预后方法
【专利摘要】本发明涉及用于测定以下至少之一或其组合的预后方法：首次治疗时间、对治疗的反应或呈现包括或特征为端粒缩短的疾病的患者的总体存活，所述预后方法包括评价可以检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度，然后测定基因融合范围(即，可以检测到端粒端对端融合事件时的所述平均端粒长度以下的范围)中的平均端粒长度，以及随后将所述基因融合范围中的平均端粒长度用作预后指标。
【专利说明】预后方法
[0001]本发明涉及用于测定以下至少之一或其组合的新颖的预后方法:首次治疗时间、对治疗的反应或呈现包括或特征为端粒缩短的疾病的患者的总体存活，所述预后方法包括评价可以检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度，然后测定基因融合范围(即，可以检测到端粒端对端融合事件时的所述平均端粒长度以下的范围)中的平均端粒长度，以及随后将所述基因融合范围中的平均端粒长度用作预后指标。本发明还涉及所述方法在治疗方案中的用途。
[0002]发明背景
[0003]慢性淋巴细胞白血病(CLL)是最常见的成人白血病，其特征在于无免疫活性的单克隆CD5+B-淋巴细胞的积聚。CLL具有非常多样化的临床过程，并且存活为几个月至几十年。治疗策略根据病期和疾病进展而变化，并且包括化学疗法、放射疗法、单克隆抗体疗法或骨髓移植，并且早期患者通常不接受治疗。具有该疾病的侵袭形式的患者需要早期临床介入，而具有更良性形式的患者仅需要监测在可以给予合适的治疗时的疾病进展。在后一方面，已经表明早期CLL介入不改善存活率。因此，将呈现长达30年不太可能危及生命的疾病的一些个体暴露于高度危险的化学治疗药物是不适当的。因此，期望用于区分疾病的各种形式的可靠方法。尽管Binet和Rai分期体系是分期组之间临床结果的可靠预测因子，但它们不能确定每一病期内的良好和不良的预后子集。因为大多数患者在诊断时呈现早期疾病，所以已开发了许多实验室测试来尝试并预测这些患者的临床过程，最显著的是免疫球蛋白可变重链体细胞突变状态、CD38表达、T-细胞酪氨酸激酶(ZAP-70)表达和细胞遗传异常。未突变IGHV基因、高⑶38表达、高ZAP-70表达以及存在17p和Ilq缺失均与不良预后有关。开发这类实 验室数据以提供预后测试描述于US 2008/0026383。然而，这些独立的标志物无一可以单独提供明确的预后信息，并且当组合使用时仅提供合理的预后预测。
[0004]乳腺癌是另一种在西方世界中非常常见的肿瘤类型。乳腺肿瘤可以被手术移除，但肿瘤的残留物仍可导致疾病复发。因此，患者进行具有毒副作用的佐剂治疗，并且怀疑许多患者接受对其无益处的治疗。常用方法是相对于复发风险来调整化学疗法的侵袭性。与标准化学疗法相比，侵袭性化学疗法与更大的益处有关，但还与更加急性且长期的毒性作用如白血病和心衰有关。如同CLL 一样，由此对允许乳腺癌手术之后的预后的标志物存在需求。基因表达阵列已用于确定指示预后的具体基因表达标签；这为淋巴结阴性乳腺癌患者的总体存活提供高达3.4的风险比。基因表达阵列属于目前可用于乳腺癌的预后的最佳标志物。
[0005]骨髓增生异常综合征(MDS)是特征在于破坏造血作用最终导致骨髓衰竭的骨髓造血干细胞病症的异质集合。该病况先前称为“前白血病”，因为三分之一的患者向急性髓性白血病(AML)发展。因此，临床需要将向AML发展并由此可能需要治疗的患者与显示疾病的更良性形式的那些患者进行区分。与CLL 一样，MDS特征在于大规模不平衡染色体重排；这些类型的重排与端粒功能失调相一致。此外，有在MDS中端粒侵蚀的证据，并且端粒酶RNA组分的突变可使儿童患有MDS。
[0006]由上述推断，存在一系列疾病，对其的相对早期预测会是有利的。此外，这些疾病中的许多疾病特征在于基因异常，具体地为端粒缩短。这些疾病包括阿尔茨海默病\脑梗塞\心脏病\慢性HIV感染\慢性肝炎\皮肤病\包括溃疡性结肠炎在内的慢性炎性肠疾病\贫血\动脉粥样硬化\巴雷特食管症以及包括癌前病况在内的癌症^因此，本发明对所有这些疾病具有应用。
[0007]端粒是由重复DNA序列组成的核蛋白结构，其封闭线性真核染色体的末端、保护它们免于劣化或与邻近染色体融合。在DNA复制期间，不能加工染色体的末端，由此，在细胞分裂期间，会损失染色体末端；然而，在细胞分裂的每一阶段中，端粒通过自身被消耗而防止这种情况，基本“封闭”染色体。然而，通过逆转录端粒酶在诸如生殖细胞、干细胞和某些白血球的某些细胞类型中保持端粒末端，所述端粒酶催化以RNA为模板添加端粒重复序列。端粒长度是端粒功能的关键因素，并且已经表明短的功能失调端粒可以在小鼠模型中造成基因组不稳定性和肿瘤生成。此外，已表明端粒酶失调造成肿瘤发生。此外,体细胞中端粒的损失已与防止基因组不稳定性和癌症的复制性衰老相关。相反地，已表明恶性细胞可以绕过该衰老，并通过异常活化端粒酶产生的端粒延伸而被永生化。
[0008]与端粒生物学在肿瘤进展中的作用相一致，现存在大量的证据表明端粒长度可以在包括CLL在内的 许多人类恶性肿瘤中提供预后信息2Λ然而，在当前可得的技术缺少分辨，并且这已阻碍了将端粒检测转换成临床实践的进展。例如，已表明端粒功能失调在乳腺癌进展期间的推定作用1(1，并且已表明低分辨端粒长度提供了有限的预后信息η’12。这些技术的关键问题是它们基于DNA探针与端粒重复单元的杂交。因此，当端粒变得更短时，存在更少的探针靶标，由此短端粒是不可检测的13，14。这是重要的，因为最短的端粒变为功能失调并且容易遭受融合，导致基因组不稳定性，这可以造成人类癌症进展15_17。还已描述基于Q-PCR的方法用于评估端粒重复内含物(W02004068110 US)，这些允许高通量分析。然而，还未建立用于检测短端粒(<4kb)的这些方法的线性关系18，这与所报道的高达28%的高CV值相结合，使Q-PCR方法不适于检测短端粒和将该信息用作用于临床决策的预后工具19。迄今，使用现有的低分辨技术的端粒分析不是提供充分信息的预后标志物。
[0009]为解决该问题，我们先前已开发了单分子技术，其允许我们检测极度缩短的端粒2°，21，并表征端粒端对端融合lfU7。单端粒长度分析(STELA)允许在具体染色体末端处完全分辨端粒长度，包括在可发生端粒端对端融合的长度范围内的端粒16，2°。因此，其允许检测潜在的功能失调并可以融合的短端粒。在该研究的一部分中，选择XpYp端粒用于STELA，因为与13q、6q、17p和Ilq相反，没有证据表明该端粒尤其在CLL病理学中损失。此外，我们以前的数据表明XpYp端粒长度是全基因组端粒长度的代表2°’22，并且表达端粒酶的细胞可均质化不同染色体末端的端粒长度15’23。使用这些工具，我们已证明短端粒、端粒端对端融合事件与疾病(诸如但不限于CLL、乳腺癌和MDS)中基因组不稳定性之间的关联。
[0010]在我们的研究中，我们已使用端粒长度和融合分析来提供端粒功能失调的定义，然后我们将该定义用作预后工具。具体地，对于所选的染色体，我们已确定可以检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度，实例在表1中示出。使用融合事件检测的这种上限，我们已可以表明基因融合范围(即，<上限)内的平均端粒长度提供了对以下至少之一为高度预后的生物学参数:首次治疗时间、对治疗的反应或总体存活。此外，在首次治疗时间、对治疗的反应或总体存活方面，该生物学参数还可以用于提供早期疾病患者的显著预后分辨；实际上，处于更长端粒子集中的患者在10年时表现出96%的总体存活率。因此，可以检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度表示端粒变为功能失调并能融合时的平均端粒长度的指征。对个体端粒长度以及端对端融合事件可能性的认知使得可以预测个体处于疾病进展何处，由此确保个体接受与其需要相对应的治疗；恰到好处。此外，评价个体端粒的长度的测试可以周期重复以监测疾病进展。
[0011]我们已可以表明通过施用基于端粒功能失调的端粒长度阈值，我们惊讶地可以转换端粒长度分析的预后能力。因此，与先前使用的低分辨端粒长度分析的报道(即，上述测量4kb以上的端粒长度的那些方法)相反，我们的数据表明高分辨端粒长度分析(即，使用例如STELA方法，或可测量全范围端粒长度(从一个TTAGGG重复序列至超过25kb的端粒长度)的任何其他方法)与端粒功能失调的定义或我们的生物学参数的认知的结合，足以在包括癌症在内的各种特征为端粒缩短的疾病中精确预后。
[0012]发明陈述
[0013]根据本发明的第一方面，提供了用于测定包括或特征在于端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括:
[0014]i)在来自呈现相同疾病的多个个体的组织样品中，使用高分辨端粒长度分析测定可检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度，从而确定表示端粒变为功能失调并能融合时的平均端粒长度的指征的阈值数；
[0015]ii)通过采集平均端粒长度小于所述阈值的那些样品并对那些样品的平均端粒长度取均值，从而测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的预后平均端粒长度；
[0016]iii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者
[0017]iv)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体`存活是良好的。
[0018]因此，本发明涉及允许对特定疾病或典型地对恶性肿瘤定义临界端粒参数的特定方法的确定。这些参数是在上述i)中的端对端融合事件的上端粒阈值，以及在上述ii)中的所述阈值以下或基因融合范围中的后续预后平均端粒长度。此外，本发明还涉及在上述
iii)或iv)中的患者端粒分布的分析，并通过使其与测定的阈值和所述预后平均值相关联，本发明预测患者是否会需要治疗并且还预测当不进行所述方法时每一患者的无进展或总体存活。
[0019]在本发明的优选方法中，在所述方法包括与上述部分i)中的融合事件相关的数据之前，该融合事件通过直接DNA序列分析而得到验证。
[0020]另外或可替代地，在本发明的其他优选方法中，来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的预后平均端粒长度通过采集表现出端粒融合的那些样品并对那些样品的平均端粒长度求均值而测定。因此，这种优选的方法包括平均端粒长度小于所述阈值的样品，以及还包括平均端粒长度大于所述阈值的样品，但不管事实如何，仅将表现出融合的样品用于产生平均端粒长度。本领域技术人员会认识到，使用这种另外或可替代的样品组可以进行所述方法的事实表明所述阈值以下的任何端粒长度是预后的；其平均值尤其如此。
[0021]在本发明的其他优选方法中，包括或特征为端粒缩短的疾病包括其中缩短端粒的疾病，如本文所述，特别是其中端粒酶相对于永生化细胞系的平均活性而具有降低的活性(统计学显著为P < 0.05的水平)的疾病，并且最优先包括以下疾病中一种或多种:衰老、阿尔兹海默病；脑梗塞；心衰；慢性HIV感染；慢性肝炎；皮肤疾病；慢性炎性肠疾病；溃疡性结肠炎；贫血；动脉粥样硬化；巴雷特食管症；以及癌症，包括癌前病况。
[0022]优选地，所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。
[0023]还更优选地，所述癌症是CLL、MDS或乳腺癌。
[0024]还更优选地，对于所选的单个染色体，理想但并非必要地测定在可以检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。对其进行分析的染色体的实例连同每一染色体的端对端融合检测的上限值示于表1中。使用5种样品，我们已表明在不同染色体中测定端对端融合事件的上限是非常相似的，即，在3.Slkb至5.0lkb之间。均值为4.52kb，并且标准偏差仅为0.46kb。同样地，我们还表明这5种染色体的基因融合范围中的平均端粒长度也非常相似，即，2.26kb至3.0lkb之间。均值为2.69kb，并且标准偏差仅为0.30kb。
[0025]在本发明的可替代的优选方法中，对于多种不同的染色体，测定可以检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。实际上，可以使用任何可进行高分辨端粒长度分析的染色体。在该情况中，测定不同染色体中端对端融合事件的平均上限用于上述部分i)中；并且也使用上述部分ii)中的这些不同染色体的基因融合范围中的平均端粒长度的均值(average mean telomere length)。
[0026]在本发明的优选方法中，在所述疾病为CLL的情况下，首次治疗时间不良表示个体具有小于2年(即1.84年)的治疗中值时间且风险比为23.2，表明他们与具有阈值之上的端粒长度的个体相比在单位时间中23.2倍地更可能需要治疗。治疗反应不良表示从首次治疗到死亡的中值时间为小于5年(即，4.1年)且风险比为6.4，并且总体存活不良表示从诊断计的中值存活时间小于8年(即，7.49年)且风险比为71.3。
[0027]在本发明的优选方法中，在所述疾病为CLL的情况下，首次治疗时间良好表示个体将不需要治疗并且可以按惯例监测；并且治疗反应良好表示在10年内不会达到治疗的平均时间；以及总体存活良好表示中值存活大于10年，并且96%的同期组存活至该检查点且可以按惯例监测。
[0028]在本发明的优选方法中，在所述疾病为MDS的情况中，总体存活不良表示从诊断计的中值存活时间小于1.5年(即，1.15年)且风险比为9.5。
[0029]在本发明的优选方法中，在所述疾病为MDS的情况中，总体存活良好表示中值存活为4.9年并能按惯例监测。
[0030]在本发明的优选方法中，在所述疾病为乳腺癌的情况中，总体存活不良表示中值存活时间小于I年(即，0.95年)且风险比为87080。
[0031]在本发明的优选方法中，在所述疾病为乳腺癌的情况中，总体存活良好表示中值存活大于6年并能按惯例监测。
[0032]根据本发明的第二方面，提供了用于测定包括或特征在于端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括:
[0033]i )使用高分辨端粒长度分析来测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的预后平均端粒长度，所述个体的平均端粒长度小于在所述癌症疾病中可检测到端粒端对端融合时的4.52kb端粒长度阈值，所述测定时通过采集平均端粒长度小于所述阈值的那些样品且对那些样品的平均端粒长度取均值；
[0034]ii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者
[0035]iii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体存活是良好的。
[0036]在本发明的第二实施方案中，优选地，使用可以检测到端粒端对端融合事件时的
4.06kb阈值(即，4.52 - 0.46kb)或4.98kb阈值(即，4.52+0.46kb)来测定预后平均端粒长度。
[0037]在本发明第二方面的优选实施方案中，所述疾病为癌症，并且典型地，所述癌症为CLL、乳腺癌或MDS，并且理想地，将2.26kb的预后平均端粒长度值用于CLL和乳腺癌，并将2.5kb的预后平均端粒长度值用于MDS。
[0038]还更优选地，在本发明的第二方面，对于多个染色体测定可以检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。理想地，所述染色体为XpYp、17p、2p、16p和18q，尽管可以使用染色体的任何其他组合，并且它们可以检测到端粒端对端融合事件时的平均上阈值用于上述方法。
[0039]根据本发明的第三方面，提供了用于测定包括或特征在于端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括:
[0040]1.测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于2.69kb的预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者
[0041]2.测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于2.69kb的预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体存活是良好的。
[0042] 在本发明的这种第三实施方案中，优选地，所述预后平均端粒长度为2.39kb(即，2.69 - 0.3kb)或 2.99kb (即，2.69+0.3kb)。
[0043]在本发明第三方面的优选实施方案中，所述疾病是血液癌症，并且典型地，所述癌症是CLL或MDS，并且更理想地，对于前者，所述预后平均端粒长度为2.26kb，而对于后者则为 2.5kb。
[0044]在本发明的第三方面的优选实施方案中，所述疾病为乳腺癌，并且更理想地，所述预后平均端粒长度为2.26kb。
[0045]还更优选地，在本发明的第三方面中，对于多个染色体测定预后平均端粒长度。理想地，所述染色体为XpYp、17p、2p、16p和18q，尽管可以使用染色体的任何其他组合，并且它们的预后平均端粒长度均值用于上述方法。
[0046]根据本发明的其他方面，提供了一种或多种(包括其组合)的本文所述的引物。
[0047]根据本发明的其他方面，提供了包括或包含前述本发明任何方面或实施方案的预后方法的治疗方案。
[0048]在随附的权利要求以及本发明的前述描述中，除了语境由于表达语言或必要含义而另有所需的情况，措词“包含(comprises) ”或其变体如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”以涵括含义使用，即，特指存在所述特征但不排除存在或增加本发明各种实施方案中的其他特征。
[0049]本说明书所引用的所有文献,包括任何专利或专利申请,并入本文作为参考。从未承认任何参考构成现有技术。此外，从未承认任何现有技术构成本领域的公知常数的一部分。
[0050]本发明的每一方面的优选特征可以如任何其他方面所述。
[0051]从以下实例，本发明的其他特征会变得显而易见。一般而言，本发明延伸至本说明书(包括随附的权利要求和附图)所公开的特征中任何新颖的一个特征或所述特征的任何新颖的组合。因此，与本发明的特定方面、实施方案或实例相关描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分可理解为可适于本文所述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与其不相容。
[0052]此外，除非另有所述，本文公开的任何特征可以被用于相同或相似目的的可替代特征替换。
[0053]现参考以下表格和附图，通过实例来描述本发明。
[0054]表-1示出一系列染色体的可以检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度(包括其平均值)和每一所述染色体的预后平均端粒长度(包括其平均值)。
[0055]表2-示出基于首次治疗时间和总体存活的单变量分析的预后因子的比较。
[0056]表-3示出184名CLL患者同期组的临床特征。
[0057]表-4示出将端粒长度分析与已知预后标志物结合的整合数据集的分析。
[0058]图1定义了 CLL中预后的端粒参数。[A]其中检测或未检测到融合的12名CLL患者中XpYp端粒处的STELA的实例。平均值和标准偏差在凝胶图像下呈现并且在凝胶图像上用红色突出平均值。[B]在4名CLL患者中的融合分析的实例。[C]在图B中突出融合事件的DNA序列的实例。箭头指示融合接合，连同参与的端粒，及从各端粒起始计的缺失。强调参与的端粒之间的同源性。[D]以Binet分期函数形式绘制的平均XpYp端粒长度数据。黑色方块表示未检测融合的那些，空心方块表示对融合事件呈阴性的那些，而标记的方块表示对融合事件呈阳性的那些。图E示出来自整个同期组的端粒长度数据连同对融合事件呈阳性的那些数据。用虚线表示检测到融合的最长平均XpYp端粒(3.81kb)，并且检测到融合的样品的平均XpYp端粒长度为2.26kb。
[0059]图-2:平均端粒长度在CLL中是预后的。图A和B示出来自整个同期组的首次治疗时间(上图)和总体存活(下 图)的Kaplan Meier曲线。在图表上示出P值、风险比(HR)，连同每一分支(arm)的数量。
[0060]图-3示出通过融合而定义的端粒长度在CLL是高度预后的。[A-B，E]来自整个同期组的首次治疗时间和总体存活的Kaplan Meier曲线。在图表上示出P值和风险比(HR)，连同每一分支中的数量。[C-D]仅为Binet A期的同期组的Kaplan Meier曲线。[F-G]数据集的递归分割表明2.26kb是作为预后工具的最佳端粒阈值，所述预后工具用于定义整个数据集中以及2群同期组中的存活。
[0061]图-4:图A示出以Binet分期函数形式绘制的平均17p端粒长度数据。黑色方块表示未检测融合的那些，空心方块表示表示对融合事件呈阴性的那些，而标记的方块表示对融合事件呈阳性的那些。图B示出来自整个同期组端粒长度数据连同对融合事件呈阳性的那些数据。用虚线表示检测到融合的最长平均XpYp端粒(4.81kb)，并且表明17p端粒的基因融合范围的上限。其中可检测到融合的样品的平均端粒长度为2.57kb。图C和D示出分别基于源自数据递归分割的2.5kb界限的首次治疗时间和总体存活的Kaplan Meier曲线。图E和F示出A期患者的仅基于源自数据递归分割的2.5kb界限的首次治疗时间和总体存活的Kaplan Meier曲线。图G示出总体存活的17p端粒的平均端粒长度对风险比的图表。递归分割表明2.5kb是使用该端粒限定预后的最佳阈值。
[0062]图-5示出端粒长度优于其他已知的预后参数。作为首次治疗时间和总体存活的函数的Kaplan Meier曲线具有端粒长度以及细胞遗传学[A_B]、IGHV状态[C-D]、⑶38状态[E-F]和 ZAP-70 状态[G-Η]。
[0063]图-6示出源自XpYp染色体的2.26kb的端粒阈值对于CLL患者的治疗反应是高度预后的。接受治疗的患有CLL的患者的子集(n=75)的Kaplan Meier曲线。从首次治疗的时间计算存活时间。在图表上示出P值和风险比(HR)连同每一分支中的数量。
[0064]图-7示出通过融合而定义的端粒长度在乳腺癌中也是预后的。[A-D]总体存活的来自整个同期组的Kaplan Meier曲线。在图表上示出P值和风险比(HR)连同每一分支中的数量。[E]数据集的递归分割表明2.26kb是作为用于在整个数据集中定义存活的预后工具的最佳端粒阈值。
[0065]图-8MDS图示出2.26kb端粒阈值在MDS中提供了有限的预后能力。[A-D]总体存活的来自整个同期组的Kaplan Meier曲线。在图表上示出P值和风险比(HR)连同每一分支中的数量。D示出2.5kb端粒阈值在MDS中提供了更好的预后能力。[E]数据集的递归分割表明2.5kb是作为用于在整个数据集中定义存活的预后工具的最佳端粒阈值。
[0066]方法
[0067]CLL 患者
[0068]根据赫尔辛基宣言并由South East Wales当地研究伦理委员会(LREC#02/4806)批准，外周血液样品来自184名CLL自愿患者。通过临床标准及细胞方法定义CLL，此外CD19和CD5在淋巴细胞中的共表达同时显示对轻链重排的限制。综合临床信息适于所有患者，并且中值随访为5.8年。在从两个中心Cardiff和Birmingham诊断时或诊断时间附近采集所有样品，并且基于Bient分类体系进行分期24。CLL患者同期组的临床特征示于表2中。
[0069]乳腺癌患者
[0070]在Wales MREC批准下，从Wales Cancer银行获得来自一组28名侵袭性乳腺导管癌的基因组DNA连同临床随访数据。
[0071]MDS 患者
[0072]根据French-American-British体系所分类，从诊断患有骨髓增生异常综合征(MDS)的63名患者获得骨髓样品。其中，40患者为男性且23名为女性，并且诊断时的平均年龄为67.5岁；同期组的平均随访为5.6年。IPSS标准适于55/63的患者，并且15名为高的，20名为中度的并且20名为低的。
[0073]从CLL患者分离外周血单核细胞[0074]通过使用聚鹿糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(Invitrogen)的密度离心,从184名CLL患者的EDTA静脉血分离外周血单核细胞(PBMC)。随后，使用⑶19-标记的免疫磁珠(Dynabeads) (Invitrogen)完全分离B-细胞25。在DNA提取前，细胞在_20°C以干燥微球形式贮存。
[0075]DNA 提取和 PCR
[0076]使用标准蛋白酶K、核糖核酸酶A、酚/氯仿方案从人类细胞提取DNA26。对于在XpYp、17p、2p、16p和18q端粒的端粒长度分析，我们使用以前所述的单端粒长度分析(STELA)测试的变体16’2°。简言之，通过在IOmM Tris-HCl (pH7.5)中稀释来溶解基因组DNA，通过使用Hoechst33258荧光测定仪(BioRad, Hercules, USA)来定量，并在IOmMTris-HCl (pH7.5)中稀释至 lOng/μΙ。将 DNA(IOng)进一步稀释至 250pg/μ 1，体积为40 μ 1，包含 Telorette2 连接子(I μ Μ)和 Tris-HCl (ImM;ρΗ7.5)。以 10 μ I 体积，对每一受试DNA进行多次PCR反应(通常每个样品6次反应)。反应混合物由DNA(250pg)、邻近端粒的 Teltail 引物(0.5 μ M)、Tris-HCl (75mM;pH8.8)、(NH4)2S04(25mM)、0.01%Tween_20、MgCl2 (1.5mM)以及 0.5U 的 10:1 比例的 Taq (ABGene, Epsom, UK)和 Pwo聚合酶(Roche Molecular Biochemicals, Lewes, UK)组成。用 MJ PTC-225 热循环仪(MJ research, Watertown, USA)使反应循环。通过0.5%TAE琼脂糖凝胶电泳来溶解DNA片段，并且通过用随机引物 ct-33P 标记(Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK)的TTAGGG重复探针和邻近端粒的探针连同检测Ikb (Stratagene, La Jolla, USA)和2.5kb (BioRad)分子量标记物的探针进行的两次单独的Southern杂交来进行监测。通过 Molecular Dynamics Storm860 感光成像仪(Amersham Biosciences, LittleChalfont, UK)来感光成像，从而检测杂交片段。使用PhoretixlD计量器(NonlinearDynamics, Newcastle-upon-Tyne, UK)来计算 DNA 片段的分子量。
[0077]使用先前所述的单分子端粒融合测试来检测端粒融合16’17。进行包括IOOng DNA的PCR反应，各自包括XpYpM、17p6和21qlPCR引物。检测融合分子，并且如先前所述，由Southern印迹法来定量频率并且与邻近XpYp端粒的探针杂交15。为了测定参与融合事件的染色体以用于随后的序列表征，与邻近17p和21q端粒的探针进行进一步杂交；21q探针产生额外的非特异性产物并由此用于量化。然而，再放大任何融合产物以用于使用嵌套PCR引物(XpYp0、17p7和21qseql)的直接序列分析。
[0078]所用的寡核苷酸为:用于融合PCR 的 XpYpM (5' -ACCAGGTTTTCCAGTGTGTT-3' )、I7p6(5/ -GGCTGAACTATAGCCTCTGC-3' )、21ql(5' -CTTGGTGTCGAGAGAGGTAG-3');用于再放大融合产物的 XpYpO (5' -CCTGTAACGCTGTTAGGTAC-3' )、17p7(5' -CCTGGCATGGTATTGACATG-3/ )、21qseql(5' -TGGTCTTATACACTGTGTTC-3' ) ；21qseql(5/ -TGGTCTTATACACTGTGTTC-3/ )、21qseqlrev(5' -AGCTAGCTATCTACTCTAACAGAGC-3' )、XpYp0(5' -CCTGTAACGCTGTTAGGTAC-3' )、XpYpB2(5' -TCTGAAAGTGGACC(A/T)ATCAG-3' )、17p7(5' -CCTGGCATGGTATTGACATG-3' )、17pseq3 (5' -AGAATCCTGTCCTCAACAAGT-3')，从而产生用于融合分析的杂交探针。
`[0079]可用于STELA分析的引物(通常鼓励使用的引物):
[0080]XpYpE2TTGTCTCAGGGTCCTAGTG
[0081]XpYp-427A/415T GGTTATCAACCAGGTGCTCT
[0082]XpYp-427G/415C GGTTATCGACCAGGTGCTCC[0083]XpYpinsTGTGTCTGGAATTGGTGGGTT
[0084]XpYpdelCCTAGTGTGTCTGGAATTGGTTC
[0085]XpYpMACCAGGTTTTCCAGTGTGTT
[0086]XpYpCCAGGGACCGGGACAAATAGAC
[0087]XpYpOCCTGTAACGCTGTTAGGTAC
[0088]17pseqlrev GAATCCACGGATTGCTTTGTGTAC
[0089]17p6GGCTGAACTATAGCCTCTGC
[0090]17p7CCTGGCATGGTATTGACATG
[0091]16prevlGTGAATAATCAAGGTCAGAGCA
[0092]18qrev4CCTGTGGGTCTAAAACCAGAAGG
[0093]2p2GAGCTGCGTTTTGCTGAGCAC
[0094]llql3BCAGACCTTGGAGGCACGGCCTTCG
[0095]12q-197AGGGAGATCCACACCGTAGCA
[0096]12q-550CACAGCCTTTTGGGGTACCGC
[0097]统计方法
[0098]使用Prism3.0 (Graphpad)和 SAS9.1.3版本软件(SAS Institute)进行统计分析。
[0099]通过用于分类变量Binet病期、⑶38、ZAP-70、IGHV基因突变状态、β 2_微球蛋白和FISH细胞遗传学的Wilcoxon秩和检验，探索端粒长度、已知的预后因子、首次治疗时间(TTFT)和总体存活(OS)之间的关联。用对数秩检验进行预后子集之间的存活的非成层单变量比较，并且使用Kaplan-Meier曲线显示存活数据。使用正向选择来由Cox回归定义显著的协变量，从而进行适于其他预后特征的多变量分析。P-值< 0.05被认为是显著的。
[0100]结果
[0101]端粒长度和融合分析
[0102]我们对XpYp端粒(图1A)使用单端粒长度分析(STELA)来分析184名CLL患者中端粒长度分布。考虑到我们先前表明在具有短端粒的CLL患者中可检测到端粒端对端融合事件15，我们系统地寻找具有最短平均端粒长度的CLL样品(n=88)中的端粒融合。我们仅认为融合事件当其可完全由直接DNA序列分析表征(图1B、1C)时是真实的。端粒融合在源自所有Binet病期的样品中是可检测的，表明它们不仅是晚期疾病的特征(图1D ;用标记的方格示出融合)。然而，仅在平均端粒长度< 3.81kb的样品中检测到融合。因此，我们使用这种端粒长度作为阈值，以定义使用该染色体的我们的同期组的“基因融合”范围的上限。图1E示出98/184(53.3%)的CLL样品具有等于或小于3.8Ikb的平均XpYp端粒长度，并且平均基因融合端粒长度为2.26kb。因此，我们将2.26kb用作在我们同期组中定义两个子集的CLL患者样品的方式，并且测定在我们同期组中该平均端粒长度阈值的预后值。总计33/184(17.9%)的样品的平均端粒长度< 2.26kb。
[0103]端粒功能失调在CLL中是高度预后的
[0104]与前述研究保持一致，对于TTFT (P < 0.001;HR=5.5)和 OS (p=0.0017 ;HR4.2)，平均端粒长度在我们的患者同期组中是预后的(图2)。然而，基于端粒功能失调的样品的分类(XpYp端粒 的端粒长度<2.26kb)揭示了显著增强的预后辨别。图3A和3B示出<2.26kb的平均端粒长度对于TTFT和OS是高度预后的。中值TTFT为1.8年(P < 0.0001;HR=23.2)，并且中值OS为7.5年(P < 0.0OOl; HR=71.3)。相反，在更长端粒的子集中未达到中值TTFT和OS。特别引人注目的是在我们的同期组中端粒长度对OS的影响；端粒长度> 2.26kb的患者的Kaplan Meier曲线表明在10年随访期内几乎没有减少；在5年时为98%存活并且在10年时为96%存活。然而，在10年检查点，仅36%的短端粒组是活着的，表明≤2.26kb的患者在单位时间内70倍以上地更可能死亡。这些数据在表-2中总结。
[0105]具有短端粒的A期患者具有更侵袭性疾病
[0106]考虑到大部分CLL患者呈现早期疾病，并且该组在预测方面代表了最大的挑战，我们进行了仅为Binet A期患者的子集分析。我们同期组的130/184 (70.6%)在诊断时为Binet A期，其中15(11.5%)名的XpYp端粒的端粒长度≤2.26kb。图3C和3D示出短端粒在早期疾病中的预后影响。中值TTFT为2.1年(P < 0.0001;HR=33.0)，并且中值OS为
9.0年(P < 0.0001;HR=994.2)。再一次，在更长端粒组中未达到中值TTFT和OS。OS的显著风险比表明这些患者与具有更长端粒的患者相比在单位时间内几乎1000倍地更可能死于其的疾病。再一次，优异的Kaplan Meier曲线揭示了具有更长端粒的患者在10年时具有96%的存活率。
[0107]144名A期患者的数据集的扩充进一步提供了确认，即，2.26kb的特定端粒长度对CLL中的该测试提供了最大预后能力，并且总体存活的HR增加至1353(图3E)。
[0108]递归分割将2.26kb阈值确定为存活的最大预后
[0109]尽管我们已在实验上确定了在CLL中端粒功能失调的端粒长度并且表明这是高度预后的，但我们期望建立其是否代表用于预测我们同期组的存活的最佳端粒长度界限。通过对我们的数据集进行递归分割，我们发现2.26kb代表最佳端粒长度，并且对于总同期组和A期同期组是最大预后阈值(图3E)。考虑到我们的同期组由源自两个不同中心(Cardiff和Birmingham)的样品构成,我们在这两个单独的群体中重复测试并且基本得到相同结果(图3F)。该方法进一步提供了间接证据，即，2.26kb代表了端粒稳定性的生物限度，并且证实了这种平均基因融合端粒长度在CLL中的临床重要性。
[0110]我们考虑到在其他染色体中可以保存这种平均基因融合端粒长度，由此，我们分析了在149/184(81%)的患者同期组中于17p的端粒长度(图4A)。其中我们检测到融合的样品的平均17p端粒长度与在XpYp所观察到的类似(2.57kb, ±0.79，P=0.21 ;图4B)。递归分割揭示了测定预后的最佳端粒长度为2.5kb ;这在整个同期组(OS P〈0.0001，HR=72)和A期患者(OS P=0.009, HR=71,图4C-G)中是高度预后的。
[0111]端粒长度优于其他预后参数
[0112]我们接下来研究了功能失调的端粒对CLL中其他已知预后标志物的影响，所述其他已知预后标志物包括细胞遗传学、IGHV突变状态、⑶38表达、ZAP-70表达和β -2微球蛋白(β 2Μ)。在图5中示出端粒长度与FISH细胞遗传学、IGHV突变状态、⑶38表达、ΖΑΡ-70表达的组合分析。如所示的那样，对于TTFT和OS，短端粒长度定义了在细胞遗传学风险组、IGHV未突变和突变组、⑶38+和⑶38-组、ΖΑΡ-70+和ΖΑΡ_70-组以及高和低β 2Μ组内的患者不良预后子集。将这些标志物与端粒长度结合仍进一步增加了预后能力；例如，整合数据集的分析揭示了高CD38表达与≤2.26kb的端粒长度的结合产生2915的HR(P < 0.0001，表-4)。
[0113]端粒长度在多变量分析中是显性协变量[0114]在多变量分析中，正向选择确定的端粒功能失调(≤2.26kb)作为TTFT (HR=4.2;CI1.9-8.8, P=0.0002)和 OS (HR=I0.9; CI3.8-31.2, P < 0.0001)的最显著的参数。仅IGHV突变状态和Binet分期在用于TTFT的模型中保持了作为协变量的独立预后显著性，并且对于OS则仅有⑶38。特别关注的是，IGHV突变状态和“高风险”细胞遗传学对于OS是并非独立预后的。据我们所知，这是首次的，即这些参数对于这种疾病的OS不能证明是显著的。
[0115]端粒长度在CLL中定义了治疗反应
[0116]考虑到我们已表明端粒长度在CLL中提供了有力的预后信息，我们进一步考虑端粒长度还可以提供与患者的治疗反应的能力相关的信息。因此，我们对已接受治疗的那些患者同期组进行我们的CLL患者同期组的子集分析(n=75)。端粒长度对于治疗反应是高度预后的，并且HR为6.4 (P=0.0002)(图_6)。
[0117]在CLL定义的端粒参数在其他指征中是预后的
[0118]我们检查了具有乳腺侵袭性导管癌的28名患者的同期组。我们使用STELA分析了 XpYp端粒长度，并且基于CLL中定义的2.26kb端粒长度界限来分类患者。尽管有限的随访期为4.6年，但2.26kb平均基因融合端粒长度对危害比为112的这种疾病的总体存活提供了显著水平的预测(P=0.0056)，并且在不良预后组中的中值存活为301天(图-7A-C)。120名乳腺癌患者的数据集的扩充进一步提供了确认，即，2.26kb的特定端粒长度对乳腺癌中的该测试提供了最大预后能力，并且总体存活的HR增加至87080(图7D)。
[0119]与CLL 一样，乳腺癌同期组数据的递归分割表明由HR定义的最佳端粒长度为
2.26kb(图-7E)。
[0120]我们还使用STELA检查了 MDS中的端粒长度，并且将在CLL中定义的平均基因融合端粒长度用于在MDS中提供预后信息。我们分析了一组我们具有存活数据的63名MDS患者。在CLL中所定义的2.26kb平均基因融合端粒长度在总体存活的HR为4.7的MDS中提供了一些预后能力(Ρ=0.09)(图-8A-C)。与CLL和乳腺癌样品不同，MDS样品不是纯化的，并且包含多种未确定比例的未感染细胞。我们考虑到存在未感染的正常细胞会偏斜该同期组中用于预后的最佳端粒长度阈值。这由递归分割而为显而易见的，当最佳端粒长度为2.5kb (HR=9.5，P=0.026)时，差异仅为240bp (图-8E)。78名MDS患者的数据集的扩充进一步提供了确认，即，2.5kb的特定端粒长度对MDS中的该测试提供了最大预后能力，并且总体存活的HR增加至10.45 (图7D)。使用CD34的MDS细胞的纯化在MDS中可以改进基于端粒的预测的精确性。
[0121]总结
[0122]该研究的主要发现可以总结如下:
[0123]由端粒功能失调所定义的端粒长度分析在诸如CLL和其他人类恶性肿瘤的人类疾病中提供了高度预后工具，允许显著辨别治疗后的临床结果。预后能力应使临床医师确信地预期这些异质性疾病的临床进程。
[0124]此外，端粒功 能失调在疾病早期提供了显著的预后分辨。
[0125]仅在长度分布曲线的下部中的端粒具有端对端融合的倾向；使用XpYp染色体，(2.26kb的端粒长度是原发性人类肿瘤中端粒功能失调的平均基因融合端粒长度，在其之下，人类恶性肿瘤的患者表现出不良预后结果。使用多个染色体，< 2.69kb的端粒长度是染色体功能失调的预测子。
[0126]XpYp端粒长于2.26kb的患者具有显著稳定且无痛的疾病(这些患者中98%在5年时存活，并且96%在10年检查点时存活)。
[0127]在MDS和乳腺癌中一致的端粒分析表明高分辨端粒长度分析在其他血液恶性肿瘤中可以是高度预后的，但在实体瘤中也是重要的。
[0128]通过施用基于端粒功能失调的端粒长度阈值，其将端粒分析的预后能力转变成以前在单变量和多变量分析中所述的最大预后参数。
[0129]参考文献
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【权利要求】
1.用于测定包括或特征为端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括: i)在来自呈现相同疾病的多个个体的组织样品中，使用高分辨端粒长度分析来测定可检测到端粒端对端融合事件时的最长平均端粒长度，从而确定表示端粒变为功能失调并能融合时的平均端粒长度的指征的阈值数； ii)通过采集平均端粒长度小于所述阈值的那些样品并对那些样品的平均端粒长度取均值，从而测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的预后平均端粒长度； iii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者 iv)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体存活是良好的。
2.如权利要求1所述的方法，其中上述部分i)中的所述融合事件通过直接DNA序列分析而得到验证。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，另外或可替代地，通过采集表现出端粒融合的那些样品并对那些样品的平均端粒长度取均值，来测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的所述预后平均端粒长度。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病是以下疾病之一:衰老、阿尔兹海默病；脑梗塞；心衰；慢性HIV感染；慢性肝炎；皮肤疾病；慢性炎性肠疾病；溃疡性结肠炎；贫血；动脉粥样硬化；巴雷特食管症；以及癌症，包括癌前病况。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述癌症是CLL、MDS或乳腺癌。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中对单个染色体测定可检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中对多个不同的染色体测定可检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。
9.如权利要求8所述的方法，其中用于在不同染色体中检测端对端融合事件的平均上限用于权利要求1的部分i)，并且用于这些不同染色体的基因融合范围中的平均端粒长度的均值用于权利要求1的部分ii)。
10.用于测定包括或特征为端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括: i)使用高分辨端粒长度分析来测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的预后平均端粒长度，所述个体的平均端粒长度小于在所述癌症疾病中可检测到端粒端对端融合时的4.52kb端粒长度阈值，所述测定是通过采集平均端粒长度小于所述阈值的那些样品且对那些样品的平均端粒长度取均值； ii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者 iii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于所述预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体存活是良好的。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病是癌症，例如CLL、乳腺癌或MDS。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述预后平均端粒长度是2.26kb。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中对多个不同的染色体测定可检测到端粒端对端融合事件时的端粒长度。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述染色体是XpYp、17p、2p、16p和18q。
15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，在部分i)中，另外或可替代地，通过采集表现出端粒融合的那些样品并对那些样品的平均端粒长度取均值，来测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的所述预后平均端粒长度。
16.用于测定包括或特征为端粒缩短的疾病的进展的预后方法，其包括: i)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度小于2.69kb的预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是不良的和/或对治疗的反应是不良的和/或总体存活是不良的；或者 ii)测定从疑似患有或呈现所述疾病的患者采集的样品的平均测试端粒长度，当所述平均测试端粒长度大于2.69kb的预后平均端粒长度时，断定首次治疗时间是良好的和/或对治疗的反应是良好的和/或总体存活是良好的。
17.如权利要求16所 述的方法，其中所述疾病是血液癌症，例如CLL或MDS。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述预后平均端粒长度是2.26kb。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中对多个不同染色体测定所述预后平均端粒长度。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述染色体是XpYp、17p、2p、16p和18q。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中，在部分i)中，另外或可替代地，通过采集表现出端粒融合的那些样品并对那些样品的平均端粒长度取均值，来测定来自呈现所述疾病的多个个体的组织样品的所述预后平均端粒长度。
【文档编号】C12Q1/68GK103748237SQ201280040049
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2011年8月15日
【发明者】邓肯·贝尔德, 克里斯·佩珀, 克里斯多佛·费根 申请人:加的夫大学学院咨询有限公司