处理凝血因子的方法

处理凝血因子的方法
【专利摘要】本申请涉及用于纯化重组凝血因子蛋白，包括例如凝血素（因子II）的方法。在实施例中，这些方法提供了纯化的凝血素，该纯化的凝血素展示出增加的生物活性和降低的凝血酶水平的纯化的凝血素，由此增加了凝血素的安全性。还提供了纯化的重组凝血因子蛋白。
【专利说明】处理凝血因子的方法
[0001]发明背景发明领域
[0002]本申请涉及用于纯化重组凝血因子蛋白(包括例如凝血素(因子II))的方法。在实施例中，这些方法提供了纯化的凝血素，该纯化的凝血素展示出增加的生物活性和降低的凝血酶水平，由此增加凝血素的安全性。还提供了纯化的重组凝血因子蛋白。
发明背景
[0003]用于治疗应用(例如，用于血友病以及其他血液障碍的治疗)的凝血因子可以从人血浆中获得，尽管纯化可能是复杂的。即使伴随血液衍生蛋白产品的大量的安全性测量和测试，但是不能排除感染性病毒或朊病毒的污染。因此，高度令人希望的是从没有动物衍生组分的培养基中生长的重组细胞中产生人类治疗性蛋白质。因为许多蛋白质需要一个哺乳动物宿主来以全功能形式产生，即需要被正确地翻译后修饰，所以这常常不是简单的。
[0004]因子II (凝血素)是血液凝固所必需的一种凝血因子。在外部的(或组织因子)血液凝固通路中，组织因子触发凝固级联，其中在因子Xa、因子Va、磷脂、以及Ca2+离子的存在下，凝血素变为活化型因子IIa (凝血酶)。凝血酶通过多个通路发挥作用以通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝块以及参与其他前凝固通路来阻止流血。
[0005]在重组凝血素蛋白的生产和纯化过程中，凝血酶可以作为一种产物相关的杂质存在。游离凝血酶的水平大体上必须被保持在低水平以增加产品安全性。另外，重组凝血素在N端结构域中包含10个Y-羧基谷氨酸“Gla-残基”。这些残基被认为螯合Ca2+离子，这介导蛋白质与磷脂膜的结合，这是凝血素激活为凝血酶的先决条件。
[0006]本申请的诸位发明人已经认定了对于提供具有高水平的Y-羧化谷氨酸残基和低凝血酶污染的重组纯化凝血素的纯化方法的需要。
`[0007]优选实施方案概述
[0008]本申请提供了凝固蛋白的纯化方法，以满足以上认定的需要。
[0009]在实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子蛋白的方法。这些方法适合地包括提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白。通过至少一个第一柱将该混合物进行过滤，以产生第一柱产物。通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该第一柱产物进行过滤，以产生PEI柱产物，并且回收纯化的重组凝血因子。适合地，该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.5/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点。在实施例中，该重组凝血因子蛋白是凝血素(因子 II)。
[0010]适合地，该混合物是一种来自生物反应器的过滤混合物。在示例性实施例中，该混合物的过滤包括通过一个第一阴离子交换柱的过滤，适合地是一种结合和洗脱过滤。在实施例中，可以通过一个第二阴离子交换柱将该第一柱产物进行过滤，适合地是一种流经过滤。
[0011]在实施例中，在通过聚(乙烯亚胺)柱进行过滤之前，用溶剂/洗涤剂灭活将该第一柱灭活。在实施例中，通过聚(乙烯亚胺)柱的过滤是一种结合和洗脱过滤。适合地，通过疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行过滤，例如以一种结合和洗脱过滤方式。在实施例中，在回收之前，这些方法可以包括纳米过滤。
[0012]在适合的实施例中，该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶，并且包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
[0013]在另外的实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子蛋白(例如，凝血素(因子II))的方法。这些方法适合地包括:提供一种包括该重组凝血因子蛋白的混合物，并且通过至少一个第一阴离子交换柱将该混合物进行过滤(例如，一种结合和洗脱过滤)，以产生第一阴离子交换柱产物。用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第一阴离子交换柱产物灭活，以产生灭活的混合物。适合地，通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该灭活的混合物进行过滤(例如，结合和洗脱过滤)，以产生PEI柱产物，并且通过疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行过滤，以产生HIC产物。在实施例中，然后将该HIC产物进行过滤(例如，纳米过滤)并且回收纯化的重组凝血因子蛋白。在实施例中，该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.8/10,0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点。在某些实施例中，在通过PEI柱进行过滤之前，通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行过滤(例如，流经过滤)，以产生第二阴离子交换柱产物。然后，通过PEI柱将该第二阴离子交换柱产物进行过滤，以产生PEI柱产物。
[0014]适合地，该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶，并且适合地包括小于约0.8/10、0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点。
[0015]在另外的实施例中，提供了用于纯化重组凝血素(因子II)蛋白的方法。这些方法适合地包括:提供一种来自生物反应器、包括该重组凝血素蛋白的过滤混合物；通过一个第一阴离子交换柱将该混合物进行结合和洗脱过滤，以产生第一阴离子交换柱产物；通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行流经过滤，以产生第二阴离子交换柱产物；用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第二阴离子交换柱产物灭活，以产生灭活的混合物；通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱该灭活的混合物进行结合和洗脱过滤，以产生PEI柱产物；通过疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行结合和洗脱过滤，以产生HIC产物；将该HIC产物进行纳米过滤并且回收该纯化的重组凝血素蛋白。
[0016]适合地，该纯化的重组凝血素蛋白(因子II)包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10、0.5/10或0.4/10的Y -羧化谷氨酸位点并且基本上不含凝血酶。
[0017]在另外的实施例中，提供了纯化的重组凝血素蛋白(因子II)。适合地，这些蛋白质包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点并且
基本上不含凝血酶。
[0018]在实施例中，该纯化的重组凝血素在凝血测定中展示出大于约70%的生物活性和/或在自动校准凝血酶曲线(CAT)测定中展示出大于约70%的生物活性。适合地，该蛋白质包括小于约2ng/ml凝血酶。
[0019]参照附图，下文详细地描述了这些实施例的另外的实施例、特征、和优点，连同不同实施例的结构和操作。
[0020]附图简要说明
[0021]图1示出了在此披露的示例性纯化方法的流程图。[0022]图2示出了凝血素的结构域构造，在N端Gla-结构域中示出了 10个Y -羧化谷氨酸(Gla)残基。
[0023]图3示出了在重组凝血素的凝血和CAT生物测定中，相对于相对效力(体外生物活性)的翻译后羧化程度。
[0024]图4示出了根据用聚(PEI)柱进行的过滤的CAT生物测定结果。
[0025]图5A和图5B示出了在重组因子II的片段Kl (5A)和K2 (5B)处的谷氨酸(Gla)的Y-羧化。
[0026]图6示出了重组因子II的片段K13 (N373)的糖谱。
[0027]优选实施方案的详细说明
[0028]应该领会的是在此展示和描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何方式在其他方面限制本申请的范围。
[0029]在此提及的这些公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献特此以其全文形式通过引用而结合，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程度。在此引用的任何参考文件与本说明书的具体传授之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。
[0030]如在本说明书中所使用，单数形式“一个/种(a，an)”以及“该”具体地还涵盖它们所提及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。在此使用术语“约”以意指大约(approximately)、在…的附近(in the region of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”与一个数值范围结合使用时，它通过扩展列举的数值的上限和下限将该范围加以修饰。通常，在此使用术语“约”以将一个数值以高于和低于该规定值的20%的变化加以修饰。``
[0031]在此使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义，除非另外定义。在此参考了本领域的普通技术人员已知的不同方法和材料。阐明重组DNA技术的一般原则的标准参考文献包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人，“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual), ”第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约(1989);考夫曼(Kaufman)等人，编著，“医学生物学中的分子和细胞方法手册(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology in Medicine), ” CRC 出版社，博卡拉顿(Boca Raton) (1995);以及麦克弗森(McPherson),编著,“定向诱变:实用方法(Directed Mutagenesis: A PracticalApproach), ” IRL出版社，牛津(1991 )，将其中每个的披露通过引用以其全文结合在此。
[0032]在实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子蛋白的方法。在适合的实施例中，这些方法包括提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白。通过至少一个第一柱将该混合物进行过滤，以产生第一柱产物。然后，通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该第一柱产物进行过滤，以产生PEI柱产物。然后，从该PEI柱产物中回收纯化的重组凝血因子蛋白。
[0033]在示例性实施例中，该纯化的重组凝血因子蛋白是人类凝血素(因子II)。术语“凝血素”、“因子11”、“重组凝血素”和“重组因子II”贯穿全文可互换地使用。可以使用在此描述的这些方法纯化其他重组凝血因子蛋白并且包括例如因子VI和因子IX。
[0034]如在此使用的，“一种或多种重组凝血因子蛋白”是指使用任何适合的表达系统(包括原核表达系统和真核表达系统两者)、或使用噬菌体展示方法产生的凝血因子肽、多肽或蛋白质(参见，例如道尔(Dower)等人，W091/17271和麦卡弗蒂(McCafferty)等人，W092/01047 ;以及美国专利号5，969，108，将其通过引用以其全文结合在此)。应该理解的是术语“一种或多种蛋白(protein和proteins)”贯穿全文可互换地利用。
[0035]如在此使用，术语“肽”或“多肽”是指优选地由按照α -氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸及其组合的定义顺序连接形成的聚合体。一个氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的键称为酰胺键或肽键。蛋白质是具有多个多肽亚单元的多肽分子。区别是肽通常是短的而多肽/蛋白质通常比氨基酸链长。术语“蛋白质”旨在还涵盖衍生的分子，例如糖蛋白和脂蛋白连同较低分子量的多肽。“氨基酸序列”以及类似术语(例如“多肽”或“蛋白质”)并不意在将表明的氨基酸序列限制在与引用的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
[0036]使用不同的宿主细胞(例如细菌、植物、酵母菌、昆虫以及哺乳动物细胞)生产重组凝血因子蛋白的方法是熟知的。例如，利用大肠杆菌(E.coli)、其他细菌宿主、酵母菌、以及不同的较高级的真核细胞(例如像C0S、CH0、HeLa以及骨髓瘤细胞系)的许多表达系统对于蛋白质的表达而言是可获得的。
[0037]简言之，通常通过将DNA或cDNA可操作地连接至一个启动子(组成型或诱导型)，随后并入表达盒中来实现编码一种或多种所希望的凝血因子蛋白的天然的或合成的核酸的表达。这些盒可以适合用于在原核或真核细胞系中的复制和整合。典型的表达盒包含用于调节编码该蛋白质的DNA的表达的转录终止子和翻译终止子、起始序列、以及启动子。为了获得高水平表达的克隆基因，令人希望的是构建最低包含一个用于指导转录的强启动子、一个用于翻译起始的核糖体结合位点、以及一个转录/翻译终止子的表达盒。对于大肠杆菌而言，这包括一个启动子(例如T7、trp、lac、或λ启动子)、一个核糖体结合位点以及一个转录终止信号。对于 真核细胞而言，控制序列可以包括一个启动子和一个衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒的增强子、以及一个多腺苷酸化序列，并且可以包括剪接供体和受体序列。可以通过熟知的方法将这些盒转移至选择的宿主细胞中，例如对于大肠杆菌而言的氯化钙转化或电穿孔以及对哺乳动物细胞而言的磷酸钙处理、或电穿孔或脂质转染法。可以通过对由包含在这些盒中的基因(例如amp、gpt、neo以及hyg基因)赋予的抗生素抗性来对由这些盒转化的细胞进行选择。
[0038]在实施例中，该重组凝血因子蛋白是如例如在美国专利号7，842，477和7，989，193中生产的人类凝血素(因子II)，将其中每个的披露通过引用以其全文形式结合在此。美国专利号7，842，477和7，989，193披露了用于产生重组凝血素的核酸序列、质粒以及宿主细胞。
[0039]一种示例性纯化方法示于图1中并且在此更加详细地描述。
[0040]如贯穿全文所使用，使用术语“纯化(purify)'I1Mt(Purification)M或纯化的“(purified)”来指代一种工艺,通过该工艺从其他蛋白质或不希望的产物或结构中除去一种或多种所希望的重组蛋白(或从所希望的蛋白质中除去不希望的产物或结构)，这样使得一种或多种所希望的蛋白质至少约75%不含其他蛋白质、产物或结构，至少约80%不含其他蛋白质、产物或结构，至少约90%不含其他蛋白质、产物或结构，更适合地是至少约95%不含其他蛋白质、产物或结构，并且最适合地是至少约98%不含其他蛋白质、产物或结构。
[0041]贯穿全文描述的这些纯化方法适合地从一种或多种最终的、所希望的重组蛋白中除去例如不想要的宿主细胞蛋白(HCP)结构以及其他结构(例如，DNA,RNA),连同不想要的、不希望的或非最优形式的重组凝血因子蛋白。
[0042]如在此使用，使用术语“过滤”来意指将一种包括一种或多种重组蛋白的混合物与过滤介质接触放置，这样使得通过过滤介质除去该溶液或混合物中的不希望的或不想要的组分。包括该重组蛋白的一种“混合物”通常还可以包括缓冲液或其他液体培养基中的不同HCP、核酸、其他蛋白质(包括该蛋白质的重组形式)等。
[0043]在实施例中，重组凝血因子蛋白的这些混合物是来自生物反应器的过滤混合物的产物，或可以是生物反应器或用来产生该重组凝血因子蛋白的其他方法的直接产物。
[0044]用于在此处披露的这些方法中使用的示例性过滤介质包括不同的滤纸、编织纤维、基于聚合体的柱过滤介质、琼脂糖、右旋糖酐以及天然的过滤介质、连同本领域已知的其他介质。适合地，该过滤介质是基于聚合体的过滤介质，连同基于琼脂糖或右旋糖酐的介质，包括例如SEPHAROSE?、SEPHADEX?以及聚(乙烯亚胺)过滤介质。
[0045]在示例性实施例中，通过一个第一阴离子交换柱(即，已经使用琼脂糖过滤介质制备的色谱柱或过滤柱)将包括重组凝血因子的混合物进行过滤。适合的阴离子交换柱的实例包括Q SEPHAR0SETM柱，例如QSEPHAR0SE?快流柱(Q SEPHAROSE?Fast Flow column)，它包括具有在约45-165 μ m范围内的珠粒大小的高度交联4%琼脂糖球形珠粒(GE医疗保健公司(GE Healthcare)，皮斯卡塔韦，新泽西州)。制备此类柱的方法，包括利用的介质的量、用于支持并制备这些柱的装置，连同利用这些柱过滤混合物的方法是本领域普通技术人员熟知的。此类方法适合地包括向柱中加入预定体积的混合物，加入用于平衡或洗涤该柱的缓冲液或其他介质，并且以预定流速使缓冲液或洗涤介质流过该柱。
[0046]在实施例中，通过一个第一阴离子交换柱、随后是一个第二阴离子交换柱将该混合物进行过滤。适合地，利用的第一和第二阴离子交换柱是QSEPHAR0SE?快流柱。在实施例中，还可以利用额外的阴离子交换柱。例如，可以通过两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个等阴离子交换`柱将该混合物进行过滤。也可以使用额外类型的柱或过滤介质以将包括重组凝血因子蛋白的混合物进行初始过滤。
[0047]取决于用于过滤的柱的类型，产生的过滤产物在此被称为“产物”、“柱产物”、“阴离子交换柱产物”或“PEI柱产物”。通过一个或多个阴离子交换柱的过滤可以是流经过滤或结合和洗脱过滤。如在此使用，“流经”过滤是指以下过滤，其中向柱中加入一种混合物，适合地随后加入缓冲液或洗涤溶液,并且然后使该混合物通过该柱。产生的过滤产物(“一种柱产物”)是作为未结合产物而通过该柱的材料。任何不想要的或不希望的组分(例如，DNA、蛋白质、细胞产物等)留在该柱上。
[0048]如在此使用，“结合并洗脱”过滤(filtration或iltering)、或“结合并洗脱”是指以下柱过滤，其中向柱中加入该混合物，并且适合地随后是洗涤或平衡缓冲液。所希望的材料最初被留在该柱上(即，与该柱介质结合或被它保留)，同时不想要的或不希望的组分通过该柱。然后，通过用适合的缓冲液洗脱将所希望的产物从该柱上洗脱(即，起初与该柱结合的产物)。在此类实施例中，柱产物是在除去通过该柱并且不被保留的该混合物中的不想要的或不希望的组分之后回收的材料。
[0049]在示例性实施例中，通过该第一阴离子交换柱(例如，SEPHAROSE?柱)将该混合物进行过滤包括结合和洗脱过滤，以产生阴离子交换柱产物。适合地，如果使用一个第二阴离子交换柱将该混合物进行过滤，那么通过该第二阴离子交换柱(例如，SEPHAROSE?)的过滤包括流经过滤。如果希望的话，通过阴离子交换柱的任何额外的过滤可以包括结合和洗脱过滤或流经过滤。
[0050]在实施例中，这些方法进一步包括用溶剂/洗涤剂灭活使该第一柱产物(即，第一阴离子交换柱的产物或在利用两个阴离子交换柱的情况下的第二阴离子交换柱的产物)灭活，以产生灭活的混合物。适合地，这种灭活发生在例如用聚(乙烯亚胺)柱的任何进一步过滤之前。适合地，灭活包括使用洗涤剂以中断病毒脂质包衣中的分子之间的相互作用。适合地，使用创造以下环境的一种溶剂，该环境中脂质包衣与该洗涤剂之间的聚集反应迅速发生。示例性的洗涤剂和溶剂在本领域中是已知的，并且包括例如洗涤剂Triton-XlOO。
[0051]适合地，通过至少一个聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该无活性的混合物进行过滤，以产生PEI柱产物。在适合的实施例中，通过聚(乙烯亚胺)柱将灭活的混合物进行过滤包括结合和洗脱过滤。
[0052]用于在此处描述的这些方法中使用的聚(乙烯亚胺)柱的实例包括BAKERB0ND?XWP500Poly PE1-35 (聚(乙烯亚胺))柱(PolyPEI)。此类示例性柱包括结合在疏水聚合体(AVANT0R?，菲利普斯堡，新泽西州)上的聚(乙烯亚胺)(PEI )。
[0053]在实施例中，这些方法进一步包括通过一个或多个阴离子交换柱(适合地是苯基SEPHAROSE? 高效柱(Phenyl SEPHAR0SE?High Performance column))将 PEI 柱产物进行过滤。在实施例中，通过疏水作用柱将该PEI柱产物进行过滤包括结合和洗脱过滤。在PEI过滤之后，还可以使用其他柱过滤来在回收之前进一步纯化该重组凝血因子蛋白。
[0054]在适合的实施例中，在回收该纯化的重组凝固蛋白之前，将该混合物进行纳米过滤。在实施例中，纳米过滤可以发生在通过PEI柱的过滤之后(即，将PEI柱产物进行纳米过滤)，并且在其他实施例中，纳米过滤可以发生在通过疏水作用柱(HIC)或其他适合的柱将PEI柱产物进行过滤之后(即，将HIC产物进行纳米过滤)。用于纳米过滤的示例性方法和用于纳米过滤的过滤介质在本领域中是熟知的，并且适合地利用具有近似约Inm的孔径大小的膜。纳滤膜适合地具有小于1`000原子质量单位(道尔顿)的分子量截留(MWC0)。
[0055]在此描述的这些方法适合地产生基本上不含凝血酶的重组凝固蛋白，适合地是凝血素(因子II)。如在此描述，从重组凝血素中除去凝血酶(或将存在的凝血酶的量降至适合的水平)增加最终蛋白产品的安全性。如在此使用，基于蛋白产物的总质量，使用基本上不含凝血酶来指示最终产品包括小于约20%凝血酶，适合地是小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约1%、小于约0.5%、小于约0.1%、小于约0.05%、小于约0.01%、小于约0.005%或小于约0.001%凝血酶。适合地，最终产品中的凝血酶的量小于约10ng/ml凝血酶，更适合地是小于约9ng/ml凝血酶、小于约8ng/ml凝血酶、小于约7ng/ml凝血酶、小于约6ng/ml凝血酶、小于约5ng/ml凝血酶、小于约4ng/ml凝血酶、小于约3ng/ml凝血酶、小于约2ng/ml凝血酶、或小于约lng/ml凝血酶。
[0056]获得大量的全功能重组人类凝血因子的主要障碍之一在于存在于因子I1、因子VI1、因子IX、因子X和蛋白C中的Gla-结构域。这一结构域包含通过加入羧基来翻译后修饰的谷氨酸残基。这些因子的产生被以下事实阻碍，它们的过度表达产生低羧化的，并且因此无活性的蛋白质。Gla修饰是一种称为Y-谷酰基羧化酶(GGCX)的维生素K依赖性酶的作用的结果(参见例如，W088/03926 ;武(胃11)等人《科学》(Science)254(5038):1634-1636, 1991)。
[0057]如图2所示，重组凝血素在N端结构域包含10个“Gla-残基”。这些是影响该蛋白质的生物活性的Y-羧化谷氨酸(Gla)残基。这些残基被认为螯合Ca2+离子，这介导蛋白质与磷脂膜的结合，这是凝血素激活为凝血酶的先决条件。
[0058]对于人类因子II (凝血素)而言，至少十分之八的Glu残基必须被正确修饰，以获得全功能凝血素(马尔霍特拉(Malhotra)等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)260:279-287，1985 ;希格斯(Seegers)和瓦尔茨(Walz)
[0059]‘凝血素和其他维生素K蛋白’('Prothrombin and other vitamin K proteins' ),CRC出版社，1986)。为了获得高产量水平的rhFII，已经使用若干不同系统(例如CHO细胞、BHK细胞、293细胞以及牛痘病毒表达系统)进行了大量努力(乔根森(Jorgensen)等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.) 262:6729-6734, 1987 ;拉索(Russo)等人，《生物技术和应用生物化学》(Biotechnol Appl Biochem)14 (2): 222-233，1991 ;费舍尔(Fischer)等人，《生物技术杂志》(J Biotechnol) 38 (2): 129-136，1995 ;赫里斯卡(Herlitschka )等人《蛋白表达与纯化》(Protein Expr.Purif.) 8 (3): 358-364，1996 ;拉索(Russo)等人，《蛋白表达与纯化》(Protein Expr.Purif.)10:214-225, 1997)。用于产生重组因子II的示例性方法例如披露于美国专利号7，842，477和7，989，193中，将其披露通过引用以其全文结合在此。
[0060]根据在此描述的这些方法纯化的重组凝血因子蛋白(适合地是凝血素(因子II))适合地包括小于约十分之一(1/10)的丢失Y-羧化的谷氨酸(Gla)位点。也就是说，当考虑总蛋白样品的平均值时，在该蛋白质中的10个谷氨酸位点中，适合地小于1/10的Gla位点是非Y-羧化的，即平均小于1/10的Y-羧化谷氨酸(Gla)位点丢失。在实施例中，在此描述的这些方法适合地提供了包括在样品的平均值上，小于约0.9/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点，更适合地是小于约0.8/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.7/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.6/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.5/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.3/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小`于约0.2/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.2/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、或没有丢失Y-羧化谷氨酸位点的凝血素。
[0061]如在此描述，诸位发明人已经发现披露的方法产生基本上不含凝血酶以及还具有小于约0.5/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点的纯化重组凝血因子蛋白，包括例如凝血素(因子II)。这些纯化的重组凝固蛋白的生物活性测试证明丢失Y-羧化谷氨酸位点的数目的减少与生物活性的增加相关，如在凝血和CAT测定中所测量的(参见凝血和CAT生物活性测定的实例中的描述)。参见图3。如在实例中所描述，当与通过测定表明可测量的100%生物活性的参照标准相比时，这一相关性提供了这些纯化的蛋白质的大于约70%，适合地是大于约75%、大于约80%、大于约85%、大于约90%、大于约95%、或约100%生物活性的生物活性。
[0062]虽然不希望被关于活性增加的原因的任何理论所束缚，相信通过经由聚(PEI)柱的过滤的重组凝固蛋白的纯化提供包括减少数目的丢失Y-羧化谷氨酸位点的重组凝血因子蛋白(即，小于0.5的丢失Y -羧化的谷氨酸位点)。
[0063]在另外的实施例中，提供了用于纯化重组凝血因子的额外的方法。适合地，这些方法包括提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白。通过至少一个第一阴离子交换柱将该混合物进行过滤，以产生第一阴离子交换柱产物。用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第一阴离子交换柱产物灭活，以产生灭活的混合物。通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该灭活的混合物进行过滤，以产生PEI柱产物。通过疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行过滤，以产生HIC产物。将HIC产物进一步过滤。然后回收纯化的重组凝血因子蛋白。
[0064]适合地，尽管这些方法可以容易地延伸至其他重组凝血因子蛋白，但该重组凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
[0065]在示例性实施例中，包括重组凝血因子蛋白的起始混合物是一种来自生物反应器的过滤混合物。
[0066]在实施例中，通过至少一个第一阴离子交换柱进行过滤包括结合和洗脱过滤，并且可以进一步包括通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行过滤。还可以利用额外的阴离子交换柱。适合地，通过一个第二阴离子交换柱进行过滤包括流经过滤。
[0067]在示例性实施例中，通过PEI过滤器将该阴离子交换柱产物进行过滤包括结合和洗脱过滤。PEI柱产物的进一步过滤还适合地包括疏水作用柱(HIC)。在实施例中，HIC产物的过滤包括纳米过滤。
[0068]在回收重组因子II之后，在此描述的这些方法还可以包括额外的过滤，包括例如最终产物的超滤或渗滤。
[0069]如贯穿全文所描述，这些纯化方法适合地产生基本上不含凝血酶的重组凝血素蛋白。另外，重组凝血因子蛋白适合地包括小于约1/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点，更适合地是小于约0.9/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.8/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.7/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.6/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.5/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.3/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.2/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.2`/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、或没有丢失Y-羧化谷氨酸位点。
[0070]在另外的实施例中，提供了用于纯化重组凝血素(因子II)蛋白的额外的方法。图1示出了一种示例性方法的流程图100。适合地，提供了一种来自生物反应器、包括该重组凝血素蛋白的过滤混合物102。在实施例中，这一混合物可以是生物反应器收获的深层过滤的产物。
[0071]通过一个第一阴离子交换柱(适合地是Q SEPHAROSE?快流柱)将该混合物进行过滤104，使用结合和洗脱过滤，以产生第一阴离子交换柱产物。通过一个第二阴离子交换柱(适合地是Q SEPHAROSE?快流柱)将该第一阴离子交换柱产物进行过滤106，适合地使用流经过滤，以产生第二阴离子交换柱产物。在108中，用溶剂/洗涤剂病毒灭活将第二阴离子交换柱产物灭活，以产生灭活的混合物。
[0072]然后，通过聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该灭活的混合物进行过滤110，适合地使用结合和洗脱过滤，以产生PEI柱产物。然后，通过疏水作用柱(例如苯基SEPHAROSE?高效柱)将该PEI柱产物进行过滤112，适合地使用结合和洗脱过滤，以产生HIC产物。然后，将该HIC产物进行纳米过滤114，并且回收该纯化的重组凝血素蛋白116。
[0073]如在此所描述，适合地，该纯化的重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶并且包括小于约0.5/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点，更适合地是小于约0.4/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点。[0074]在实施例中，在此描述的这些方法由引用步骤组成，这样使得不允许超出引用的那些的额外插入步骤。在另外的实施例中，在此描述的这些方法基本上由引用步骤组成。在此类实施例中，加入改变重组蛋白的物理性质或化学性质的步骤被认为是此类方法的实质性变更并且因此从基本上由引用步骤组成的这些方法中排除。
[0075]应该理解的是在此描述的这些方法中的过滤顺序和数目可以被修改，同时仍然取得具有所希望的生物活性、低水平的凝血酶、以及减少水平的丢失Y-羧化谷氨酸位点的所希望的纯化重组凝血因子蛋白。
[0076]在另外的实施例中，提供了一种纯化的重组凝血素蛋白(因子II)。适合地，该纯化的重组因子II蛋白包括小于约1/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点并且基本不含凝血酶。
[0077]适合地，该纯化的重组因子II蛋白包括小于约0.9/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点，更适合地是小于约0.8/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、小于约0.7/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.6/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.5/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.3/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.2/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点、小于约0.1/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点、或没有丢失Y-羧化谷氨酸位点。
[0078]如在此描述，基于蛋白产物的总质量，重组因子II蛋白适合地包括小于约20%的凝血酶，适合地是小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约1%、小于约0.5%、小于约0.1%、小于约0.05%、小于约0.01%、小于约0.005%或小于约0.001%的凝血酶。适合地，该纯化的重组因子II蛋白包括小于约10ng/ml凝血酶,更适合地是小于约9ng/ml凝血酶、小于约8ng/ml凝血酶、小于约7ng/ml凝血酶、小于约6ng/ml凝血酶、小于约5ng/ml凝血酶、小于约4ng/ml凝血酶、小于约3ng/ml凝血酶、小于约2ng/ml凝血酶、或小于约lng/ml凝血酶。
[0079]在实施例中，与参照标准相比，该纯化的重组凝血素蛋白在凝血测定(clot测定)中展示出大于约50%的生物活性。适合地，该纯化的重组凝血素蛋白展示出凝血测定中的大于约60%的生物活性，更适合地是凝血测定中的大于约70%的生物活性、凝血测定中的大于约75%的生物活性、凝血测定中的大于约80%的生物活性、凝血测定中的大于约85%的生物活性、凝血测定中的大于约90%的生物活性、或凝血测定中的大于约95%的生物活性。
[0080]在示例性实施例中，与参照标准相比，该纯化的重组凝血素蛋白在自动校准凝血酶曲线(CAT)测定中展示出大于约50%的生物活性。适合地，该纯化的重组凝血素蛋白展示出CAT测定中的大于约60%的生物活性，更适合地是CAT测定中的大于约70%的生物活性、CAT测定中的大于约75%的生物活性、CAT测定中的大于约80%的生物活性、CAT测定中的大于约85%的生物活性、CAT测定中的大于约90%的生物活性、或CAT测定中的大于约95%的生物活性。
[0081]在另外的实施例中，该纯化的因子II蛋白在凝血测定(clot测定)中展示出大于约50%的生物活性并且在自动校准凝血酶曲线(CAT)测定中展示出大于约50%的生物活性。
[0082]还提供了通过在此描述的任何工艺制备的纯化的重组凝血素蛋白(因子II)。适合地，这些因子II蛋白包括小于约0.5/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点，并且基本不含凝血酶。
[0083]相关领域的普通技术人员容易清楚的将是在不背离任何这些实施例的范围的情况下，可以对在此描述的这些方法和应用做出其他适合的修改和适配。以下这些实例仅仅出于说明的目的被特此包括并不旨在是限制性的。
[0084]实例
[0085]实例1:与柱色谱法相关的材料和方法
[0086]以下是与贯穿全文描述的柱色谱法相关的示例性材料和方法。
[0087]Q SEPHAROSE?快流结合和洗脱色谱法(Q B&E)
[0088]在加载之前，用25mM柠檬酸盐、30mM氯化钠(pH6.0)平衡Q SEPHAROSE?快流柱(GE医疗保健公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)(QFF B&E)。将条件培养基的pH调节至pH6.0并且以200cm/h的线性速度在4-11克的产物/L的树脂之间进行加载。然后，使该柱重新平衡并且用25mM柠檬酸盐、173mM氯化钠(pH6.0)进行洗涤。洗涤之后，将该柱用25mM柠檬酸盐、308mM氯化钠(pH6.0)进行一步洗脱。
[0089]Q SEPHAROSE? 快流流经色谱法(Q FT)
[0090]以流经模式操作Q SEPHAROSE?快流柱。将该柱在25mM柠檬酸盐、400mM氯化钠(pH6.0)中进行平衡并且然后以200cm/h的线性速度加载产物。加载量典型地是在2_6克蛋白质/L树脂之间。加载之后，将该柱用平衡缓冲液进行洗涤，以收集未结合的产物。
[0091]BAKERB0ND?XWP500PolyPE1-35 结合和洗脱色谱法(PolyPEI)
[0092]将BAKERB0ND?XWP500Poly PE1-35 (聚(乙烯亚胺))柱(包括结合在疏水聚合体上的聚(乙烯亚胺)(PE I)的柱(PolyPEI)) (AVANT0R?，菲利普斯堡，新泽西州)用125mMHEPES、4% (w/w)柠檬酸盐、0.5M氯化钠(pH6.5)进行预平衡，并且然后用25mM HEPES、4%(w/w)柠檬酸盐、0.5M氯化钠(pH6.5)进行平衡。然后，以140cm/h用5_12克蛋白质/L树脂加载该柱。将该柱用平衡缓冲液进行洗涤并且然后用25mM HEPES、4% (w/w)柠檬酸盐、
1.04M氯化钠(pH6.5)进行洗涤。然后，以从IM至1.6-2.1M氯化钠的线性梯度洗脱产物。
[0093]苯基SEPHAROSE?高效结合和洗脱色谱法(苯基HP )
[0094]将该柱用25mM HEPES、4% (w/w)柠檬酸盐、IM氯化钠(pH6.5)进行平衡。将来自PEI柱的洗脱物调节至IM硫酸钠并且以lOOcm/h在1-12克蛋白质/L树脂之间进行加载。使该柱重新平衡并且然后用25mM HEPES、0.4% (w/w)柠檬酸盐、0.75M硫酸钠(pH6.5)进行洗涤。然后，以从0.75M至OM硫酸钠的梯度洗脱该柱。
[0095]羟基磷灰石结合和洗脱色谱法(CHT )
[0096]将该柱用处于pH6.5、包含低水平的磷酸钠(10_50mM)和变化水平的氯化钠(0.1-1M NaCl)的缓冲液进行平衡。以lOOcm/h从5_10克蛋白质/L树脂加载该柱。加载之后，将该柱用低磷酸盐缓冲液和变化浓度的氯化钠进行平衡。然后，将产物用处于PH6.5、递增的线性梯度的磷酸盐浓度、直到200-400mM磷酸钠进行洗脱。
[0097]实例2:凝血素的纯化
[0098]将重组人类凝血素(因子II) CrhFII)蛋白在CHO细胞中进行表达并且用适合地包括四个色谱法步骤、一个溶剂/洗涤剂病毒灭活步骤、一个纳米过滤步骤、以及用于最终配制的超滤/渗滤步骤的工艺进行纯化。图1中的原理图给出了一个示例性纯化工艺的概观。已经将图1所示的rhFII纯化方法从小试规模按比例进行了放大以纯化50L生物反应器和500L生物反应器。
[0099]表1概述了来自一个代表性50L纯化的相关柱和收率数据。由于被分析的不同样品的复杂性质，利用三个浓缩方法来评估柱性能。在280nm处测量的吸光度的总蛋白浓度给出了一个样品中的总蛋白的量度。它是最简单的方法，并且因为这些样品是相对纯的(即具有低水平的HCP的无色样品)，所以在Q SEPHAROSE?快流流经柱(Q FT)之后将其用于样品。第二个更加费时的方法是RP-HPLC方法，可以使用该方法来测量任何过程中间样品中的rhFII的浓度。主要针对粗样品(来自前两个柱的加载物和池)来选择这一浓缩方法，因为它给出了被加载在早期的柱上的rhFII的质量的量度。用于测量rhFII纯化工艺的性能而利用的终浓度测定是测量活性rhFII的浓度的凝血酶原酶测定。
[0100]表1:来自50L纯化的柱性能概述
【权利要求】
1.一种用于纯化一种重组凝血因子蛋白的方法，该方法包括: a)提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白； b)通过至少一个第一柱将该混合物进行过滤，以产生一种第一柱产物； c)通过一个聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该第一柱产物进行过滤，以产生一种PEI柱产物；并且 d)回收该纯化的重组凝血因子蛋白， 其中该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
2.如权利要求1所述的方法，其中该重组凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该混合物是一种来自生物反应器的过滤混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在b)中的过滤包括通过一个第一阴离子交换柱的过滤。
5.如权利要求4所述的方法，其中通过该第一阴离子交换柱的该过滤包括一种结合和洗脱过滤。
6.如权利要求4或 权利要求5所述的方法，其中在b)中的该过滤进一步包括通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行过滤，以产生一种第二阴离子交换柱产物。
7.如权利要求6所述的方法，其中通过该第二阴离子交换柱的该过滤包括一种流经过滤。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，在c)中的该过滤之前，进一步包括用溶剂/洗涤剂灭活将该第一柱产物和/或该第二柱产物灭活。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在c)中通过一个聚(乙烯亚胺)柱将该第一柱产物进行过滤包括一种结合和洗脱过滤。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，进一步包括通过一个疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行过滤。
11.如权利要求10所述的方法，其中该PEI柱产物的该过滤包括一种结合和洗脱过滤。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，在d)中的该回收之前，进一步包括纳米过滤。
13.如权利要求2所述的方法，其中该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
15.一种用于纯化一种重组凝血因子蛋白的方法，该方法包括: a)提供一种混合物，该混合物包括该重组凝血因子蛋白； b)通过至少一个第一阴离子交换柱将该混合物进行过滤，以产生一种第一阴离子交换柱产物； c)用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第一阴离子交换柱产物灭活，以产生一种灭活的混合物； d)通过一个聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该灭活的混合物进行过滤，以产生一种PEI柱产物； e)通过一个疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行过滤，以产生一种疏水作用柱(HIC)产物； f)将该HIC产物进行过滤；并且 g)回收该纯化的重组凝血因子蛋白， 其中该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或.0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
16.如权利要求15所述的方法，其中该重组凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中该混合物是一种来自生物反应器的过滤混合物。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中在b)中通过至少一个第一阴离子交换柱进行过滤包括一种结合和洗脱过滤。
19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中在b)中的该过滤进一步包括通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行过滤。
20.如权利要求19所述的方法，其中通过一个第二阴离子交换柱的该过滤包括一种流经过滤。
21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中在d)中的该过滤包括一种结合和洗脱过滤。
22.如权利要求15-21中任一项所述的方法，其中在e)中的该过滤包括一种结合和洗脱过滤。
23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中在f)中的该过滤包括纳米过滤。
24.如权利要求16所述的方法，其中该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
25.如权利要求15-24中任一项所述的方法，其中该纯化的重组凝血因子蛋白包括小于约0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
26.一种用于纯化一种重组凝血素(因子II)蛋白的方法，该方法包括: a)提供一种来自生物反应器的过滤混合物，该混合物包括该重组凝血素蛋白； b)通过一个第一阴离子交换柱将该混合物进行结合和洗脱过滤，以产生一种第一阴离子交换柱产物； c)通过一个第二阴离子交换柱将该第一阴离子交换柱产物进行流经过滤，以产生一种第二阴离子交换柱产物； d)用溶剂/洗涤剂病毒灭活将该第二阴离子交换柱产物灭活，以产生一种灭活的混合物； e)通过一个聚(乙烯亚胺)(PEI)柱将该灭活的混合物进行结合和洗脱过滤，以产生一种PEI柱产物； f)通过一个疏水作用柱(HIC)将该PEI柱产物进行结合和洗脱过滤，以产生一种HIC产物； g)将该HIC产物进行纳米过滤；并且 h)回收该纯化的重组凝血素蛋白， 其中该纯化的重组凝血素蛋白(因子II)包括小于约0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
27.如权利要求26所述的方法，其中该重组凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中该纯化的重组凝血因子包括小于约0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丢失Y -羧化的谷氨酸位点。
29.一种纯化的重组凝血素蛋白(因子II)，包括小于约0.5/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点并且基本不含凝血酶。
30.如权利要求29所述的纯化的重组凝血素蛋白，包括小于约0.4/10的丢失Y-羧化的谷氨酸位点。
31.如权利要求29或权利要求30所述的纯化的重组凝血素蛋白，其中该蛋白在凝血测定中展示出大于约70%的生物活性。
32.如权利要求29-31中任一项所述的纯化的重组凝血素蛋白，其中该蛋白在自动校准凝血酶曲线(CAT)测定中展示出大于约70%的生物活性。
33.如权利要求29-32中任一项所述的纯化的重组凝血素蛋白，其中该蛋白包括小于约2ng/ml凝血酶。
34.根据权利要求1-28中任一项所述的方法制备的一种纯化的重组凝血素蛋白(因子II)，包括小于约0.5/10的丢 失Y-羧化的谷氨酸位点并且基本不含凝血酶。
【文档编号】C12P21/02GK103814137SQ201280043201
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2011年9月6日
【发明者】A·亨德, 王向阳, T·派斯特, M·温得勒, J·王, K·凯里, R·斯特罗斯, J·瓦格斯 申请人:米迪缪尼有限公司