为这些区域包含在大肠和乳腺赘生物(例如结直肠癌)中频繁高甲基化的高密度CpG 二核苷酸。
[0106]因此，本发明的一个实施方案涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域选自由Hgl9坐标Chr6: 163834295-163834500或Chr6:163834621-163834906限定的区域之一或二者，其中这些DNA区域之一或二者较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0107]在又一个实施方案中，作为分析对象的DNA区域是落入SEQ ID N0:1区域的 Chr6: 163834393-163834519 (SEQ ID NO:4)或者落入 SEQ ID NO:4 区域的 Chr6:163834393-163834455 (SEQ ID NO:3)。在一个特定的实施方案中，已开发了基于PCR的测定并且适用于这两种更小的DNA区域的情况中。下文中更详细地讨论了这些。
[0108] 根据该实施方案，提供了一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域选自由 Hgl9 坐标 Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的区域之一或二者，其中这些DNA区域之一或二者较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0109]在另一个实施方案中，所述赘生性细胞是腺瘤或腺癌，并且甚至更优选是结直肠或乳腺腺瘤或腺癌。
[0110]本发明不受限于任何一种理论或作用模式，DNA甲基化在细菌、植物和动物中是普遍的。DNA甲基化是DNA的化学修饰类型，其在细胞分裂循环中是稳定的，但是不涉及生物体基本DNA序列的改变。染色质和DNA修饰是表观遗传学的两个重要特征并且在细胞分化过程中发挥作用，允许细胞稳定维持不同的特征(尽管包含相同的基因组物质)。在真核生物体中，DNA甲基化仅发生在胞嘧啶嘧啶环的5号碳上。在哺乳动物中，DNA甲基化大多数发生在CpG 二核苷酸的胞嘧啶的5号碳上。CpG 二核苷酸构成约I %的人基因组。
[0111]所有CpG的70%至80%是甲基化的。CpG可集中成簇，称为“CpG岛”，其存在于多种基因的5’调节区中并且经常是非甲基化的。在许多疾病过程(如癌症)中，基因启动子和/或CpG岛获得异常高甲基化，这与遗传性转录沉默有关。DNA甲基化可通过两种方式影响基因的转录。首先，DNA甲基化可自身物理地阻碍转录蛋白质与基因结合，从而阻断转录。第二，甲基化DNA可与称为甲基CpG结合域蛋白(Methyl-CpG-binding domain protein,MBD)的蛋白质结合。然后，MBD蛋白将另外的蛋白质募集至基因座，例如组蛋白脱乙酰酶和可修饰组蛋白的其他染色质重构蛋白，从而形成紧凑的失活染色质，称为沉默染色质。DNA甲基化与染色质结构之间的这种联系是非常重要的。特别地，甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)与Rett综合征有关并且甲基CpG结合域蛋白2(MBD2)介导癌症中高甲基化基因的转录沉默。
[0112]在人中，DNA甲基化过程通过三种酶进行——DNA甲基转移酶l、3a和3b(DNMTl、DNMT3a、DNMT3b)。认为DNMT3a和DNMT3b是从头甲基转移酶，其在发育早期建立DNA甲基化模式。DNMTl是建议的维持甲基转移酶，其负责在DNA复制期间将DNA甲基化模式拷贝至子链。DNMT3L是与其他DNMT3同源但是没有催化活性的蛋白质。相反地，DNMT3L通过提高其结合DNA的能力并刺激其活性以有助于从头甲基转移酶。最后，DNMT2已被鉴定为“神秘的”DNA甲基转移酶同源物，其包含所有DNA甲基转移酶共有的所有10种序列模体；但是，DNMT2不能使DNA甲基化，而是表现为使小RNA甲基化。
[0113]因此，“甲基化状态”应理解为提及DNA区域中一个特定核苷酸或多个核苷酸中甲基化的存在、不存在和/或量。特定DNA序列(例如，本文所述的DNA区域)的甲基化状态可指示序列中每个碱基的甲基化状态，或者可指示序列中碱基对(例如，胞嘧啶)子集的甲基化状态或者一个或更多个特异性限制酶识别序列的甲基化状态，或者可指示关于序列中局部甲基化密度的信息而不提供序列中甲基化发生位置的精确信息。甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示。例如，可通过对在用甲基化依赖性限制酶进行限制消化后存在的完整DNA的量进行定量来产生甲基化值。在该实例中，如果使用定量PCR定量DNA中的特定序列，则约等于模拟处理对照的模板DNA量指示序列不是高度甲基化的，而远小于模拟处理样品中发生的模板量指示序列中甲基化DNA的存在。因此，值(即，甲基化值)，例如来自上述实例的值，代表甲基化状态，并由此可用作甲基化状态的定量指标。当期望对样品中序列的甲基化状态与阈值进行比较时，这是特别有用的。[0114]本发明的方法基于比较生物样品特定DNA区域的甲基化水平与这些DNA区域的对照甲基化水平。“对照水平”是“正常水平”，其是对应的非赘生性大肠或乳腺细胞或者非赘生性细胞群体或者另一种可分离DNA用于测定的生物样品(例如血浆)中DNA区域的甲基化水平。
[0115]可使用来源于作为测试对象的相同个体的非赘生性组织来测定正常(或“非赘生性”)甲基化水平。但是，应理解，这对于所涉及个体的侵入性相当大，因此可能更便于相对于标准结果分析测试结果，所述标准结果反映出得自于除所讨论患者之外的个体的个体结果或总体结果。事实上，这后一种分析形式是分析的优选方法，因为其使得能够设计需要收集和分析单一生物样品(目的测试样品)的试剂盒。提供正常甲基化水平的标准结果可通过本领域技术人员公知的任意合适的方法来计算。例如，可根据本发明基因的甲基化水平来评估正常组织的群体，从而提供分析所有将来的测试样品的标准值或值范围。还应理解，正常水平可由特定群体的对象确定，并且用于来源于所述群体的测试样品。因此，可确定对应于在诸如年龄、性别、种族或健康状态的特征方面不同的群体的标准值或范围的数值。所述“正常水平”可以是离散水平或水平的范围。相对于正常水平，对象基因的甲基化水平提高指示组织是赘生性的。
[0116]术语“甲基化”应视为意指存在通过DNA甲基转移酶作用添加至核酸(例如基因组DNA)区域中的一个或多个胞嘧啶碱基的甲基。如本文所述，本领域技术人员已知用于确定核酸甲基化的水平或程度的多种方法。
[0117]“较高的水平”意指与对照样品相比，所诊断对象中甲基化CpG 二核苷酸的较高数目，即，在特定CpG位点处甲基化的DNA分子的比例较高或者在所述对象中具有较高数目的不同的甲基化CpG位点。应理解，术语“增强的”和“提高的”可与术语“较高的”可互换使用。本发明不受限于认为在对象中诊断为赘生物的甲基化残基的精确数目，原因是患者对象之间会发生一些变化。 本发明还不受限于甲基化残基的定位。然而，已鉴定了在大肠赘生物(特别是腺瘤和良性赘生性病变)情况下经历高甲基化的特定胞嘧啶残基的数目。这些胞嘧啶残基定位至由SEQ ID NO:1和2限定的L0C100526820区域。因此，在一个实施方案中，可采用这样的筛选方法，其具体涉及评估这些残基的一个或更多个或者相反链上第n+1位处对应的胞嘧啶的甲基化状态。
[0118]根据该实施方案，提供了一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估一个或更多个选自以下的胞嘧啶残基或相反DNA链上第n+1位处对应的胞嘧啶的甲基化状态:
[0119]Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
[0120]Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
[0121]Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
[0122]Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
[0123]Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
[0124]Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
[0125]Chr6:163834675 Chr6:163834678 Chr6:163834681
[0126]Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
[0127]Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855[0128]Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
[0129]Chr6:163834872
[0130]其中相对于对照样品中对应残基的甲基化水平，一个或更多个所述残基较高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0131 ] 参照图3描绘的SEQ ID NO:1和2序列对这些染色体6位置进行编号。
[0132]本发明不受限于任何一种理论或作用模式，赘生物的形成既涉及基因变化(点突变、缺失、基因扩增或排列)，也涉及一系列表观遗传变化，包括特异性基因座位上的DNA甲基化和改变的组蛋白修饰。这些变化中最普遍的特征是CpG岛基因启动子的高甲基化。如更早之前详述的，这样的高甲基化通常与基因表达沉默有关。在许多情况下，认为这种甲基化相关基因沉默在赘生物形成中发挥着重要作用，例如通过使肿瘤抑制基因(如pl6或Rb)或DNA修复基因(如MLHl或MGMT)沉默来发挥作用。
[0133]用于分析DNA甲基化的全基因组技术被越来越多地用于鉴定不同细胞类型或疾病状态(包括癌症)中DNA甲基化的变化，并且不同的生物化学和信息途径被用于鉴定DNA甲基化变化的交叠集(Robinson等Epigenomics2:587-98 (2010))。在本发明的情况下，亚硫酸氢盐标记技术用于产生DNA的分开的甲基化和非甲基化级分，其基础是其在MspI (CCGG)或TagI (TCGA)限制酶位点中的CpG位点处的甲基化状态。
[0134]可对任意合适的生物样品执行本发明的检测方法。为此，提及“生物样品”应理解为提及来源于动物的生物材料的任意样品，例如但不限于细胞材料、生物流体(如血液)、粪便、组织活检标本、外科手术标本或引入动物体内并随后移除的流体(例如，从灌肠洗液中重新获得的溶液)。根 据本发明方法测试的生物样品可直接测试或者可能在测试之前需要一些形式的处理。例如，活检或外科手术样品可能在测试之前需要均化，或者其可能需要切片以原位测试各个基因的定性表达水平。或者，细胞样品可能在测试之前需要透化。此外，就生物样品不是液体形式(如果需要测试这样的形式)来说，其可能需要添加试剂(例如缓冲剂)以使样品流通。
[0135]就生物样品中存在目的DNA区域来说，可直接测试生物样品，否则可在测试之前分离生物样品中存在的全部或一些核酸。在另一个实例中，可在分析之前将样品部分纯化或富集。例如，就生物样品包含各种各样的细胞群体来说，可期望富集特定目的的亚群体。在测试之前处理靶细胞群体或从其来源的分子(例如，使肝病毒失活)在本发明的范围中。还应理解，可新鲜收获生物样品，或者可在测试之前将其存储(例如冷冻)或者在测试之前对其进行处理(例如，通过进行培养)。
[0136]选择最适合于根据本文所述方法进行测试的样品类型将取决于情况的性质。优选地，所述样品是粪便(粪)样品、灌肠洗液、外科手术切除、组织活检或血液样品(例如，全血、血清或血衆)。
[0137]更优选地，所述生物样品是血液样品、活检样品或粪便样品。
[0138]如上文中详述的，本发明被设计成筛选位于大肠或乳腺中的赘生性细胞或细胞群体。因此，提及“细胞或细胞群体”应理解为提及单个细胞或细胞的组。所述细胞的组可以是细胞的扩散群体、细胞悬液、细胞的包封群体或表现为组织形式的细胞群体。
[0139]提及赘生物(如腺瘤或腺癌)的“发生”，应理解为提及表现出异型增生的个体的一个或更多个细胞。在这一点上，腺瘤或腺癌可发育良好，因为形成了发育异常细胞块。或者，腺瘤或腺癌可处于极早期，因为在诊断时仅发生了相对很少的异常细胞分裂。本发明还延伸至评估个体形成赘生物(如腺瘤或腺癌)的倾向。本发明不受限于任何方式，改变的甲基化水平可指示个体发生赘生物(例如，进一步发生腺瘤或腺癌或者另一种腺瘤或腺癌)的倾向。
[0140]虽然优选方法是评估甲基化水平用于诊断赘生物形成或其倾向，但是在某些情况下可期望检测到所述甲基化水平的逆向变化，例如，以监测涉及调节赘生物病症(如腺瘤或腺癌发生)的治疗性或预防性治疗的有效性。例如，甲基化水平提高指示个体患有以腺瘤或腺癌发生为特征的病症，在治疗性治疗方案开始之后筛选甲基化水平的降低可用于指示赘生性细胞的成功清除。在另一个实例中，可使用该方法来测试肿瘤切除边缘中的组织，以确定是否移除了肿瘤的全部边 缘。
[0141]因此，本方法可用于疾病风险的诊断、预后、分类、预测，疾病复发的检测以及多种赘生物类型的治疗选择。可检测到任意进展分期中的癌症，例如，原发癌、转移癌和复发癌。
[0142]本发明提供了这样的方法，其用于确定哺乳动物(例如，人)是否具有大肠或乳腺赘生物，提取自哺乳动物的生物样品是否包含赘生性细胞或来源于赘生性细胞的DNA，估计哺乳动物发生赘生物的风险或可能性，监测抗癌治疗的效力，或者为患癌症的哺乳动物选择适当的抗癌治疗。这样的方法基于确定赘生性细胞在本文所述DNA区域中具有不同于正常细胞的甲基化状态。因此，通过确定细胞在本文所述DNA区域中是否包含差异性甲基化的序列，可确定细胞是否是赘生性的。
[0143]本发明的方法可用于评价已知具有或怀疑具有赘生物的个体或者用作常规临床测试，即，在不一定怀疑具有赘生物的个体中。可进行另外的诊断测定以确定个体中赘生物的状态并且确定赘生物的类型。例如，如果血液测试结果指示存在赘生物，则可必需进行另外的筛选以确定赘生物的起源是乳腺还是大肠。
[0144]此外，本发明方法可用于评估治疗过程的效力。例如，可通过在患癌症的哺乳动物中随时间监测本文所述序列的DNA甲基化来评估抗癌治疗的效力。例如，与在治疗前或在治疗早期提取自哺乳动物的样品中的水平相比，在治疗后提取自哺乳动物的生物样品中本发明诊断序列中任意一种的甲基化降低或缺少，指示有效的治疗。
[0145]因此，本发明方法可用作一次性测试，或者用作认为具有赘生物风险的那些个体的监测手段(monitor)，或者用作涉及抑制或以其他方式减慢赘生物发生的治疗性或预防性治疗方案有效性的监测手段。在这些情况下，绘制任何一种或更多种类别生物样品中甲基化水平的调节是个体状态或者目前使用的治疗性或预防性方案有效性的有价值的指标。因此，应理解本发明方法延伸至相对于甲基化正常水平(如前文定义)或者相对于由个体的生物样品确定的一个或更多个早期甲基化水平，监测所述个体中甲基化水平的提高或降低。
[0146]用于检测赘生物的方法可包括检测一种或更多种其他的癌症相关多核苷酸或多肽序列。因此，通过本发明方法检测甲基化可单独使用或与用于赘生物诊断或预后的其他筛选方法组合使用。
[0147]用于检测DNA甲基化的任何方法都可用于本发明的方法。多种方法可用于检测原始组织样品中或患者样品(如血液、尿、粪便或唾液)中特异性基因座处差异性甲基化的DNA (综述于 Kristensen 和 Hansen, Clin Chem.55: 1471-83, 2009 ；Ammerpohl 等.BiochimBiophys Acta.1790:847-62,2009 ；Shames 等.Cancer Lett.251: 187-98,2007 ；Clark等.Nat Protoc.1:2353-64, 2006中)。为了分析靶基因中DNA甲基化的比例或程度，通常用亚硫酸氢钠处理DNA并使用将独立扩增甲基化状态DNA的引物和PCR条件扩增目的区域。然后可通过测序(包括焦磷酸测序、限制酶消化(COBR))或通过解链曲线分析来评估总体扩增子或各个CpG位点的甲基化。或者，可使用用于在特定CpG位点上分析甲基化的基于连接的方法。检测由肿瘤释放到体液中的异常甲基化DNA发展为癌症诊断的手段。本文中，在高甲基化序列的情况下，必需使用允许从非甲基化的正常细胞DNA背景中选择性扩增甲基化DNA序列的敏感方法。基于经亚硫酸氢盐处理的DNA的这些方法包括例如，甲基化选择性PCR(MSP) ,Heavymethyl PCRoHeadloop PCR和 Helper 依赖性链反应(PCT/AU2008/001475)。
[0148]简言之，在一些实施方案中，用于检测甲基化的方法包括随机剪切或随机片段化基因组DNA，用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶切割DNA随后选择性鉴定和/或分析切割的DNA和未切割的DNA。选择性鉴定可包括例如分离切割的DNA与未切割的DNA (例如，通过大小)以及定量被切割或未被切割的目的序列。参见，例如美国专利N0.7，186,512。或者，所述方法可包括在限制酶消化之后扩增完整DNA，从而仅扩增在扩增区域中未被限制酶切割的DNA。参见例如美国专利申请序列号10/971，986、11/071，013和10/971,339。在一些实施方案中，可使用基因特异性的引物进行扩增。或者，可将适配体添加到随机片段化DNA的末端中，可用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶消化所述DNA。可使用与适配体序列杂交的引物扩增完整的DNA。在这种情况下，可进行第二步以确定DNA扩增合并物中特异性基因的存在、不存在或量。在一些实施方案中，使用实时定量PCR扩增DNA。
[0149]在一些实施方案中，所述方法包括在基因组DNA群体中定量靶序列的平均甲基化密度。在一些实施方案中，所述方法包括在允许基因座中潜在限制酶切割位点的至少一些拷贝保持不被切割的条件下，使基因组DNA与甲基化依赖性限制酶或甲基化敏感性限制酶相接触；定量基因座的完整拷贝；以及比较扩增产物的量与表示对照DNA甲基化量的对照值，从而与对照DNA的甲基化密度相比定量基因座中的平均甲基化密度。
[0150]可通过以下方法来测定DNA基因座甲基化的量:提供包含所述基因座的基因组DNA的样品，用限制酶(其是甲基化敏感性或甲基化依赖性的)切割DNA，然后定量完整DNA的量或在目的DNA基因座处切割DNA的量。完整或切割DNA的量取决于包含所述基因座的基因组DNA的初始量，所述基因座中甲基化的量，以及所述基因座中基因组DNA中甲基化的核苷酸的数目(即，分数)。可通过比较完整DNA或切割DNA的量与表示相似处理DNA样品中完整DNA或切割DNA的量的对照值来确定DNA基因座中甲基化的量。对照值可表示甲基化核苷酸的已知或预测数目。或者，对照值可表示另一个细胞(例如，正常、非患病)细胞中的相同基因座或第二基因座的完整或切割DNA的量。
[0151]通过在允许基因座中潜在限制酶切割位点的至少一些拷贝保持不被切割的条件下使用至少一种甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶，并随后定量剩余的完整拷贝并比较该量与对照，可确定基因座的平均甲基化密度。甲基化敏感性酶是如果其识别位点是非甲基化的则切割DNA的酶，而甲基化依赖性酶如果其识别位点是甲基化的则切割DNA。如果在允许基因座中潜在限制酶切割位点的至少一些拷贝保持不被切割的条件下，使甲基化敏感性限制酶与DNA基因座拷贝相接触，则剩余的完整DNA将与甲基化密度成正比，并因此可与对照比较以确定样品中基因座的相对甲基化密度。相似地，如果在允许基因座中潜在限制酶切割位点的至少一些拷贝保持不被切割的条件下，使甲基化依赖性限制酶与DNA基因座拷贝相接触，则剩余的完整DNA将与甲基化密度成反比，并因此可与对照比较以确定样品中基因座的相对甲基化密度。例如，美国专利申请序列号10/971，986中公开了这样的测定。
[0152]用于以上方法的试剂盒可包含例如一种或更多种甲基化依赖性限制酶、甲基化敏感性限制酶、扩增(例如，PCR)试剂、探针和/或引物。
[0153]定量扩增方法(例如，定量PCR或定量线性扩增)可用于在限制酶消化后定量扩增侧翼是扩增引物的基因座中完整DNA的量。例如美国专利N0.6，180，349,6, 033，854和 5，972, 602 中，以及例如 Gibson 等，Genome Research6:995-1001 (1996) ；DeGraves,等，Biotechniques34(I):106-10,112-5(2003) ;Deiman B,等，Mol.Biotechnol.20(2):163-79(2002)中公开了定量扩增的方法。可“实时”监测扩增。
[0154]用于检测DNA甲基化的另外的方法可包括在用亚硫酸氢盐处理DNA之前和之后进行基因组测序。参见例如 Frommer 等，Proc.Nat 1.Acad.Sc1.USA89:1827-1831 (1992)。当使亚硫酸氢钠与DNA接触时，非甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶未被修饰。
[0155]在一些实施方案中，使用由亚硫酸氢盐转化DNA扩增的PCR产物的限制酶消化来检测 DNA 甲基化。参见例如 SadriMtornsby，Nucl.Acids Res.24:5058-5059(1996)；Xiong&Laird, Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)。
[0156]在一些实施方案 中，甲基化特异性PCR( “MSP”)反应单独或与其他方法组合用于检测DNA甲基化。MSP测定通过亚硫酸氢钠对DNA进行最初修饰，将所有非甲基化而没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且随后用相对于非甲基化DNA特异于甲基化DNA的引物进行扩增。参见，Herman 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826，(1996);美国专利N0.5，786，146。
[0157]在一些实施方案中，MethyLight测定单独或与其他方法组合用于检测DNA甲基化(参见 Eads 等，Cancer Res.59:2302-2306(1999))。简言之，在 MethyLight 过程中，在亚硫酸氢钠反应中使基因组DNA转化(亚硫酸氢盐方法将非甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶)。然后使用与CpG 二核苷酸杂交的PCR引物进行目的DNA序列的扩增。通过使用仅与由甲基化DNA亚硫酸氢盐转化产生的序列杂交(或者仅与非甲基化序列杂交)的引物，扩增可指示其中引物杂交的序列的甲基化状态。此外，可用与由甲基化(或非甲基化)DNA亚硫酸氢盐处理产生的序列特异性结合的探针来检测扩增产物。如果需要的话，可使用引物和探针二者来检测甲基化状态。因此，用于MethyLight的试剂盒可包含亚硫酸氢钠，以及区分已用亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA与非甲基化DNA的引物或可检测标记的探针(包括但不限于Taqman或分子信标探针(molecular beacon probe))。另一些试剂盒组分可包括例如DNA扩张所必需的试剂，包括但不限于PCR缓冲液、脱氧核苷酸、以及热稳定的聚合酶。
[0158]在一些实施方案中，Ms-SnuPE(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)反应单独或与其他方法组合用于检测DNA甲基化(参见，Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res.25:2529-2531 (1997))。Ms-SnuPE技术是用于评估特定CpG位点上甲基化差异的定量方法，其基础是对DNA进行亚硫酸氢盐处理,然后进行单核苷酸引物延伸(Gonzalgo & Jones,见上)。简言之，使基因组DNA与亚硫酸氢钠反应以将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,而不改变5-甲基胞嘧啶。然后使用特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR引物进行期望靶序列的扩增，分离所得产物并将其用作在目的CpG位点上进行甲基化分析的模板。
[0159]用于Ms-SnuPE分析的典型试剂(例如，如可在典型的基于Ms-SnuPE的试剂盒中发现的)可包括但不限于:用于特异性基因(或经甲基化改变的DNA序列或CpG岛)的PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸、凝胶提取试剂盒、阳性对照引物、用于特异性基因的Ms-SNuPE?引物、反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应的反应缓冲液)、以及带可检测标记的核苷酸。另外，亚硫酸氢盐转变试剂可包括=DNA变性缓冲液、磺化缓冲液、DNA回收试剂或试剂盒(例如,沉淀、超滤、亲和柱)、去磺化缓冲液、和DNA回收组分。
[0160]另外的甲基化检测方法包括但不限于甲基化CpG岛扩增(参见，Toyota等，Cancer Res.59:2307-12 (1999))，例如美国专利申请 2005/0069879 ；Rein 等.NucleicAcids Res.26(10):2255-64(1998) ;01ek 等 Nat.Genet.17 (3):275-6(1997);以及 PCT 公开W000/70090中描述的那些，Headloop PCT和Helper依赖性链反应。
[0161]以下提供了关于这些一般描述方法中的几种的更详细信息:
[0162](a)探针或引物设计和/或产生
[0163]本文所述的用于诊断赘生物的几种方法使用一种或更多种探针和/或引物。本领域已知并且例如在Dieffenbach and Dveksler (编)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)中描述了用于设计用于例如PCR或杂交的探针和/或引物 的方法。此外，多种软件包是公开可用于设计用于多种测定的最佳探针和/或引物，例如，可得自于 Center for Genome Research, Cambridge, Mass.，USA 的 Primer3。
[0164]清楚地，应在探针或引物设计期间考虑其潜在用途。例如，如果要产生用于在甲基化特异性PCR或连接酶链反应(LCR)测定的探针或引物，则3’末端(或在LCR情况下的5’末端)的核苷酸应优选对应于核酸中的甲基化核苷酸。
[0165]对可用于检测与赘生物相关的序列的探针和/或引物进行评估，例如以确定不形成发夹，自引发(self-prime)或形成引物二聚体(例如，与用于检测测定的另一种探针或引物形成引物二聚体)的那些。此外，常常评估探针或引物(或者其序列)以确定其由靶核酸中变性的温度(即，探针或引物的解链温度，或Tm)。用于估计Tm的方法在本领域中是已知的并且描述于例如 Santa Lucia，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 95:1460-1465,1995或Breslauer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:3746-3750,1986。
[0166]用于产生/合成本发明探针或引物的方法在本领域中是已知的。例如，Gait (编)(In:01igonucleotide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984)中描述了寡核苷酸合成。例如，可通过生物合成(例如，通过用限制性内切核酸酶消化核酸)或通过化学合成获得探针或引物。对于短序列(多至约100个核苷酸)，化学合成是优选的。
[0167]对于较长序列，可使用分子生物学所采用的标准复制方法，例如，如Messing，Methods Enzymol，101，20-78，1983所述使用用于单链DNA的M13。用于寡核苷酸合成的另一些方法包括例如磷酸三酯和磷酸二酯法(Narang等.Meth.Enzymol68:90,1979),在支持物上合成(Beaucage 等.Tetrahedron Letters22: 1859-1862,1981),以及氨基憐酸酯技术(Caruthers, M.H.等，“Methods in Enzymology, ” 第 154 卷，第 287-314 页(1988)),以及“Synthesis and Applications of DNA and RNA,，’S.A.Narang编，Academic Press,New York,1987和本文所列参考文献中描述的其他方法。如例如Nielsen等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.，1:3423,1997 ；Singh and Wengel, Chem.Commun.1247,1998 所述合成包含锁定核酸(locked nucleic acid, LNA)的探针。并且，如例如 Egholm 等，Am.Chem.Soc.,114:1895,1992 ；Egholm 等，Nature, 365:566，1993 和 Orum 等，Nucl.Acids Res.，21:5332，1993 所述合成包含肽核酸(peptide-nucleic acid, PNA)的探针。
[0168](b)DNA的甲基化敏感性内切核酸酶消化
[0169]在一个实例中，使用包括以下步骤的方法测定样品中提高的甲基化:在足以使核酸被消化的条件下用一定量的甲基化敏感性限制性内切核酸酶处理核酸，然后检测所产生的片段。示例性甲基化敏感性内切核酸酶包括例如HhaI或Hpall。优选地，测定包括用与所采用的甲基化敏感性酶具有相同特异性的甲基化不敏感酶消化的内对照。例如，甲基化不敏感酶MspI是甲基化敏感性酶HpaII的同裂酶。
[0170]杂交测定方式
[0171 ] 在一个实例中，通过使探针或引物与未经消化的核酸选择性杂交来检测核酸的消化。或者，使探针与经消化或未经消化的核酸二者均选择性杂交但是有助于区分两种形式，例如通过电泳区分。用于实现与杂交探针选择性杂交的合适检测方法包括例如，Southern或其他核酸杂交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14, 7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，CancerRes.57,594-599, 1997)。
[0172]基于包含探针的核酸双链体的解链温度(Tm)确定合适的杂交条件。本领域技术人员知道应根据经验为每种探针确定最佳的杂交反应反应，但是也可使用一些总则。优选地，在低或中等严格度下进行采用短寡核苷酸探针的杂交。在富含GC的探针或引物或者较长探针或引物的情况下，高严格度杂交和/或洗涤是优选的。高严格度在本文中定义为，在约ο.1倍SSC缓冲液和/或约0.1 % (w/v) SDS或较低盐浓度下，和/或在至少65°C的温度下，或者等价条件下进行杂交和/或洗涤。本文提及特定的严格水平包括使用除本领域技术人员已知的SSC之外的洗涤/杂交溶液的等价条件。
[0173]根据本实例，测试样品和阴性对照样品所产生片段的差异指示对象具有赘生物。相似地，在其中对照样品包含来自肿瘤、癌组织或癌细胞或癌前期细胞的数据的情况下，测试样品与对照样品之间的相似性(尽管未必是绝对同一性)指示阳性诊断(即，癌症)。
[0174]扩增测定方式
[0175]在一个替代实例中，使用扩增系统检测通过限制酶产生的片段，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、反向聚合酶链反应(iPCR)、原位PCR(Singer-Sam等，Nucl.Acids Res.18:687，1990)、链置换扩增(SDA)或环状探针技术。
[0176] PCR的方法在本领域中是已知的，并且例如通过McPherson等，PCR:A PracticalApproach, (series eds, D.Rickwood and B.D.Hames), IRL Press Limited, Oxford, ppl-253,1991 和 Dieffenbach (编)and Dveksler (编)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratories,NY, 1995)进行了描述，其内容各自通过引用整体并入本文。一般来说，对于PCR，使两种非互补核酸引物分子(包含长度至少约18个核苷酸，并且更优选长度为至少20至30个核苷酸)与核酸模板分子在其各自的退火位点上杂交，并且通过酶扩增介入退火位点的模板的特异性核酸分子拷贝。可例如使用电泳和用结合核酸的可检测标志物进行检测来检测扩增产物。或者，用可检测标志物(例如，荧光团)标记一种或更多种寡核苷酸，并且使用例如 lightcycler (Perkin Elmer, Wellesley, Mass.，USA ；RocheApplied Science, Indianapolis, IN, USA)检测扩增产物。[0177]链置换扩增(stranddisplacement amplification, SDA)使用寡核苷酸引物、DNA聚合酶和限制性内切核酸酶来扩增靶序列。使寡核苷酸与靶核酸杂交并使用聚合酶来产生介入引物退火位点的区域的拷贝。然后用在所拷贝核酸开始处特异性识别序列的内切核酸酶使所拷贝核酸和靶核酸的双链体产生切口。DNA聚合酶识别切口的DNA并产生靶区域的另一份拷贝，同时置换先前生成的核酸。SDA的优点在于其以等温方式发生，从而有助于高通量自动化分析。
[0178]循环探针技术使用包含能够与靶序列杂交的DNA-RNA-DNA的嵌合合成引物。在与靶序列杂交后，所形成的RNA-DNA双链体是RnaseH的靶标，从而切割引物。然后例如使用质谱或电泳检测所切割的引物。
[0179]对于甲基化敏感性内切核酸酶识别位点侧翼或邻近其的引物，优选这样的引物仅位于赘生物中高甲基化的那些位点侧翼，以确保产生诊断扩增产物。在这一点上，仅当限制性位点未被切割时(即，当其是甲基化的时)产生扩增产物。因此，检测扩增产物指示目的CpG 二核苷酸是甲基化的。
[0180]如本领域技术人员所已知的，扩增产物的精确长度根据引物之间的距离而不同。清楚地，该分析形式可用于确定多个CpG 二核苷酸的甲基化状态，前提是每个二核苷酸都在甲基化敏感的限制性内切核酸酶位点中。在这些方法中，一种或更多种引物可标记有可检测标志物以有助于快速检测扩增核酸，例如荧光标记(例如，Cy5或Cy3)或放射同位素(例如，32P)。
[0181]一般使用例如非变性琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、液相色谱(例如，HPLC或dHPLC)或毛细管电泳(例如，MALD1-T0F)来分析扩增引物。对于本文所述的所有测定方 式，高通量检测方法，例如基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALD1-T0F)、电喷雾离子化(ESI)、质谱(包括串联质谱，如LC MS/MS)、生物传感器技术、易消失的(evanscent)光学纤维技术或DNA芯片技术(例如W098/49557 ；W096/17958 ；Fodor等，Science767-773，1991 ;美国专利 N0.5，143，854 和美国专利 N0.5，837，832，其内容全部通过引用并入本文)是尤其优选的。或者，可使用如本文和/或例如美国专利N0.6，174，670中所述的解链曲线分析方法来连续地监测核酸的扩增。
[0182](C)其他测定方式
[0183]在一个替代实例中，通过进行包括以下步骤的方法来确定样品中提高的甲基化:在足以使核酸被消化的条件下用一定量的DNA酶I处理包含核酸的染色质，然后检测所产生的片段。该测定方式基于这样的理解:与非高甲基化DNA相比包含甲基化DNA(如高甲基化DNA)的染色质具有更紧凑的构造，因此其对DNA酶I的内切核酸酶消化更不敏感。
[0184]根据该方法，与非甲基化DNA相比甲基化DNA的DNA酶I消化产生了不同长度的DNA片段。例如，使用之前描述的测定检测这些不同的DNA片段。或者，使用基本上如例如Gregory 和 Feil Nucleic Acids Res.,27, e32i_e32iv，1999 所述的 PCR-SSCP 检测 DNA 片段。为了使PCR-SSCP适用于本发明，使用位于核酸中一个或更多个CpG 二核苷酸侧翼或包含它们的扩增引物来扩增经DNA酶I生成的片段，所述扩增引物在赘生物样品中对DNA酶I消化具有抗性但是在健康/正常对照或健康/正常测试样品中对DNA酶I消化没有抗性。在这种情况下，使用DNA酶I产生特异性核酸片段诊断赘生物，因为DNA没有被有效降解。相反地，通过DNA酶I作用使来自健康/正常对象样品的模板DNA降解，因此，扩增不能产生离散的扩增产物。PCR-SSCP的替代方法，例如PCR-dHPLC，在本领域中是已知的并且本发明将其考虑在内。
[0185](d)非甲基化DNA的选择性诱变
[0186]在一种替代方法中，使用包括以下步骤的方法确定样品中提高的甲基化:在足有诱导诱变的条件下用一定量使CpG 二核苷酸中的非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理核酸。
[0187]优选的化合物使胞嘧啶突变成尿嘧啶或胸苷，例如亚硫酸氢盐，如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾(Frommer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89,1827-1831,1992)。已知对 DNA 进行亚硫酸氢盐处理以区分甲基化胞嘧啶残基与非甲基化胞嘧啶残基，其通过使不受甲基化保护的胞嘧啶残基(包括不在CpG 二核苷酸内或者定位在CpG 二核苷酸内未经历甲基化的胞嘧啶残基)突变来实现。
[0188]基于序列的检测
[0189]在一个实例中，通过对突变DNA进行测序确定一个或更多个突变核苷酸的存在或者突变序列的数目。一种分析形式包括使用本文所述的扩增反应(如PCR)扩增突变核酸。然后直接对扩增产物进行测序，或者将其克隆并对所克隆产物进行测序。用于对DNA进行测序的方法在本领域中是已知的，并且包括例如双脱氧链末端终止法或马克萨姆-吉尔伯特(Maxam-Gilbert)法(参见，Sambrook 等,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第
2版，CSHP, New Yorkl989)或 Zyskind 等，Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad.Press,1988))。
[0190]因为用化合物例 如亚硫酸氢盐处理核酸导致了非甲基化胞嘧啶被突变为尿嘧啶(从而在扩增过程之后突变为胸苷)，所以对序列进行分析确定了甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，通过对对照样品或未经亚硫酸氢盐处理的样品或目的区域的已知核苷酸序列与处理样品进行比较，有助于检测核苷酸序列之间的差异。与对照或未处理样品相比，处理样品中胞嘧啶位点上检测到的任意胸腺嘧啶残基可认为是由因亚硫酸氢盐处理引起的突变造成。例如，Frommer 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1827-1831,1992or Clark 等，Nucl.Acids Res.22 =2990-2997,1994中描述了使用对经亚硫酸氢盐处理的核酸进行测序来检测甲基化的方法。
[0191]在另一种方法中，使用焦磷酸测序(例如，如Uhlmann等，Electrophoresis, 23:4072-4079，2002所述)检测经亚硫酸氢盐处理的样品中突变或未突变核苷酸的存在。基本上，该方法是实时测序的形式，其使用与邻近或接近甲基化胞嘧啶位点的位点杂交的引物。在使引物与模板杂交之后，在DNA聚合酶存在下，根据预定分配顺序单独添加四种修饰脱氧核苷酸三磷酸的每一种。仅合并了所添加的与经亚硫酸氢盐处理的样品互补的核苷酸并且释放无机焦磷酸盐(PPi)。然后PPi驱动反应，导致产生可检测的光水平。这样的方法允许测定邻近引物杂交位点的特异性核苷酸的同一性。
[0192]固相焦磷酸测序的方法在本领域中是已知的并且例如在Landegren等，GenomeRes.,8(8):769-776,1998中进行了综述。这样的方法使得能够进行多个CpG 二核苷酸的甲基化检测。
[0193]用于确定经亚硫酸氢盐处理的核苷酸的序列的一种相关方法是甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Me-SnuPE)或 SnaPmeth。例如，Gonzalgo 和 Jones Nucl.Acids Res.,25:2529-2531 或 Uhlmann 等，Electrophoresis，23:4072-4079,2002 中描述了合适方法。使用与核酸中邻近甲基化胞嘧啶位点的区域杂交的寡核苷酸。然后将该寡核苷酸与聚合酶和游离核苷酸二磷酸或二脱氧核苷酸三磷酸(其对应于在亚硫酸氢盐处理后在该位点上发生的可能碱基之一或任一种(即，胸腺嘧啶或胞嘧啶))一起用于引物延伸方案。优选地，核苷酸二磷酸标记有可检测标志物(例如，荧光团)。在引物延伸之后，将未结合的标记核苷酸二磷酸移除(例如使用体积排阻色谱或电泳)或水解(使用例如碱性磷酸酶)，并检测标记核苷酸至寡核苷酸中的合并，指示存在于所述位点上的碱基。
[0194]清楚地，本发明包括另一些高通量测序方法。这样的方法包括例如，固相微测序(如例如Southern等，Genomics, 13:1008-1017,1992所述)或用FRET进行微测序(如例如 Chen 和 Kwok, Nucleic Acids Res.25:347-353,1997 所述)。
[0195]基于限制性内切核酸酶的测定方式
[0196]在一种方法中，使用联合亚硫酸氢盐的限制酶分析(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA)检测未突变序列的存在，基本上如Xiong和Laird, Nucl.Acids Res.,25:2532_2534，2001所述。该方法研究了在用使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物(如亚硫酸氢盐)处理之后甲基化核酸与非甲基化核酸之间的限制酶识别位点的差异。
[0197]在亚硫酸氢盐处理之后，使用本文所述的扩增反应(例如，PCR)扩增包含一个或更多个CpG 二核苷酸的目的区域，所述CpG 二核苷酸是甲基化的并且包含在限制性内切核酸酶识别序列中。然后在足以使切割发生的条件下使扩增产物与在CpG 二核苷酸位点上切割的限制酶接触一段 时间。可选择限制性位点以指示甲基化的存在或不存在。例如，限制性内切核酸酶TaqI切割序列TCGA，在亚硫酸氢盐处理非甲基化核酸后序列为TTGA，并因此不被切割。然后使用本领域已知的检测方法(例如，电泳和/或质谱)检测经消化和/或未经消化的核酸。核酸的切割或未切割指示对象中的癌症。清楚地，该方法可用于阳性读出(read-out)或阴性读出系统用于诊断癌症。
[0198]阳性读出测定方式
[0199]在一个实施方案中，本发明的测定方式包括其中经例如亚硫酸氢盐处理的样品的DNA被检测为阳性信号的阳性读出系统。优选地，检测不到或仅能微弱地检测到来自健康或正常对照对象的非高甲基化DNA。
[0200]在一个优选实施方案中，使用包括以下步骤的方法确定对象样品中提高的甲基化:
[0201](i)在足以诱导诱变的条件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理核酸，从而产生突变核酸；
[0202](ii)使核酸与探针或引物在使其与未突变核酸的选择性杂交发生的条件下杂交，所述探针或引物包含与包含甲基化胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；
[0203](iii)检测选择性杂交。
[0204]在本文中，术语“选择性杂交”意指与探针或引物与突变序列的杂交相比，相同探针或引物与对应的未突变核酸以较高频率或速率发生，或者具有较高的最大反应速度。优选地，在所用反应条件下，探针或引物不与携带突变的非甲基化序列杂交。
[0205]在一个实施方案中，使用Southern、斑点印迹、狭缝印迹或其他核酸杂交方法来检测杂交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，Cancer Res.57,594-599，1997)。经过适当的探针选择，这样的测定方式一般在上文中进行了描述并且加上必要变更适用于目前描述的选择性诱变途径。
[0206]优选地，采用连接酶链反应方式来区分突变核酸与未突变核酸。连接酶链反应(描述于EP320，308和美国专利N0.4，883，750中)使用至少两种退火至靶核酸的寡核苷酸探针，以这种方式使得它们在靶核酸上并列。在连接酶链反应测定中，在其中诊断探针仍然基本上仅与靶核酸结合的条件下，使靶核酸与与所述靶序列诊断部分互补的第一探针(诊断探针)(例如，包含一个或更多个甲基化CpG 二核苷酸的核酸)杂交，并且与与毗邻诊断部分的核苷酸序列互补的第二探针(毗邻探针)杂交。诊断探针和毗邻探针可具有不同长度和/或具有不同的解链温度，使得可调节杂交的严格度以允许其与靶标选择性杂交，其中具有较高解链温度的探针在较高严格度下杂交并且在洗涤后移除未结合和/或未选择性结合的探针，具有较低解链温度的其他探针在较低严格度下杂交。然后使诊断探针与毗邻探针共价连接(例如，使用T4DNA连接酶连接)，以从而产生与靶序列互补的较大的靶探针，并且通过修改杂交严格度移除未连接的探针。在这一点上，与已连接的探针相比，未连接的探针将在较低严格度杂交条件下选择性杂交。因此，可将杂交的严格度提高至至少高达用于杂交较长探针的严格度的严格度，并优选在更高的严格度下进行，因为连接后由较短探针贡献的长度提闻。
[0207]在另一个实例中，标记探针之一或二者使得可通过以下方法来测试靶序列的存在或不存在:解链靶标-探针双链体，洗脱分离探针并测试标记。当两种探针均被标记时，使用不同配体以允许区分连接的和未连接的探针，在所述情况下，相同洗脱级分中两种标记的存在确定了连接事件。如果祀核酸与固体基质结合，例如在Southern杂交、狭缝印迹、斑点印迹或微芯片测定方式中，可直接确定诊断探针和Btt邻探针二者的存在。
[0208]甲基化特异性微阵列(MSO)也可用于区分突变序列与未突变序列。例如，Adorian等，Nucl.Acids Res.,30:e21,2002中描述了合适的方法。MSO使用已经经使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物(例如，亚硫酸氢盐)处理的核酸作为模板，用于进行扩增突变核酸和未突变核酸二者的扩增反应。用包含可检测标记(例如，荧光团，如Cy3或Cy5)的至少一种引物进行扩增。
[0209]为了产生用于检测突变核酸的微阵列，将寡核苷酸优选地以一定冗余度点到例如载玻载片上(例如，如Golub等，Science，286:531-537，1999所述)。优选地，对于所分析的每种CpG 二核苷酸,使用两种不同的寡核苷酸。每种寡核苷酸包含序列N2_16CGN2_16或N2_16TGN2_16 (其中N是邻近目的CpG 二核苷酸或与其并列的核苷酸的数目)，其反映出CpG 二核苷酸的甲基化或非甲基化状态。
[0210]然后在能够检测单一核苷酸差异的条件下使带标记的扩增产物与微阵列上的寡核苷酸杂交。在洗涤以移除未结合的扩增产物之后，使用例如微阵列扫描器检测杂交。该方法不仅允许确定大量CpG 二核苷酸的甲基化状态，而且还是半定量的，能够确定所分析的每种CpG 二核苷酸中的甲基化程度。因为在单一样品中可能具有某程度的甲基化异质性，所以这样的定量可帮助诊断癌症。
[0211]基于扩增的测定方式
[0212]在一个替代实例中，使用扩增系统来检测杂交。在甲基化特异性PCR方式(MSP ；Herman 等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826,1992)中，使用包括扩增经亚硫酸氢盐处理的DNA的方法检测杂交。因此，通过使用在中等和/或高严格条件下特异性退火至未突变序列的一种或更多种探针或引物，仅使用包含甲基化核苷酸的样品产生了扩增产物。Cottrell 等，Nucl.Acids Res.32:elO, 2004 (HeavyMethyl PCR) ;Rand 等 Nucl.AcidsRes.33:el27,2005(Headloop PCR) ;Rand 等，Epigeneticsl:94_100，2006 (亚硫酸氢盐差异变性PCR)和PCT/AU07/000389 (末端特异性PCR)提供了用于从经亚硫酸氢盐处理的DNA的混合物中选择性扩增甲基化组分或非甲基化组分的替代测定。
[0213]可使用本文描述的任一种扩增测定方式，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、反向聚合酶链反应(iPCR)、原位 PCR (Singer-Sam 等，Nucl.Acids Res.18:687，1990)、链置换扩增(SDA)或环状探针技术。已开发了 PCR技术用以检测基因突变(Kuppuswamy 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:1143-1147,1991)和定量等位基因特异性表达(Szabo 和 Mann, Genes Dev.9:3097-3108,1995 以及 Singer-Sam 等，PCR Methods 增刊.1:160-163，1992)。这样的技术使用内引物，其退火至经PCR生成的模板并且在待测定的单核苷酸5’立即终止。这样的方式容易与上文所述的连接酶链反应相组合。使用实时定量测定方式也是有用的。经过适当引物的选择，这样的测定方式一般在上文中进行了描述并且加上必要变更适用于目前描述的选择性诱变途径。
[0214]本发明还考虑了甲基化特异性解链曲线分析(基本上如Worm等,Clin.Chem.,47:1183-1189，2001所述)。该方法使用经亚硫酸氢盐处理的甲基化核酸或非甲基化核酸产生的扩增产物中解链温度的差异。基本上，在与双链DNA特异性结合的荧光染料(例如，SYBRGreen I)存在下进行经亚硫酸氢盐处理的样品的无差别扩增。通过提高扩增产物的温度同时监测荧光性，确定了扩增产物的解链性质，并因此确定了其序列。荧光性的降低反映出扩增产物中的至少一个结构域解链。荧光性降低的温度指示扩增核酸的核苷酸序列，从而允许确定一个或更多个CpG 二核苷酸位点上的核苷酸。因为使用本发明扩增了核酸的序列。
[0215]本发明还包括使用实时定量形式的PCR,例如TaqMan(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，88，7276-7280，1991 ；Lee 等，Nucleic Acid Res.21,3761-3766,1993)以进行该实施方案。例如，Eads等,Nucl.Acids Res.28:E32, 2000的MethylLight方法使用经修改的TaqMan测定来检测CpG 二核苷酸的甲基化。基本上，该方法包括用亚硫酸氢盐处理核酸样品，以及使用扩增反应(例如，PCR)扩增包含在赘生性细胞中甲基化并且在对照样品中非甲基化的一个或更多个CpG 二核苷酸的核酸。在三种寡核苷酸(目的区域侧翼的正向和反向引物以及在两个引物之间与一个或更多个甲基化CpG 二核苷酸杂交的探针)存在下进行扩增反应。探针双标记有5’荧光报道基因和3’淬灭剂(或者反之亦然)。当探针是完整的时，淬灭剂染料由于其相近性而吸收报道基因的荧光。在退火至PCR产物之后，通过5，至3，外切核酸酶活性(例如，Taq DNA聚合酶的5，至3，外切核酸酶活性)切割探针。该切割将报道基因从淬灭剂中释放出来，从而导致提高的荧光信号，其可用于估计最初的模板甲基化水平。通过使用与未突变核酸(即，甲基化核酸)选择性杂交的探针或引物，确定了甲基化水平，例如，使用标准曲线确定。 [0216]或者，除了使用需要切割的标记探针之后,还使用诸如Molecular Beacon.TM.的探针(参见，例如Mhlanga和Malmberg，Methods25:463-471，2001)。分子信标是具有茎环结构的单链核酸分子。环结构与在赘生性样品中甲基化而在对照样品中非甲基化的一个或更多个CpG 二核苷酸周围的区域互补。茎结构通过使在探针(环)两侧的彼此互补的两条“臂”退火而形成。使荧光部分与一条臂结合，并且使当分子信标没有与靶序列结合时抑制任何可检测荧光的淬灭部分与另一条臂结合。在使环区域与其靶核酸结合之后，分离臂并且荧光是可检测的。但是，即使是单一碱基错配也显著改变样品中检测到的荧光水平。因此，通过检测到的荧光水平来确定特定碱基的存在或不存在。这样的测定有助于检测核酸中的一个或更多个未突变位点(即，甲基化核苷酸)。
[0217]荧光标记的锁定核酸(LNA)分子或荧光标记的蛋白质-核酸(PNA)分子可用于检测核苷酸差异(例如，如 Simeonov 和 Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30 (17):1_5,2002所述)。LNA和PNA分子以高亲和力与核酸(特别是DNA)结合。在LNA或PNA探针与靶核酸杂交后，与所述探针缀合的荧光团(特别是罗丹明或六氯荧光素)发出水平显著更高的荧光。但是，即使发生单一核苷酸错配时，荧光提高的水平也不提高至相同水平。因此，样品中检测到的荧光度指示LNA或PNA探针与靶序列之间错配的存在，例如，甲基化CpG二核苷酸中存在突变胞嘧啶的情况。优选地，使用荧光标记的LNA或PNA技术来检测之前已使用例如本领域已知和/或本文描述的扩增方法扩增的核酸中的至少单个碱基变化。
[0218]如对于本领域技术人员显而易见的，LNA或PNA检测技术通过将LNA或PNA探针固定至固体支持物而便于高通量检测一种或更多种标志物，如Orum等，Clin.Chem.45:1898-1905，1999 所述。
[0219]或者，使用实时测定例如所谓的HeavyMethyl测定(Cottrell等，Nucl.AcidsRes.32:el0,2004)来确定测试样品中核酸甲基化的存在或水平。基本上，该方法使用一种或更多种不可延伸的核酸(例如寡核苷酸)阻断剂，其以甲基化特异性方式与经亚硫酸氢盐处理的核酸结合(即，在中等至高严格条件下阻断剂与未突变DNA特异性结合)。使用可任选地具有甲基化特异性但是位于一种或更多种阻断剂侧翼的一种或更多种引物来进行扩增反应。在非甲基化核酸(即，未突变DNA)存在下，阻断剂结合并且没有产生PCR产物。使用基本上如之前所述的TaqMan测定，确定样品中核酸的甲基化水平。
[0220]用于在用使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理后检测甲基化核酸的另一些基于扩增的方法包括例如甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA) (Bianco等，Hum.Mutat.，14:289-293，1999)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE) (Abrams和Stanton, Meth ods Enzymol.,212:71-74,1992)和甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC) (Deng 等，Chin.J.Cancer Res.，12:171-191，2000)。这些方法的每一种均使用基于核酸序列和/或二级结构用于检测扩增产物中核酸差异的不同技术。本发明清楚地考虑了这样的方法。
[0221]关于其他基于扩增的测定方式，使用多种方法来分析扩增产物，包括凝胶电泳、凝胶过滤、质谱，并且在标记引物的情况下，通过鉴定扩增产物中的标记来分析。在一个替代实施方案中，基本上如 Sadri 和 Hornsby, Nucl.Acids Res.24:5058-5059,1996 以及 Xiong和Laird，Nucl.Acids Res.25，2532-2534，1997所述对由经亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物进行限制酶消化，以分析所形成的产物。
[0222] 也可采用高通量检测方法，例如，基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALD1-T0F)、电喷雾离子化(ESI)、质谱(包括串联质谱，如LCMS/MS)、生物传感器技术、易消失的光学纤维技术或DNA芯片技术。[0223]关于本文所述的利用杂交和/或扩增检测系统的另一些测定方式，特别考虑了如本文所述的这些方法与基于选择性诱变的测定的组合。在一个实例中，通过进行包括以下步骤的方法来检测提高的甲基化:
[0224](i)在足以诱导诱变的条件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理核酸，从而产生突变核酸；
[0225](ii)在使得与未突变核酸的杂交发生的条件下，使核酸与两种非重叠且非互补引物杂交，所述引物各自包含与DNA中包含甲基化胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；
[0226](iii)扩增介入杂交引物的核酸，从而产生由包含引物序列的序列组成的DNA片段；
[0227](iv)在使得与未突变核酸的杂交发生的条件下，使扩增的DNA片段与探针杂交，所述探针包含对应于包含甲基化胞嘧啶残基的序列或与其互补的核苷酸序列；以及
[0228](V)检测杂交。
[0229]阴性读出测定
[0230]在另一个实例中，测定方式包括这样的阴性读出系统，其中来自健康/正常对照样品的DNA降低的甲基化被检测为阳性信号，并且优选地，检测不到或仅微弱地检测到来自赘生性样品的甲基化DNA。
[0231]在一个优选实 施方案中，使用包括以下步骤的方法确定降低的甲基化:
[0232](i)在足以诱导诱变的条件下用一定量使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理核酸，从而产生突变核酸；
[0233](ii)在使得与突变核酸的杂交发生的条件下使核酸与探针或引物杂交，所述探针或引物包含与包含突变胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；以及
[0234](iii)检测选择性杂交。
[0235]在这些实例的一个实施方案中，所述胞嘧啶残基在CpG 二核苷酸内或在CpG岛内。
[0236]在本文中，术语“选择性杂交”意指与探针或引物与非突变序列的杂交相比，相同探针或引物与对应突变核酸的杂交以较高频率或速率发生，或者具有较高的最大反应速度。优选地，探针或引物在所用反应条件下不与甲基化序列(或未突变序列)杂交。
[0237]基于杂交的测定方式
[0238]在一个实施方案中，使用Southern、斑点印迹、狭缝印迹或其他核酸杂交方法来检测杂交(Kawai 等，Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994 ；Gonzalgo 等，Cancer Res.57,594-599，1997)。经过适当的探针选择，这样的测定方式一般在上文中进行了描述并且加上必要变更适用于目前描述的选择性诱变途径。优选地，采用连接酶链反应方式来区分未突变核酸与突变核酸。在这一方面中，测定需求和条件如上文所述地用于阳性读出测定的一样并且加上必要的变更适用于本方式。但是，探针的选择不同。对于阴性读出测定，选择一种或更多种与突变序列而不是未突变序列选择性杂交的探针。
[0239]优选地，连接酶链反应探针具有3’端和/或5’端序列，其包含在健康对照样品中非甲基化而在癌症中高甲基化的CpG 二核苷酸，使得诊断探针和毗邻探针能够仅在CpG 二核苷酸的胞嘧啶突变成胸苷(例如，在非甲基化胞嘧啶残基的情况下)时连接。
[0240]如对于本领域技术人员显而易见的，上述MSO方法便于进行阳性和/或阴性读出测定之一或二者。这是因为所述测定检测突变序列和未突变序列二者，从而有助于确定甲基化水平。但是，本发明考虑了仅检测甲基化序列或非甲基化序列的测定。
[0241]基于扩增的测定方式
[0242]在一个替代实例中，使用用于阳性读出测定的如上文所述的任意扩增测定方式使用扩增系统来检测杂交，即使使用与突变核酸选择性杂交的引物(和探针(适用时))也是如此。
[0243]为了使之前描述的HeavyMethyl测定适用于阴性读出方式，以甲基化特异性方式与经亚硫酸氢盐处理的核酸结合的阻断剂在中等至高严格条件下与突变DNA特异性结合。使用可任选地具有甲基化特异性但是位于一种或更多种阻断剂侧翼的一种或更多种引物来进行扩增反应。在甲基化核酸(即，突变DNA)存在下，阻断剂结合并且没有产生PCR产物。
[0244]在一个实例中，通过进行包括以下步骤的方法来检测正常/健康对照对象中降低的甲基化:
[0245](i)在足以诱导诱变的条件下用一定量的使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理核酸，从而产生突变核酸；
[0246](ii)在使得与未突变核酸的杂交发生的条件下，使核酸与两种非重叠且非互补引物杂交，所述引物各自包含与DNA中包含突变胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；
[0247](iii)扩增介入杂交引物的核酸，从而产生由包含引物序列的序列组成的DNA片段；
[0248](iv)在使得与突变核酸的杂交发生的条件下，使扩增的DNA片段与探针杂交，所述探针包含对应于包含突变胞嘧啶残基的序列或与其互补的核苷酸序列；以及
[0249](V)检测杂交。
[0250]如对于本领域技术人员显而易见的，阴性读出测定优选地包括合适的对照样品，以确保阴性结果是由甲基化核酸而非反应失败造成的。
[0251]在一个特定的实施方案中，使用包括以下步骤的方法来确定本发明DNA区域中提闻的甲基化:
[0252](i)在足以诱导诱变的条件下用使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物处理来源于生物样品的DNA ；
[0253](ii)使用设计成扩增由SEQ IDNO:1、2、3或4之一限定的DNA区域的引物扩增步骤⑴的DNA ；
[0254](iii)对步骤(ii)的扩增产物进行测序，以相对于来自对照样品的DNA中对应的突变残基，鉴定来自所述测试样品的样品中未经历突变的一个或更多个胞嘧啶残基的存在。
[0255]在另一个实施方案中，用亚硫酸氢盐或等价试剂诱导所述诱变并且非甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶。这些尿嘧啶残基在扩增步骤期间转化为胸腺嘧啶。
[0256]根据上文描述的检测方法，在一个实施方案中，其中分析的DNA区域是SEQ ID NO:I区域或基本上相似的区域，分离自非赘生性对照的已经历亚硫酸氢钠诱变步骤的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:5。而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向的对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:6。
[0257]根据该特定的实施方案，所利用的引物对应于SEQ ID NO:18和19或者与其基本上相似。
[0258]在又一个实施方案中，其中分析的DNA区域是SEQ ID NO:2区域或基本上类似的区域，分离自非赘生性对照的已经历亚硫酸氢钠诱变步骤的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:7。而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向的对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:8。
[0259]根据该特定的实施方案，所利用的引物对应于SEQ ID NO:20和21或者与其基本上相似。
[0260]在再一个实施方案中，其中分析的DNA区域是SEQ ID NO:3区域或基本上类似的区域，分离自非赘生性对照的已经历亚硫酸氢钠诱变步骤的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:9，而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向的对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:10o
[0261]根据该特定的实施方案，所利用的引物对应于SEQ ID NO:13和14或与其基本上相似。本领域技术人员应理解，在引物是甲基化特异性引物时，其将有效地扩增未突变的SEQID NO:10分子，但是将非常无效地扩增经历非甲基化胞嘧啶突变的SEQ ID NO:9分子。相同事件分别与SEQ ID NO: 11和12有关，在以下进行讨论。
[0262]在又一个实施方案中，其中分析的DNA区域是SEQ ID NO:4区域或基本上类似的区域，分离自非赘生性对照的已经历亚硫酸氢钠诱变步骤的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:11。而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向的对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:12ο
[0263]根据该特定 的实施方案，所利用的引物对应于SEQ IDNO:13、14和15。
[0264]如前文中详述的，本领域技术人员应理解，关于甲基化胞嘧啶残基的数目在患者样品之间可发生变化。因此，在上文所述实施方案的上下文中，应理解，因为等位基因/多态性变化或者经历高甲基化的胞嘧啶残基的实际数目的差异，扩增之后获得的序列可与本文所提供的序列略微不同。因此，应理解这些实施方案以延伸至表现出此类变化的序列。本领域技术人员将很好地评估DNA序列，与确定其是否是本发明DNA区域的天然变化形式。
[0265]本发明还提供了用于使用本文所述方法检测和/或定量本发明诊断序列或者其表达或甲基化的试剂盒。
[0266]对于用于检测甲基化的试剂盒，本发明试剂盒可包含至少一种与至少一种本发明诊断序列杂交的多核苷酸以及用于至少一种用于检测基因甲基化的试剂。用于检测甲基化的试剂包括例如亚硫酸氢钠、设计成与序列(本发明生物标志物序列的产物)杂交(如果生物标志物序列是非甲基化的(例如，包含至少一个C —U转化)的话)的多核苷酸、和/或甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶。所述试剂盒还可包含对照的天然或合成DNA序列，其代表序列的甲基化或非甲基化形式，例如以上在SEQ ID NO:5至12中所公开的那些序列。所述试剂盒可提供适合用于测定的测定装置形式的固体支持物。所述试剂盒可还包含可检测标记，其与试剂盒中的多核苷酸(例如，探针)可操作地连接。可用于测定性能的另一些材料也可包含在所述试剂盒内，包括测试管、移液吸管等。所述试剂盒还可包含将一种或更多种这些试剂用于本文所述测定的任意一种的书面说明。
[0267]如前文详述的，高甲基化与转录沉默相关。因此，除了这些基因提高的甲基化水平提供筛选大肠或乳腺赘生物之倾向或发生的基础之外，这些基因的表达水平下调在诊断上也是有价值的。根据本发明的该方面，提及基因“表达产物’’或“基因表达’’是提及转录产物(如初级RNA或mRNA)或翻译产物如蛋白质。在这一点上，可通过筛选所产生的表达产物水平(即，RNA或蛋白质)的变化，基因相关染色质蛋白质的变化(例如，氨基酸位数9或27的赖氨酸上组蛋白H3甲基化的存在(抑制修饰))或者起下调表达作用的DNA自身的变化(例如，DNA甲基化的变化)来评估基因表达水平的变化。
[0268]因此，本发明的另一个方面涉及一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834295-163834500限定的DNA区域的表达水平，其中相对于对照水平，所述DNA区域较低的表达水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
[0269]本发明该方面的方法基于比较该赘生物标志物的水平与该标志物的对照水平。“对照水平”可以为“正常水平”，其是由对应的非赘生性大肠细胞或细胞群体表达的标志物水平。
[0270]如前文详述的，可使用来源于是测试对象的相同个体的组织来测定正常(或“非赘生性”)水平。但是，应理解，这对于所涉及个体的侵入性相当大，因此可能更便于相对于标准结果分析测试结果，所述标准结果反映出得自于除所讨论患者之外的个体的个体结果或总体结果。
[0271]优选地，所述对照水平是非赘生性水平。
[0272]如前文所详述的，本发明设计成筛选位于大肠或乳腺中的赘生性细胞或细胞群体。因此，提及“细胞或细胞群体”应理解为提及个体细胞或细胞的组。所述细胞的组可以是细胞的扩散群体、细胞悬液、细胞的包封群体或采取组织形式的细胞群体。 [0273]提及“表达”应理解为提及核酸分子的转录和/或翻译。提及“RNA”应理解为包括提及任意形式的RNA，如初级RNA或mRNA或非转录RNA (例如，miRNA等)。本发明不以任何方式限制，导致RNA合成提高或降低的基因转录调节也可与该RNA转录物(如mRNA)产生蛋白质产物的翻译相关。因此，本发明还延伸至涉及筛选标志物蛋白质产物的调节水平或类型作为细胞或细胞群体赘生性状态指标的检测方法。虽然一种方法是筛选mRNA转录物和/或对应的蛋白质产物，但是应理解本发明不限于这一点，而是延伸至筛选任意其他类型的表达产物，例如初级RNA转录物。
[0274]关于用于下调DNA区域表达的筛选，本领域技术人员还公知的是，DNA水平可检测的变化指示基因表达活性的变化，从而指示表达产物水平的变化。这些的变化包括但不限于DNA甲基化的变化。因此，本文提及“筛选表达水平”和比较这些“表达水平”与对照“表达水平”应理解为提及评估关于转录的DNA因素，例如基因/DNA甲基化类型。在前文已部分详细描述了这些。
[0275]本领域技术人员还已知，染色质结构的变化指示基因表达的变化。基因表达的沉默常常与染色质蛋白质的修饰相关，组蛋白H3的9位和27位之一或二者上的赖氨酸甲基化是充分研究的实例，并且通过使组蛋白H3的赖氨酸9乙酰化来标记活性染色质。因此，基因序列与携带抑制性或活性修饰的染色质的关系可用于评估基因的表达水平。
[0276]提及“核酸分子”应理解为提及脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子二者及其片段。因此，本发明延伸至直接筛选生物样品中的mRNA水平或者筛选反转录自目的mRNA群体的互补eDNA。本领域技术人员很好地设计了涉及筛选DNA或RNA的方法。如以上详述的，本发明方法还延伸至筛选从对象mRNA或基因组DNA自身翻译的蛋白质产物。
[0277]虽然优选方法是检测赘生性标志物的表达产物或DNA变化用于诊断赘生物发生或其倾向，在某些情况下可期望检测到所述甲基化水平的逆向变化，例如，以监测调节赘生性病症(如腺瘤或腺癌发生)。在降低的对象标志物表达指示个体患有以腺瘤或腺癌发生为特征的病症的情况下，例如，在治疗性方案开始后筛选该标志物水平的提高可用于指示对象个体病症的逆转或其他改善形式。因此，本发明方法可用作认为具有赘生物发生风险的那些个体的一次性测试或持续监测方法，或者用作涉及抑制或减慢赘生物发展的治疗性或预防性治疗有效性的监测方法。
[0278]评估生物样品中对象表达的赘生物标志物的手段可通过本领域技术人员公知的任意合适的方法实现。为此，应理解，就检查均匀细胞群体(例如，肿瘤活检或富集自均匀初始群体的细胞群体)或组织切片而言，可利用很多种技术，例如原位杂交、通过微阵列评估表达谱、免疫测定等(下文中进行更详细地描述)，以检测目的标志物的表达水平的不存在或下调。但是，就筛选其中发现了异源群体的均匀细胞群体或体液(如血液样品)而言，由于样品中存在的非赘生性细胞固有表达标志物，所以检测不到标志物表达水平的不存在或降低。即，可能检测不到细胞亚组表达水平的降低。在这种情况下，检测赘生物亚群中本发明标志物表达水平的降低的更适当的机制是通过间接手段，例如，检测表观遗传变化。
[0279]检测基因表达水平变化的方法(除前文中详细描述的甲基化分析之外)，特别是在对象生物样品未被大量非赘生性细胞污染的情况下，其包括但不限于:
[0280]⑴体内检测
[0281]可在施用能够透露肠组织中标志物的改变表达的成像探针或试剂后使用分子成像。分子成像(Moore 等，BBA, 1402:239-249,1988 ；ffeissleder 等，Nature Medicine6:351-355,2000)是分子表达的体内成像，其与目前使用“典型”诊断成像技术如X射线、计算机断层扫描(CT)、MR1、正电子发射断层扫描(PET)或内窥镜可视化的宏观特征相关。
[0282](ii)通过荧光原位杂交(FISH)检测细胞中RNA表达的下调，或者通过技术例如定量逆转录酶聚合酶链反应(QRTPCR)或竞争性RT-PCR产物的流式细胞定性来检测来自细胞的提取物中 RNA 表达的下调(Wedemeyer 等，Clinical Chemistry48:91398-1405, 2002)。
[0283](iii)评估RNA的表达谱,例如通过阵列技术评估(Alon等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA:96,6745-6750,1999 年 6 月)。
[0284](iv)测量细胞提取物中改变的蛋白质水平，例如通过免疫测定测量。可通过本领域技术人员公知的多种合适方法中的任何一种来进行生物样品中的蛋白质性赘生性标志物表达产物。合适方法的实例包括但不限于，抗体筛选组织切片、活检标本或体液样品。就使用基于抗体的诊断方法而言，可通过多种方式例如Western印迹、ELISA或流式细胞术方法确定标志物蛋白质的存在。当然，这些包括单位点和双位点测定或非竞争性“夹心”测定，以及常规竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标的直接结合。
[0285](V)测定细胞表面上蛋白质赘生性标志物改变的表达，例如通过免疫组织化学测定。
[0286](vi)除以上点(iv)和(V)中详述的那些之外，基于任意合适的功能测试、酶测试或免疫测试来测定变化的蛋白质表达。
[0287] 按照常规方法，本领域技术人员可确定给定方法适用于特定类型生物样品的适当性。
[0288]本发明的又一个方面涉及分离的核酸分子，其选自:
[0289](i)分离的核酸分子或与其互补的分子或者其片段或衍生物，其包含一种或更多种如SEQ IDNO:5至12中任意一种所示的核苷酸序列，或者在序列长度上具有至少约86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%或更多同一性的核苷酸序列，或者在低严格条件下能够与所述核酸分子杂交或与其互补的核苷选序列；或者
[0290](ii)分离的核酸分子或者其衍生物或片段，其包含一种或更多种基本上如SEQ IDNO:5至12中任意一种所示的核苷酸序列或者所述分子的片段。
[0291]如上文详述的，SEQ ID NO:5至12代表在对由SEQ ID NO:1至4定义的DNA区域进行亚硫酸氢盐处理和扩增后期望获得的DNA分子的序列。具体地，对来自大肠赘生物的DNA进行亚硫酸氢盐处理不能导致胞嘧啶至尿嘧啶的诱变事件，因为仅非甲基化胞嘧啶残基经历了突变。在SEQ ID NO:1至4的情况中鉴定了大肠赘生物中经历高甲基化的特定胞嘧啶残基中的几个。因此，扩增由SEQ ID NO:1、2、3和4限定的DNA区域，假定所有的相关胞嘧啶残基都被高甲基化，将期望导致具有分别基本上对应于SEQ ID NO:6、8、10和12的序列的DNA产物。关于分离自非赘生性细胞的DNA (即对照DNA)，期望在亚硫酸氢盐处理后发生相关胞嘧啶残基的诱变，因为所述残基是非甲基化的。因此，在该情况下扩增由SEQ ID NO:1、2、3和4限定的DNA区域期望导致分别基本上对应于SEQ ID NO:5、7、9和11的序列的DNA产物。本领域技术人员应理解，并且如前文详述的，不同患者之间可发生高甲基化程度下的变化(关于其程度和高甲基化胞嘧啶残基的数目二者)。然而，尽管事实上每个赘生物样品不能表现出精确相同的高甲基化类型，但是仍然存在这样的事实:相对于非赘生样品，赘生样品将在由SEQ ID NO :1至4限定的区域中表现出可检测的高甲基化。
[0292]从具体选择以通过胞嘧啶至尿嘧啶诱变方法评估高甲基化，然后扩增所讨论DNA区域的观点来看，由SEQ ID NO:5至12限定的甲基化和非甲基化序列提供了可评估由该诊断方法造成的患者的标准。测试样品是否表现出高甲基化与由SEQ ID NO:6、8、10和12所表示的完整范围不相关。相反地，如果样品与SEQID NO:5、7、9和11所表示的范围相比表现出较高水平的高甲基化，则结果将指示提取样品的患者被视为具有大肠赘生物。因此，SEQIDNO:5、7、9、11和SEQ IDNO:6、8、10、12变成可分析测试结果的标准。针对SEQ IDNO:5、
7、9和11，甲基化的任意提高将是很明显的并且指示赘生物。比较由SEQ ID NO:6、8、10和12限定的序列的高甲基化程度和类型，提供了与在高甲基化方面个体患者或群体之间可存在的可变性有关的有用信息。因此，考虑了诊断试剂盒中包含一种或更多种这些标准序列。
[0293]本文中使用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸；或者指这些中任意一种的片段；指基因组或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链的或双链的并且可表示正义链或反义链；指肽核酸(PNA)或天然或合成来源的DNA样或RNA样材料，包括iRNA、核糖核蛋白(例如，iRNP)。所述术语包括包含天然核苷酸已知类似物的核酸(即，寡核苷酸)。所述术语还包括具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如 Mata (1997) Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197 ;Strauss_Soukup 等.(1997)Biochemistry36:8692-8698 ；Samstag 等.(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev6:153-156。[0294]为此，应理解，本发明延伸至涉及前文定义核酸分子的反义核酸分子、SiRNA和miRNAo
[0295]本发明还应理解为延伸至涉及前文定义的核酸分子的探针和引物。
[0296]应理解，根据本文所提供的详细教导，设计反义核酸分子及探针和引物是本领域技术人员常规方法的问题。所述反义分子、探针和引物优选地特异于其靶分子，但是应理解，根据反义分子、探针或引物的序列和长度可发生相同的交叉反应性。交叉反应性/混杂性(promiscuity)的水平是否可接受是本领域技术人员作出的判断并且将取决于情况的特殊性。一般来说，可通过提高探针或引物的长度来实现特异性提高。优选地，所述探针或引物包含至少10、20、30、40或50个核苷酸的核苷酸序列，但是也考虑了使用来源于或涉及上文定义的核苷酸序列的较大分子。该序列可标记有能够给出可鉴定信号的报道分子。
[0297]本发明的核酸分子优选是分离形式或与载体(如表达载体)连接。“分离”意指经历至少一个纯化步骤的核酸分子，并且其方便地定义为，例如相对于如通过分子量、序列或其他方便手段测定的其他组分，包含至少约10%对象核酸分子，优选至少约20%，更优选至少约30%,更更优选至少约40%至50%,甚至更优选至少约60%至70%,甚至更更优选80%至90%或更大的对象核酸分子的组合物。在一个优选实施方案中，本发明的核酸分子也可认为是生物纯的。
[0298]可通过例如克隆和表达cDNA文库，通过PCR扩增mRNA或基因组DNA等来制备、分离和/或操纵本发明的核酸。 [0299]可从多种来源中分离，基因工程改造，扩增和/或重组表达或生成本发明的核酸，无论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒还是其杂交体。
[0300]或者，如例如Adams (1983) J.Am.Chem.Soc.105:661 ；Belousov 等.(1997)，见上；Frenkel 等.(1995),见上；Blommers 等.(1994),见上；Narang 等.(1979)Meth.Enzymol.68:90 ；Brown 等.(1979)Meth.Enzymol.68:109 ;Beaucage (1981)Tetra.Lett.22:1859 ;美国专利N0.4，458，066所述，可通过公知的化学合成技术在体外合成这些核酸。
[0301]科学和专利文献中充分描述了用于操纵核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶、切口平移、扩增进行的随机引物标记)、测序、杂交等。
[0302]可通过本领域技术人员公知的多种通用手段中的任意一种来分析和定量核酸、载体、多肽等。这些包括例如分析生物化学方法，如NMR、分光光度法、放射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和超扩散色谱；多种免疫方法，如流体或凝胶沉淀素(precipitin)反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫突光测定、Southern分析、Northern分析、斑点印迹分析、凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)、核酸或靶标或信号扩增方法、放射标记、闪烁计数和亲和色谱。
[0303]本发明提供了包含本发明核酸的克隆载体。本发明的克隆载体可包含病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、黏粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、恶臭的(foul)痘病毒、伪狂犬病和SV40的衍生物)、Pl基人-工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体以及特异于特定目的宿主的任意其他载体(如杆菌、曲霉菌和酵母)。本发明载体可包括染色体、非染色体和合成DNA序列。大量合适的载体对于本领域技术人员是已知的并且是可商购的。[0304]如果需要，则可使用常规分子生物学方法将本发明核酸克隆到多种载体的任意一种中。例如，美国专利N0.5，426，039描述了用于克隆体外扩增核酸的方法。为了帮助克隆扩增序列，可将限制酶位点“构建成’ ’ PCR引物对。
[0305]本文中使用的术语“相似性”和“同一性”包括所比较序列在核苷酸水平上的精确同一性。在在核苷酸水平上没有同一性的情况下，“相似性”包括可编码不同氨基酸的序列之间的“同一性”差异，但是所述序列在结构、功能、生物化学和/或构象水平上彼此相关。在一个特别优选的实施方案中，在同一性而不是相似性水平上进行核苷酸序列比较。
[0306]用于描述两种或更多种多核苷酸之间的序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“与……基本上相似”和“与……基本上相同”。“参照序列”是长度为至少12个，但是经常是15至18个并且通常是至少25个或更多个单体单元，例如30个单体单元。因为两种多核苷酸可各自包含(I)两种多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)，以及
(2)两种多核苷酸之间不同的序列，所以通常可在“比较窗口”上通过比较两种多核苷酸序列来进行两种(或更多种)多核苷酸之间的序列比较，以鉴定并比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”指与参照序列相比通常为12个相邻残基的概念性区段。比较窗口可包含与参照序列(其不包含添加和缺失)相比约20%或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于对两条序列进行最佳比对。可通过计算机实施算法(Wisconsin遗传学软件包7.0版本，Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison, WI, USA 中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过观察和所选的多种方法中任意一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口上最高百分比的同源性)，来进行用于比对比较窗口的序列最佳比对。还可参照如例如Altschul 等(Nucl.Acids Res.25:3389,1997)所公开的 BLAST 家族的程序。可在 Ausubel等(“Current Protocols in Molecular Biology^John ffiley&Sons Inc,第 15章，1994-1998)的19.3单元中找到序列分析的详细讨论。多种其他算法也可用于比较核苷酸序列，例如但不限于 PILEUP、CLUSTALW、SEQUENCHER 或 VectorNTI。
[0307]本文中使用的术语“序列相似性”和“序列同一性”是指序列在比较窗口上以核苷酸-核苷酸为基础相同或者功能或结构相似的程度。因此，例如，通过以下方法来计算“序列同一性百分比”:在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定两条序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)的位置示出以产生匹配位置的数目，用匹配位置数目除以比较窗口中总位置数目(即，窗口大小)，并且结果乘以100，以得到序列同一性百分比。
[0308]在两种核酸情况下，短语“与……基本上相同”或“与……基本上相似”可指两条或更多条序列在比较和比对以最大对应时具有至少约86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性。
[0309]本发明提供了分离的核酸或重组核酸，其在低严格条件下与本发明的示例性序列杂交。在一些替代方面中，如本领域所公知并且如本文所描述的，严格条件是高严格条件或中等严格条件。这些方法可用于本发明的分离核酸。
[0310]“杂交”是指核酸链与互补链通过碱基配对结合的过程。杂交反应可具有敏感性和选择性，使得即使在其以低浓度存在的样品中也可鉴定出特定的目的序列。严格条件可由例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，或者由杂交温度来限定，并且在本领域中是公知的。例如，如以下详述的，可通过降低盐浓度，提高甲酰胺浓度，或者升高杂交温度，改变杂交时间提高严格度。在一些替代方面中，如本文所述，本发明核酸由其在多种严格条件(例如，高、中等和低)杂交的能力限定。
[0311]本文提及低严格度包括并且涵盖至少约O至至少约15% v/v甲酰胺和至少约IM至至少约2M盐用于杂交，以及至少约IM至至少约2M盐用于洗涤条件。一般来说，低严格度在约25-30°C至约42°C。温度可改变并且使用较高温度来代替甲酰胺和/或给出替代严格条件。在需要时可应用替代严格条件，例如中等严格度，其包括并且涵盖至少约16% v/v至至少约30% v/v甲酰胺和至少约0.5M至约0.9M盐用于杂交，以及至少约0.5M至至少约0.9M盐用于洗涤条件；或者高严格度，其包括并且涵盖至少约31% v/v至至少约50% v/v甲酰胺和至少约0.01M至约0.15M盐用于杂交，以及至少约0.01M至至少约0.15M盐用于洗涤条件。一般来说，洗涤在 Tm=69.3+0.41 (G+C) %下进行(Marmu 和 Doty, J.Mol.Biol.5:109，1962)。但是，随着错配碱基对数目每提高I %，双链体DNA的Tm就降低IV (Bonner和Laskey, Eur.J.Biochem.46:83,1974)。甲酰胺在这些杂交条件下是任选的。因此，如下定义了特别优选的严格度水平:低严格度为6X SSC缓冲液，0.l%w/v SDS，在25°C至42°C下；中等严格度为2X SSC缓冲液，0.1% w/v SDS，在范围为20°C至65°C的温度下；高严格度为0.1 X SSC缓冲液，0.1% w/v SDS，在至少65°C的温度下。 [0312]在本发明核酸由其在高严格条件下杂交的能力限定时，这些条件包括在约37°C至42°C下的约50%甲酰胺。在一个方面中，本发明核酸由其在降低的严格度下杂交的能力限定，所述降低的严格度包括在约30°C至35°C下的约35%至25%甲酰胺的条件。或者，本发明核酸由其在高严格度下杂交的能力限定，所述高严格度包括在42°C下在50%甲酰胺，5XSSPE,0.3% SDS和重复序列锁定核酸(如cot_l或鲑精DNA)(例如，200n/ml经剪切和变性的鲑精DNA)中。在一个方面中，本发明核酸由其在降低的严格度条件下杂交的能力限定，所述降低的严格度条件包括在35°C的降低温度下的35%甲酰胺。
[0313]本发明的另一个方面提供了用于测定生物样品的诊断试剂盒，其包含一种或更多种用于检测本发明标志物的物质和可用于帮助所述物质检测的试剂。还可包含另一些装置，例如以接收生物样品。所述物质可以是任意合适的检测分子。
[0314]在一个实施方案中，所述试剂盒包含对应于SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11或12的
一种或更多种核酸分子或者基本上相似的核酸分子。如前文详述的，这些序列可用作评估由测试样品扩增的产物的标准(对照)。
[0315]在另一个实施方案中，所述试剂盒包含一个或更多个扩增引物组，所述引物组对应于如下序列:
[0316](i)SEQ ID NO:13和14或者基本上相似的序列；
[0317](ii) SEQ IDNO: 13、14和15或者基本上相似的序列；
[0318](i i i) SEQ ID NO: 18和19或者基本上相似的序列；
[0319](iv) SEQ ID NO:20和21或者基本上相似的序列。
[0320]参照下面的非限制性实施例进一步描述了本发明。
[0321]实施例1
[0322]鉴定差异性DNA甲基化的推定区域
[0323]使用国际专利公开N0.W02011/017760中描述的亚硫酸氢盐标签方法向三种结直肠癌细胞系HCT116、SW480和UM应用DNA甲基化的全基因组分析，与来自周边血液的DNA进行比较。该技术表征了 TaqI(TCGA)和MspI (CCGG)限制性位点上的DNA甲基化水平。所鉴定的差异性甲基化位点中是位于染色体6，位置163，834，406上的TaqI限制性位点中的CpG位点。在比较8种结直肠癌DNA与其8中匹配正常组织DNA的样品时，该位点还显示出差异性甲基化。该位点鉴定出位于先前未表征的基因Refseq L0C100526820中，并且如下文所述研究了此处和周围序列中的DNA甲基化。随后将基因命名为CAHM(结直肠腺癌高甲基化)。
[0324]实施例2
[0325]来自10个正常组织标本和10个结直肠癌标本的结直肠组织标本中SEQ ID NO:1中胞嘧啶的甲基化
[0326]设计引物以在用亚硫酸氢盐进行化学转化之后扩增L0C100526820基因的两个区域。与亚硫酸氢钠反应使胞嘧啶转化为尿嘧啶(随后扩增为胸腺嘧啶)，而5-甲基胞嘧啶没有转化；设计引物以等量扩增甲基化和非甲基化DNA序列。
[0327]正向引物:5'ATTTGTAAAAATGTTGATTTTTGTTTTTTAGAT(SEQ ID NO:18)
[0328]反向引物:5'TCTTATTACACCTTCCCRTTATTCTA(SEQ ID NO:19)
[0329]将引物用于对10个结直肠癌标本的经亚硫酸氢盐处理的DNA，其匹配正常组织和正常血液 DNA 进行 PCR。使用 Promega GoTaq master mix (不含 SybrGreen)、3mM MgCl2 以及200nM的引物和IOnm输入DNA进行扩增。循环条件为95°C下2分钟(I次循环)；然后为50次循环的95°C 15秒、56°C 30秒、72°C 30秒。将扩增的DNA带凝胶纯化并且用接头连接以在Roche454Titanium FLX系统上进行测序。来自个体患者的样品和血液DNA样品分别用条形码“MID”接头(Roche Cat No05619211001)连接，使得序列读数可归属于各个样品以进行序列比对和评分。根据提供有Roche文库制备试剂盒和试剂的方案制备其文库(SEQ IDNO:2，以下的实施例3)以及来自其他基因的扩增子，并且对流动池的两个半份进行测序；一半包含所有的癌症样品并且一半包含等量的条形码正常样品。使用条形码序列针对单个样品分离亚硫酸氢盐测序读数，并将其与经亚硫酸氢盐转化的序列SEQ ID NO:6进行比对。在最佳比对之后，对于每个样品，确定了每个潜在CpG甲基化位点(参照扩增子中的核苷酸位置，图1中标记为36、38、63等的位点)中胞嘧啶的分数。
[0330]图1(b)示出了扩增子中每个CpG位点上甲基化的谱。红线代表癌症样品，对应的蓝线示出匹配的正常组织DNA的甲基化状态。明显看出，癌症样品中有7个在大多数CpG位点上显示出高甲基化水平(约80%)，两个显示出中等水平并且一个显示出最低程度的甲基化。相对地，10个正常DNA样品中有8个显示出甲基化，一般在扩增子中〈10%，一个为低水平10%至20%，并且一个为中等水平约30%。这种部分甲基化的正常样品对应的癌症样品是显示出高水平甲基化的那些样品之一。显著地，分析来源于周边血液的DNA在扩增子中的所述CpG位点上显示出最小程度的甲基化(〈3% )。因此，SEQ ID NO:1中CpG位点上的甲基化水平区分了结直肠癌DNA与匹配的正常结肠组织的DNA和来源于血液的对照DNA。
[0331]实施例3
[0332]来自10个正常组织标本和10个结直肠癌标本的结直肠组织标本中SEQ ID NO:2中胞嘧啶的甲基化
[0333]使用以下引物，如SEQ IDNO:1地分析图2(a)示出的相邻区域SEQ ID NO:2:[0334]正向引物:5'GTYGTGTTGTTTTTTAGTTTTTTAGTAAATT (SEQ ID NO: 20)
[0335]反向引物:5’CACRATACRAAAAACTAATAAACTTTCCTTA (SEQ ID NO:21)
[0336]图2(b)示出了扩增子中每个CpG位点上甲基化的谱。红线代表癌症样品，对应的蓝线示出匹配的正常组织DNA的甲基化状态。扩增子中心区域的序列特征限制了Roche454测序系统中的读数长度；因此仅可评估邻近序列读数起始端的CpG位点。然而，清楚的是，癌症特异性高甲基化包括扩增子左端的前六个CpG位点(碱基61，染色体坐标163,834,653至163,834, 6681)并且延伸至包括最后的10个CpG位点，在碱基195与252之间(染色体坐标163，834，815至163,834,872)。另外，10个癌症样品中有9个显示出中等或高的甲基化水平，并且仅一个匹配的正常组织显示出任意显著的甲基化。另外，该扩增子中的CpG位点甲基化在周边血液DNA中也非常低(<3%)。组合的数据指示，两个所测序扩增子所涵盖的区域(即，染色体6(hgl9序列)的碱基163834295至163834906)表现出结直肠癌特异性高甲基化并且适合于开发用于检测结直肠癌的测定。
[0337]实施例4
[0338]使用用于扩增的甲基化特异性qPCR测定测量结肠组织标本中CAHM基因(L0C100526820)中的甲基化水平
[0339]由结肠组织标本(包括10个腺瘤、15个I期、18个B期、28个C期、7个IV期)、6个匹配的正常结肠标本和7个其他正常结肠组织中提取DNA。使用Zymo EZ Gold亚硫酸氢盐转化试剂盒如制造商建议地对分离的DNA进行亚硫酸氢盐转化。
[0340]PCR测定是15yL反应混合物，其包含最终浓度为IX白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3mM MgCl2、200nM 寡核苷酸 SEQ ID N0:13 和 14、200μΜ dNTP(New EnglandBioLabs)、lX白金缓冲液以及分子探针SYBR Green(SYBRGreen)的1: 120，000稀释液。循环条件为95°C维持2分钟，然后是三个循环的92°C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。然后是50 个循环的 82°C 15 秒，63°C 15 秒和 72°C 20 秒。在 RocheLightCycler480 实时 PCR 仪器中使用384孔板进行PCR扩增。
[0341]使用与周边血液白细胞DNA混合的40pg至5ng全甲基化DNA的标准曲线定量甲基化水平，以得到5ng的总输入。表1总结了 L0C100526820SEQ ID NO:3的甲基化频率。发现PCR靶向的SEQ IDNO: 10在70%的提取自腺瘤的组织DNA中是阳性的，在总体癌组织标本中有74%是阳性的，而仅在所测试的正常结直肠组织标本的25%中是甲基化的(并且在这里为低水平)。
[0342]实施例5
[0343]通过测量来自25个结肠镜检查阴性健康正常对象、25名结直肠腺瘤患者和25名结直肠癌患者的游离循环血浆DNA中CAHM基因(L0C100526820)的甲基化水平来检测结直肠赘生物
[0344] 由25名结直肠腺瘤患者、25名结直肠癌患者和25名结肠镜检查阴性健康患者的4mL人血浆中体乳DNA。使用来自血清/血浆的游离循环核酸的QIAmp Isolation (QIAGEN)进行提取。使用Zymo亚硫酸氢盐转化试剂盒如制造商建议地对分离DNA进行亚硫酸氢盐转化。从4mL血清中回收总计36 μ L的经亚硫酸氢盐转化的DNA。将来自每个患者的总计
2.5 μ L的经亚硫酸氢盐转化的DNA用于30 μ L的第一轮PCR反应中，所述30 μ L的第一轮PCR反应由最终浓度为IX白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3.3mM MgCl2、200nM寡核苷酸 SEQ ID NO:13 和 15,200 μ M dNTP (New England BioLabs)和 IX 白金缓冲液组成。循环条件为95°C维持2分钟，然后是7个循环的92°C 15秒，60°C 30秒和72°C 30秒。在PALM终点PCR循环器中使用96孔板进行PCR扩增。对I μ L来自PCR第一轮的物质进行第二次PCR，进入15 μ L的总PCR反应，其由最终浓度为I X白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、4mMMgC12、200nM 寡核苷酸 SEQ ID NO:13 和 14、200 μ M dNTP (New England BioLabs)、1X 白金缓冲液以及分子探针SYBR Green(SYBR Green)的1:120，000稀释液组成。循环条件为95°C维持2分钟，然后是三个循环的92°C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。然后是47个循环的820C 15秒，62°C 15秒和72°C 20秒。在95°C下5秒，65°C I分钟并且使用0.11°C /秒的倾斜速度连续提高至97°C，进行解链曲线分析。在Roche LightCycler480实时PCR仪器中使用384孔板进行PCR扩增。产物解链曲线在77.4°C +/-0.5°C的患者对象称为阳性。使用与周边血液白细胞DNA混合的40pg至5ng全甲基化DNA的标准曲线定量甲基化水平，以得到5ng的总输入。表2总结了游离循环血浆DNA中CAHM基因(L0C100526820)的甲基化频率。
[0345]看出检测的敏感性随着癌症分期提高而提高。这些数据证实了分离自血清的DNA中L0C100526820甲基化的特异性测定用于检测结直肠赘生物的潜在应用。
[0346]实施例6
[0347]使用用于扩增的甲基化特异性qPCR测定测量结肠乳腺、前列腺和肺组织
[0348]标本中CAHM(L0C100526820)的甲基化水平
[0349]由包括以下的组织标本中提取DNA:10个乳腺癌和10个匹配的正常乳腺组织标本、10个非癌和10个匹 配的正常肺组织标本以及5个前列腺癌和5个匹配的正常前列腺组织标本。此外，包括之前未测试的10个结直肠癌组织标本和10个匹配的正常结肠组织标本的群体作为对照。使用200nM CFFl引物以及如Devos等.Clin Chem2009 ；55 =1337-1346所述的循环条件在改性的15 μ LPCR混合物中测定分离DNA的浓度，所述PCR混合物包含:0.05U/y L 白金 TaqDNA 聚合酶(Invitrogen) U X 白金缓冲液、3mM MgCl2、200 μ M dNTP 和200nM TaqMan 探针(5，-6FAM-ATG GAT GAA GAA AGA AAG GAT GAGT-BHQ-1) (SEQ ID NO:22)。
[0350]使用Epitect Plus Bisulfite试剂盒(QIAGEN)如制造商建议地对Iyg DNA进行亚硫酸氢盐纯转化。在15 μ L PCR中以对于每种引物900ηΜ的最终浓度使用亚硫酸氢盐转化特异性ACTB引物(正向引物:5’ GTG ATG GAG GAG GTT TAG TAA GTT ;反向引物:5’ -AATTAC AAA AAC CAC AAC CTA ATA AA)测定经纯化的亚硫酸氢盐转化DNA的浓度，所述PCR包含
0.05U/ μ L 白金 TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、I X 苯甲基缓冲液、2mMMgCl2、200 μ M dNTP和IOOnM TaqMan 探针(5’-6FAM_ACC ACC ACC CAA CAC ACA ATA ACA AAC ACA-BHQ-1) (SEQ ID NO:25)。PCR 循环条件:95°C 2 分钟；60 次循环的[95°C，10 秒；60°C，50 秒];4°C 10 秒。
[0351 ] 在25 μ L反应混合物中使用CAHM PCR测定测定5ng亚硫酸氢盐转化组织DNA中的CAHM甲基化水平(一式三份)，所述反应混合物包含最终浓度为I X白金TaqDNA聚合酶(Invitrogen)、3mM MgCl2、200nM 寡核苷酸 SEQ ID NO: 13 和 14、200 μ M dNTP、I X 白金缓冲液以及分子探针SYBR Green(Invitrogen)的1:120，000稀释液。PCR循环条件:95°C，2分钟；3次循环的[92°C，15秒；62°C，15秒；72°C，20秒];然后是50次循环的[82°C，15秒；63°C，15秒；72°C，20秒]，然后通过以下设定进行解链曲线分析:在95°C 5秒，65°C I分钟，以0.11°C /秒连续获得(5/秒)逐渐升高至97°C ;然后冷却至40°C维持10秒。在ROcheLightCycIer480实时PCR仪器中使用96孔板进行PCR扩增。
[0352]使用20pg至5ng全甲基化DNA的标准曲线定量甲基化水平。表3总结了 CAHM基因(L0C100526820)SEQ ID NO:3 的甲基化频率。
[0353]PCR靶向的SEQ ID NO: 10在10个结直肠癌标本的9个和10个正常标本的I个中为多于2%甲基化的。相对地，CAHM在10个配对前列腺标本的任何一个中都没有显示出甲基化。在20个匹配肺标本的3个(2个正常和I个癌症)以及匹配乳腺标本的18个中测量出低水平甲基化(小于0.3% )。仅2个乳腺癌标本具有多于2%的CAHM甲基化。这些数据不仅证实了与其他癌症相比CAHM基因座中甲基化用于检测结肠癌的高敏感性，还证实了 CAHM甲基化可检测乳腺癌的亚组。
[0354]本领域技术人员应理解，本文所述的本发明易于进行除本文具体所述那些之外的变化和修改。应理解本发明包括所有的这些变化和修改。本发明还包括本说明书所提及或指示的各个或总体的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或更多个所述步骤或特征的任意组合和全部组合。
[0355]表1
【权利要求】
1.一种在个体中筛选大肠或乳腺赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6:163834097-163834982限定的DNA区域的甲基化状态，其中相对于对照水平，所述DNA区域更高的甲基化水平指示赘生性大肠或乳腺细胞或者倾向于发生赘生性状态的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括评估选自由Hgl9坐标Chr6:163834295-163834500 或 Chr6:163834621-163834906 限定的区域之一或二者的 DNA 区域的甲基化状态。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括评估选自由Hgl9坐标Chr6:163834393-163834519 或 Chr6:163834393-163834455 限定的区域之一或二者的 DNA 区域的甲基化状态。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括评估一个或更多个选自以下的胞嘧啶残基或者相反DNA链上第n+1位处对应的胞嘧啶的甲基化:
Chr6:163834330 Chr6:163834332 Chr6:163834357
Chr6:163834373 Chr6:163834384 Chr6:163834390
Chr6:163834392 Chr6:163834406 Chr6:163834412
Chr6:163834419 Chr6:163834443 Chr6:163834448
Chr6:163834452 Chr6:163834464 Chr6:163834483
Chr6:163834653 Chr6:163834660 Chr6:163834672
Chr6:163834675 Chr6:163834678 Chr6:163834681
Chr6:163834815 Chr6:163834824 Chr6:163834835
Chr6:163834840 Chr6:163834853 Chr6:163834855
Chr6:163834858 Chr6:163834863 Chr6:163834869
Chr6:163834872。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用以下方法检测所述DNA甲基化: (i)甲基化特异性PCR; (ii)MethyLight测定； (iii)甲基化敏感性单核苷酸引物延伸； (iv)甲基化CpG岛扩增；
(V) HeavyMethyl 测定；
(vi)Headloop PCR ;或 (vii)Helper依赖性链反应。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所分析的DNA区域是SEQID NO:1区域或基本上相似的区域，并且经历亚硫酸氢钠诱变步骤后的分离自非赘生性对照的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:5，而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向之对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:6。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所利用的引物对应于SEQID NO:18和19或者与其基本相似。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所分析的DNA区域是SEQID NO:2区域或基本上相似的区域，并且经历亚硫酸氢钠诱变步骤后的分离自非赘生性对照的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:7，而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向之对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:8。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所利用的引物对应于SEQID NO:20和21或者与其基本相似。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所分析的DNA区域是SEQID NO:3区域或基本上相似的区域，并且经历亚硫酸氢钠诱变步骤后的分离自非赘生性对照的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:9，而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向之对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO =IO0
11.根据权利要求10所述的方法，其中所利用的引物对应于SEQID NO:13和14或者与其基本相似。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所分析的DNA区域是SEQID NO:4区域或基本上相似的区域，并且经历亚硫酸氢钠诱变步骤后的分离自非赘生性对照的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:11，而分离自表现出大肠或乳腺赘生物发生或发生倾向之对象的对应区域的序列基本上对应于SEQ ID NO:12ο
13.根据权利要求12所述的方法，其中所利用的引物对应于SEQIDNO:13、14和15。
14.一种在个 体中筛选大肠赘生物的发生或发生倾向的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估由Hgl9坐标Chr6 =163834295-163834500限定的DNA区域的表达水平，其中相对于对照水平，所述DNA区域更低的表达水平指示赘生性大肠细胞或倾向于发生赘生性状态的细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达水平是mRNA表达或蛋白质表达。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述赘生性细胞是腺瘤或腺癌。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述对照水平是非赘生性水平。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述赘生物是结直肠赘生物。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是粪便样品、灌肠洗液、外科手术切除、组织活检或血液样品。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
21.一种用于测定生物样品的诊断试剂盒，其包含一种或更多种多核苷酸以及至少一种用于检测基因甲基化的试剂，所述多核苷酸与至少一种根据权利要求1至4中任一项所述的诊断序列杂交。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含使非甲基化胞嘧啶残基选择性突变的化合物。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含: (i)亚硫酸氢钠； (?)引物，其与至少一种根据权利要求1至4所述的诊断序列杂交；以及 (iii)可检测标记的探针，其区分已用亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA与非甲基化DNA。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含对照DNA序列，其代表所述诊断序列的甲基化或非甲基化形式。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述DNA序列是SEQIDNO:5、6、7、8、9、10、11或12中的一种或更多种，或者是基本上相似的核酸序列。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或更多个扩增引物组，所述引物组对应于如下序列: (i)SEQ ID NO: 13和14或基本上相似的序列； (ii)SEQIDNO: 13、14和15或基本上相似的序列； (iii)SEQ ID NO:18和19或基本上相似的序列；或者 (iv)SEQ ID NO:20和21或基本上相似的序列。
27.—种分离的核酸分子,其选自: (i)分离的核酸分子或与其互补的分子或者其片段或衍生物，其包含一种或更多种如SEQ ID NO:5至12中任一种所示的核苷酸序列，或者在所述序列长度上具有至少约86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更高同一性的核苷酸序列，或者能够在低严格条件下与所述核酸分子或其互补形式杂交的核苷酸序列；或者 (?)分离的核酸分子或者其衍生物或片段，其包含一种或更多种基本上如SEQ ID NO:5至12中任一种所示核苷酸序列或者所述分子的片段。
【文档编号】C12Q1/68GK104024427SQ201280049431
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年8月24日 优先权日:2011年8月25日
【发明者】彼得·劳伦斯·莫洛伊, 劳伦斯·查尔斯·拉普安特, 苏珊·卡尔廷·彼得森, 苏珊·玛格丽特·米切尔 申请人:临床基因组学私人有限公司, 联邦科学和工业研究组织