α淀粉酶变体及其编码多核苷酸的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及α淀粉酶的变体。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述变体的方法。
【专利说明】α淀粉酶变体及其编码多核苷酸
[0001 ] 涉及序列表
[0002]本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
[0003]发明背景
【技术领域】
[0004]本发明涉及α淀粉酶的变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法，以及使用所述变体的方法。
[0005]相关技术的描述
[0006]本发明提供亲本α淀粉酶的变体，所述变体与其亲本相比具有改进的性质。α -淀粉酶(1，4-α-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)是催化淀粉和其它直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解的一类酶。
[0007]有非常多的专利和科学文献涉及此类在工业上极为重要的酶。被称为ttTeiindmyI li样α -淀粉酶”的α -淀粉酶及其变体可在例如W090/11352，W095/10603,
W095/26397，W096/23873，和W096/23874中有介绍。Termamy丨x样α -淀粉酶热稳定性很
高，因此适于高温下实施的处理工艺，如葡萄糖生产过程中的淀粉液化。
[0008]还有一组称为“Fungamyl?样α _淀粉酶”的α -淀粉酶，它们与得自米曲霉的α -淀粉酶相关或同源。这些Fungamyl样α -淀粉酶热稳定性相对较低,例如Novozymes
A/S，Demnark所销售的商品名为FUNGAMYL?的市售产品，最适温度约为55°C，因此不适于在高温下实施的处理。目前Fungamyl样α -淀粉酶用于制造糖浆，例如酿造工业用的糖浆。
[0009]先前已经成功地分离了一种具有增加的热稳定性，优选在酸性pH下的增加的热稳定性的α淀粉酶。W02004/055178公开了来自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的编码一种名为AM782的α淀粉酶的基因。对这种淀粉酶的定性已经显示它是高度嗜热酸性的α淀粉酶，具有一种非常令人感兴趣的活性，从淀粉酶ΑΜ782水解糊精产生的糖谱可以看出。淀粉酶ΑΜ782能够在很高的温度下工作，最高达70°C。但是，这种α淀粉酶在没有冷却的条件下的储存稳定性差。本发明的一个目的是提供如SEQ ID NO: 3的ΑΜ782 (成熟多肽)的储存稳定变体，所述变体保留良好的生淀粉水解活性。
【发明内容】
[0010]本发明涉及亲本α淀粉酶的变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的128，143，141，192，20，76，123，136，142，165，219，224，265，383 和 410 位中的一个或多个位置上包含取代，其中所述变体具有α淀粉酶活性。
[0011]本发明还涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。
[0012]本发明还涉及使用本发明的变体从含淀粉材料产生发酵产物的方法。[0013]发明详述
[0014]本发明涉及α淀粉酶的变体，其在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的128，143，14I, 192，20，76，123，136，142，165，219，224，265，383 和 410 位中的一个或多个(几个)位置上包含取代，其中所述变体具有α淀粉酶活性。
[0015]定义
[0016]α淀粉酶活性:术语“ α淀粉酶”指I, 4-α _D_葡聚糖葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1，其催化淀粉和其它直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。为了本发明的目的，α淀粉酶活性可以使用α淀粉酶测定试剂盒，例如可获自Kikkoman BiochemifaCompany, Cat N0.60213的α淀粉酶测定试剂盒来加以测定。详情可见“材料与方法”部分。1U=30°C，ρΗ4.0条件下释放I μ mol CNP/min。作为替代可以使用其他合适的测定α淀粉酶活性的方法。
[0017]本发明的变体多肽具有SEQ ID NO: 2中所含的亲本α淀粉酶的成熟多肽的α淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。在一个实施方案中，所述成熟α淀粉酶由SEQ ID Ν0:3组成。
[0018]变体:术语“变体”意指具有α淀粉酶活性，且在一个或多个(几个)位置上包含改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指占据某个位置的氨基酸被不同的氨基酸所替换；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；而插入意指在占据某个位置的氨基酸近邻加入一个或几个，例如1-3个氨基酸。优选地，所述改变是取代。本发明的变体多肽具有亲本α淀粉酶，例如SEQ ID NO: 3的α淀粉酶的至少20%的活性，例如至少40%，至少50%，至少60%,至少70%，至少80%，至少 90%，至少95%，和至少100%的活性。
[0019]突变体/突变的(mutant):术语“突变体”(或突变的)意指编码变体的多核苷酸。
[0020]野生型酶:术语“野生型” α淀粉酶意指由天然存在的微生物，例如自然界中出现的细菌、酵母或丝状真菌所表达的α淀粉酶。
[0021]亲本或亲本α淀粉酶:术语“亲本”或“亲本α淀粉酶”意指这样的α淀粉酶，它被施加改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。
[0022]分离的:术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(I)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或所有与其天然伴随的天然存在的成分分开的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何这样的物质:相对于在自然界存在的该物质，其经过人工修饰；或(4)任何这样的物质:该物质经过增加该物质相对于与其自然伴随的其他成分的量的修饰(例如，宿主细胞中编码该物质的基因的多重拷贝；和与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0023]基本上纯的变体:术语“基本上纯的变体”意指这样的制备物，其包含的与其天然伴随或者由于重组而伴随的其他多肽材料以重量计至多10%，至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，至多0.5%。优选地，变体按制备物中存在的总多肽物质的重量计是至少92%纯，例如至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%纯，至少99.5%纯，或100%纯。本发明的变体优选地呈基本上纯的形式。这可以通过，例如，利用已知的重组方法或经典的纯化方法制备所述变体来实现。
[0024]成熟多肽:成熟多肽:术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个实施方案中，SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein EngineeringlO: 1-6)程序预测SEQ ID NO:2的氨基酸I至21为信号肽，而氨基酸22-33为前肽，根据该预测，成熟多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸34-471。成熟多肽作为SEQ ID NO:3公开。
[0025]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有α淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，SignalP (Nielsen et al., 1997, ProteinEngineeringlO:1-6)程序预测SEQ ID NO:1的核苷酸I至63编码信号肽，且核苷酸64-99编码前肽，根据该预测，成熟多肽编码序列为SEQ ID NO:1的核苷酸100至1416 (包括终止密码子)。
[0026]序列同一性:参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,Trends in Geneticsl6:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分(gap open p enalty) 10,缺口延伸罚分(gap extensionpenalty) 0.5 和 EBL0SUM62 (BL0SU M62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最长同一'I"生(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下:
[0027](同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
[0028]就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBO SS软件包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所执行的Needle man-ffunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EM BOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下:
[0029](同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
[0030]片段:术语“片段”在本文中定义为从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α淀粉酶活性。
[0031]等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0032]基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形 式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然伴随或由于重组而伴随的其它多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。
[0033]编码序列:当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
[0034]cDNA:术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤加工包括剪接,然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
[0035]核酸构建体:术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
[0036]调控序列(control sequence):术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以具备用于引入可促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接的特异性限制位点的接头。
[0037]可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
[0038]表达:术语“表达”包括涉及多肽产`生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0039]表达载体:术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与帮助其表达的额外核苷酸可操作地连接。
[0040]宿主细胞:如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何适合于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制过程中发生的突变而不与亲本细胞完全相同的后代。
[0041]改进的性质:术语“改进的性质”意指变体的相比于亲本有所改进的相关性质。这样的改进的性质包括但不限于热活性、热稳定性、PH活性、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面性质、产物特异性、增加的稳定性、改进的储存条件下的稳定性、和化学稳定性。
[0042]改进的热稳定性:术语“改进的热稳定性”意指变体在缓冲液中、或在例如在产品储存/运输中存在的那些条件下，或在与该变体的工业应用中存在的条件相似的条件下，在高温下温育一段时间后，显示的残余α淀粉酶活性相对于亲本有所改善。变体可以或者可以不显示相对于亲本有所改变的热活性规律。例如，相对于亲本，变体在高温下温育之后重折叠的能力可能有所改进。与作为SEQ ID NO:2的成熟多肽公开的亲本微小根毛霉α淀粉酶相比，依照本发明的变体在65°C、pH3.5温育I小时后显示改进的残余活性。残余活性如实施例中所述加以测量。
[0043]在一个方面，当比较残余活性，例如使用可获自Kikkoman BiochemifaCompany, Cat N0.60213)的淀粉酶活性试剂盒比较残余活性时,具有α淀粉酶活性的变体的热稳定性为相比于亲本热稳定至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，或至少25倍。也可以使用其他合适的淀粉酶测定法。
[0044]改进的pH稳定性:术语“改进的pH稳定性”意指变体在可降低亲本的酶活性的特定PH下温育一段时间之后，显示α淀粉酶活性的保留。依照本发明的变体可在低于4.7的pH，例如低于4.5，特别是低于4.0，更特别是低于3.8，例如ρΗ3.5，具有改进的耐性。
[0045]改进的储存稳定性:术语“改进的储存稳定性”意指变体在特定的PH的温度下温育一段时间之后，相对于亲本α淀粉酶显示出改善的残余α淀粉酶活性。测试的条件包括在40°C、pH4.0历时3至10天。
[0046]变体指称规则
[0047]为本发明的目的，使用SEQ ID N0:2中包含的成熟多肽来确定另一 α淀粉酶中的相应氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，所述成熟多肽由SEQ ID Ν0:3组成，且依照本发明进行取代的具体位置参照SEQ ID Ν0:3中的位置。因此，将另一 α淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中所含的成熟多肽对齐，并基于该比对，使用如EMBOSS程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice etal., 2000, Trends Genet.16:276-277),优选5.0.0或更新的版本中的Needle程序所实现的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)来确定与SEQ ID N0:2中所含的 成熟多肽中的任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。
[0048]对另一 α淀粉酶中的对应氨基酸残基的指认可以通过使用几种计算机程序，以其各自的缺省参数进行多个多肽序列的比对来加以确证，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE (基于log-期望的多重序列比较；3.5或更新版本；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research32:1792-1797)，MAFFT (6.857 或更新版本；Katoh and Kuma, 2002, Nucleic AcidsResearch30:3059-3066;Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research33:511-518;Katohand Toh,2007, Bioinformatics23:372-374;Katoh et al., 2009, Methods in MolecularBiology537:39-64;Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics26:1899-1900),和使用Clustalff 的 EMBOSS EMMA (1.83 或更新版本；Thompson et al., 1994, Nucleic AcidsResearch22:4673-4680)。
[0049]当所述另一种酶与SEQ ID NO: 2的成熟多肽已经分歧到如此程度，以至于传统的基于序列的比较无法检测出它们的关系时(Lindahl and Elofsson, 2000, J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其他逐对的序列比较算法(pairwise sequencecomparison)。
[0050]当其它酶与SEQ IDN0:27的成熟多肽差异较大从而传统的基于序列的比较不能检测它们之间的关系时(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其它逐对序列比较算法。使用利用多肽家族(谱)的概率代表搜索数据库的搜索程序，可在基于序列的搜索中获得更高的灵敏度。例如，PS1-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程产生谱，并且能检测关系较远的同源物(Atschul等，1997，NucleicAcids Res.25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白质结构数据库中有一个或多个代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序如GenTHREADER (Jones, 1999，J.Mo 1.Biol.287:797-815;McGuffin and Jones, 2003, Bioinformaticsl9:874-881)利用来自多种来源的信息(PS1-BLAST，二级结构预测，结构比对谱，和溶解势)作为神经网络的输入，所述网络可预测所查询序列的结构折叠。类似地，可以使Gough et al., 2000, J.Mol.Biol.313:903-919的方法比对未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型。然后可以使用这些比对结果产生多肽的同源性模型，并且可以使用专门开发的多种工具评价这类模型的精确度。
[0051]对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于获取和产生结构比对。例如，已经比对了蛋白质的SCOP超家族的结构，并且这些比对结果是可以访问和下载的。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm和Sander, 1998, Proteins33:88-96)或组合延伸(Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng.11:739-747)比对两个或更多个蛋白质的结构，并且执行这些算法还能用于查询具有目的结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(例如，Holm 和 Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。
[0052]在描述本发明的各种α -淀粉酶变体时，为便于提述，采用下述命名法。在所有情况下，应用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
[0053]取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法:原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“Τ226Α”。多个突变用加号(“ + ”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突变，分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。
[0054]缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法:原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示为“Glyl95*”或“G195*”。多个缺失用加号(“ + ”)分隔，例如，“Glyl95*+Ser411*，或 “G195*+S411*，，。
[0055]插入。对于氨基酸插入，使用下述`命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插`入赖氨酸表示为“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
[0056]在这种情况下，通过在插入氨基酸残基前面的氨基酸残基位置编号后加小写字母为插入的氣基酸残基编号。因此在上述实例中序列为:
[0057]
【权利要求】
1.一种α淀粉酶变体，其在对应于SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置128、143、141、192、20、76、123、136、142、165、219、224、265、383和410中的一个或多个位置上包含取代，其中所述变体具有α淀粉酶活性。
2.权利要求1的变体，其选自下组: a)与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽； b)由在低严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)⑴的全长互补链杂交的多核苷酸所编码的多肽； c)由与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%同一性的多核苷酸所编码的多肽；或 d)SEQ ID NO: 2的成熟多肽的片段，其具有α淀粉酶活性。
3.权利要求2的变体，其中所述变体α淀粉酶与SEQID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性。
4.权利要求2或3的变体，其中所述变体α淀粉酶由在低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件、 或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii) (i)的全长互补链杂交的多核苷酸所编码。
5.权利要求2-4中任一项的变体，其中所述变体α淀粉酶由与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的多核苷酸所编码。
6.权利要求2-5中任一项的变体，其中所述变体α淀粉酶由在对应于SEQID NO: 2的成熟多肽的位置 128、143、141、192、20、76、123、136、142、165、219、224、265、383 和 410 中的一个或多个位置上包含取代的SEQ ID NO: 2的成熟多肽组成，且其中所述变体具有α淀粉酶活性。
7.权利要求2-6中任一项的变体，其中所述变体α淀粉酶是SEQID NO: 2的成熟多肽的片段，其中所述片段具有α淀粉酶活性。
8.权利要求1-7中任一项的变体，其是选自下组的亲本α淀粉酶的变体: a)与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽； b)由与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列有至少60%同一性的多核苷酸所编码的多肽；或 c)SEQID NO:2的成熟多肽的片段，其具有α淀粉酶活性。
9.权利要求2-8中任一项的变体，其中所述亲本α淀粉酶与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、但少于100%序列同一性。
10.权利要求2-9中任一项的变体，其中所述亲本与SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、和/或至少99%，但少于100%序列同一性。
11.前述任一权利要求的变体，其中SEQID ΝΟ:2的成熟多肽是SEQ ID ΝΟ:3的多肽。
12.权利要求1-11中任一项的变体，其中改变的数目是1-20，例如1-10和/或1-5，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个改变。
13.权利要求1-12中任一项的变体，其中所述变体还包含接头和糖结合模块。
14.权利要求1-13中任一项的变体，其在对应于位置20的位置上包含取代。
15.权利要求14的变体，其中所述改变是用Ser取代。
16.权利要求1-15中任一项的变体，其在对应于位置76的位置上包含取代。
17.权利要求16的变体，其中所述改变是用Gly取代。
18.权利要求1-17中任一项的变体，其在对应于位置123的位置上包含取代。
19.权利要求18的变体，其中所述改变是用His取代。
20.权利要求1-19中任一项的变体，其在对应于位置128的位置上包含取代。
21.权利要求20的变体，其中所述改变是用Asp取代。
22.权利要求1-21中任一项的变体，其在对应于位置136的位置上包含取代。
23.权利要求22的变体，其中所述改变是用Phe取代。
24.权利要求1-23中任一项的变体，其在对应于位置141的位置上包含取代。
25.权利要求24的变体，其中所述改变是用Trp或Arg取代。
26.权利要求1-25中任一项的变体，其在对应于位置142的位置上包含取代。
27.权利要求26的变体，其中所述改变是用Asp取代。
28.权利要求1-27中任一项的变体，其在对应于位置143的位置上包含取代。
29.权利要求28的变体，其中所述改变是用Asn取代。
30.权利要求1-29中任一项的变体，其在对应于位置165的位置上包含取代。
31.权利要求30的变体，其中所述改变是用Met取代。
32.权利要求1-31中任一项的变体，其在对应于位置192的位置上包含取代。
33.权利要求32的变体，其中所述改变是用Arg取代。
34.权利要求1-33中任一项的变体，其在对应于位置219的位置上包含取代。
35.权利要求34的变体，其中所述改变是用Cys取代。
36.权利要求1-35中任一项的变体，其在对应于位置224的位置上包含取代。
37.权利要求36的变体，其中所述改变是用Ala或Arg取代。
38.权利要求1-37中任一项的变体，其在对应于位置265的位置上包含取代。
39.权利要求38的变体，其中所述改变是用Cys取代。
40.权利要求1-39中任一项的变体，其在对应于位置383的位置上包含取代。
41.权利要求40的变体，其中所述改变是用Arg取代。
42.权利要求1-41中任一项的变体，其在对应于位置410的位置上包含取代。
43.权利要求42的变体，其中所述改变是用Ala取代。
44.权利要求1-43中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的两个位置上包含取代。
45.权利要求1-44中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的三个位置上包含取代。
46.权利要求1-45中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的四个位置上包含取代。
47.权利要求1-46中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的五个位置上包含取代。
48.权利要求1-47中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的六个位置上包含取代。
49.权利要求1-48中任一项的变体，其在对应于位置20、76、123、128、136、141、142、143、165、192、219、224、265、383和410中的每一个位置上均包含取代。
50.权利要求1-49中任一项的变体，其包含选自G20S、A76G、S123H、G128D、K136F、Y141W、Y141R、N142D、D143N、D165M、K192R、P219C、P224A、P224R、A265C、N383R、和 V410A 中的一个或多个(几个)取代。
51.权利要求50的变体，其中所述变体包含下述取代或取代组合中的至少一个: D165M ;或 Y141W ;或 Y141R ;或 K136F ;或 K192R ;或 P224A ;或 P224R ;或
S123H+Y141W ;或 G20S+Y141W ;或` A76G+Y141W ;或 G128D+Y141W ;或 G128D+D143N ;或 P219C+141W ;或 N142D+D143N ;或 Y141W+K192R ;或 Y141W+D143N ;或 Y141W+N383R ;或
Y141W+P219C+A265C ;或
Y141W+N142D+D143N ;或
Y141W+K192R+V410A ;或
G128D+Y141W+D143N ;或
Y141W+D143N+P219C ;或
Y141W+D143N+K192R ;或
G128D+D143N+K192R ;或
Y141W+D143N+K192R+P219C ;或
G128D+Y141W+D143N+K192R ;或
G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C。
52.权利要求13-51中任一项的变体，其中所述糖结合模块是包含与选自下组的序列有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44。
53.权利要求52的变体，其中所述接头和CBM来自罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)，例如SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 36，或与其有60%同一性的序列。
54.权利要求52的变体，其中所述接头和CBM来自黑曲霉(Aspergillusniger)，例如SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:38，或与其有60%同一性的序列。
55.—种分离的多核苷酸,其编码权利要求1-54中任一项的变体。
56.—种核酸构建体,其包含权利要求55的多核苷酸。
57.—种表达载体,其包含权利要求56的多核苷酸。
58.一种宿主细胞，其包含权利要求57的多核苷酸。
59.一种产生变体α淀粉酶的方法，包括: a)在适于该变体表达的条件下培养权利要求57的宿主细胞；和 b)回收该变体。
60.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含权利要求55的多核苷酸。
61.—种产生权利要求1-54中任一项的变体的方法,包括: a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和` b)回收所述变体。
62.一种从含淀粉材料产生发酵产品的方法，包括下述步骤: (a)利用权利要求1-54中任一项的变体α淀粉酶液化含淀粉材料； (b)使用葡糖淀粉酶糖化步骤(a)中获得的经液化的材料；和 (C)使用发酵微生物发酵该经糖化的材料。
63.—种用于从含淀粉材料产生发酵产品的方法,包括: (a)在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度用权利要求1-54中任一项的变体α淀粉酶、以及糖淀粉酶糖化所述含淀粉材料， (b)使用发酵微生物进行发酵。
64.权利要求62和63的方法，其中所述发酵微生物是酵母生物，具体地是酵母属菌种(Saccharomyces spp.),更具体地是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
65.权利要求62-64中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，具体地是乙醇。
66.一种产生酶改性的淀粉衍生物的方法，其包括使用权利要求1-54中任一项的具有α淀粉酶活性的变体来液化和/或糖化淀粉。
【文档编号】C12N15/56GK103781910SQ201280043436
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】松井知子, A.托米基, G.科沃德-凯利 申请人:诺维信公司, 诺维信北美公司