外源双链rna导入植物细胞的方法和组合物的利记博彩app

外源双链rna导入植物细胞的方法和组合物的利记博彩app【专利摘要】本发明提供了一种通过将一种特异性双链RNA应用在植物外表面上以沉默植物中内源靶标基因表达的方法。在不损伤植物组织和细胞（诸如，机械型损伤、粒子轰击或用病毒载体进行机械感染）的情况下，诸如通过用双链RNA喷涂或刷涂植物进行应用。本发明使调节植物中的基因表达成为可能。在本发明的一些实施例中，该双链RNA针对植物病原体或有害生物的一种必需基因，由此控制病原体和/或有害生物的损害，从而导致令人希望的农艺性能。【专利说明】外源双链RNA导入植物细胞的方法和组合物[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请声明了2011年8月16日提交的美国临时专利申请号61/523，877在美国法典119(e)标题35项下的优先权权益。发明领域[0003]本发明涉及RNA的方法和组合物，这些方法和组合物包括应用于外部植物部分，优选地为叶片的RNA配制品，其中该双链RNA被吸收至植物细胞中。[0004]发明背景[0005]许多食物来源是由作物产生的。环境条件诸如干旱和高温经常对作物生长和产量产生不利的影响。有害生物的压力也有实质性的负面影响。因此，能够抵御环境压力和/或有害生物挑战的植物是令人希望的。通过选择育种或者通过基因修饰能够得到对非生物和生物胁迫有耐性或抗性的植物。RNA干扰15(RNAi)能被用于生产耐或抗非生物和生物胁迫的经遗传改性的植物。[0006]在过去的十年里，RNAi已经在多种植物、真菌、线虫、水螅、以及人类的生物体内被描述和表征。[0007]Zamore(扎穆尔)和Haley(哈利)(2005)Science(《科学》)309，1519-24。在植物中的RNA干扰通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中称为压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是一种进化保守的细胞防御机制，该机制被用来防止外来基因的表达并且通常由不同的植物(flora)和动物(phyla)共享。Fire(菲尔)(1999)TrendsGenet.(《遗传学趋势》)15，358-363。[0008]当一种生物体识别双链RNA分子并且水解它们时，RNA干扰发生。[0009]所产生的水解产物是19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被叫做小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。大多数植物miRNA显示了与它们的靶标mRNA的广泛碱基配对，并且引导它们的靶标mRNA的切害I]。Jones-Rhoades(琼斯-罗兹)等(2006)Annu.Rev.PlantBiol.(《植物生物学年鉴》)57,19-53；Llave(拉弗)等(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国国家科学院院刊》)97，13401-10406。在其他例子中，干扰RNA可以结合至具有不完全互补性的靶标RNA5分子上，导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。[0010]通常，沉默植物基因的作用方式包括与切丁酶相关联的双链RNA(dsRNA)，该切丁酶将dsRNA切成19-24bps长度的双链片段(siRNA)。可以有多于一种切丁酶，这取决于该生物体。Meister(麦斯特)和Tuschl(布施)，2004)。该siRNA典型地被降解为两条单链RNA(ssRNA)，这两条单链RNA被称作过客链和引导链。RNA干扰沉默复合体(RISC复合体)载有引导链。RISC复合体与靶标mRNA相关联，该靶标mRNA与引导链具有部分的或完全的同源性。催化性RISC组分argonaute引起祀标mRNA的切割，以预防该祀标mRNA被用作翻译模板。AhlquistP(斯特P)(2002)RNA依赖性RNA聚合酶、病毒、以及RNA沉默，《科学》296(5571):1270-3。通过使用重组技术，RNAi途径在植物中被采用，该RNAi途径要求用载体转化植物，该载体包括DNA，当该DNA表达时产生与靶标基因同源或几乎同源的双链RNA。该靶标基因可以与内源植物基因或昆虫基因同源。如果该靶标基因是一种昆虫基因，该昆虫食用植物，由此摄入双链RNA，于是该昆虫的RNAiRISC复合体引起切割，并且靶向同源mRNA，导致致命性昆虫过程的破坏。[0011]至今，植物重组技术是递送靶标基因的基因沉默的工具，无论是内源植物靶标基因还是植物有害生物体的靶标基因。一般地，植物是用DNA转化的，该DNA被合并入植物基因组，并且当表达时，该DNA产生双链RNA，该双链RNA与感兴趣的基因互补，该感兴趣的基因可以是内源植物基因或植物有害生物的必需基因。产生转基因和有益的植物特性的植物重组技术要求有重大的研究投入和发展，并且形成重大的障碍调控。通过对植物外部(诸如叶片、茎、和/或根表面)的外源应用，递送双链RNA至植物细胞中以调控外源基因表达的方法和配制品在本领域是未知的。此类方法和配制品代表了基因沉默技术的重大的进步。[0012]递送外源双链RNA至植物细胞的已知的方法是通过粒子轰击或通过损伤植物组织(例如，烟草和水稻叶片组织)的病毒RNA感染。通过喷涂或刷涂RNA分子，或其他的非-组织规避技术(non-tissueevasivetechnique)的应用，导致外源RNA分子吸收入植物组织，由此引起内源和/或有害生物基因沉默，还未被报道过。[0013]本发明针对多种方法和配制品，这些方法和配制品通过应用于植物的一个或多个外部组织表面，将外源RNA并入植物细胞中，引起一个或多个植物内源靶标基因或植物有害生物的靶标基因的沉默。[0014]本发明不针对任何具体的RNAi机制或基因沉默作用方式，并且不应该解释为对任何已知的或未知的此类机制的限制。[0015]发明概述[0016]本发明披露了一种双链RNA渗透入植物细胞，并且随后通过双链RNA在植物结构表面(例如，叶片表面)的应用诱导植物内源基因沉默的新途径。更有意义地，基因沉默在作物种类(玉米)而不是模式植物(拟南芥属等)中取得成功。因此，本发明建立了外部应用双链RNA可以被用于沉默或否则调制内源植物基因表达。[0017]本发明披露了一种植物激素介导的双链RNA渗透入植物细胞，并且随后通过双链RNA在植物结构表面(例如，叶片表面)的应用诱导植物内源基因沉默的新途径。基因沉默在作物种类(玉米)而不是模式植物(拟南芥属等)中取得成功。因此，本发明建立了外部应用双链RNA可以被用于沉默或否则调制内源植物基因表达。[0018]本发明披露了一种植物激素介导的双链RNA渗透入植物细胞，并且随后通过一种配制品中的双链RNA在植物结构表面(例如，叶片表面)的应用诱导植物内源基因沉默的新途径。基因沉默在作物种类(玉米)而不是模式植物(拟南芥属等)中取得成功。因此，本发明建立了外部应用双链RNA可以被用于沉默或否则调制内源植物基因表达。[0019]本发明包括一种将RNA整合至一种植物细胞中的方法，该方法包括:提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、和一种植物激素油菜素类固醇以及将该配制品应用于一种活体植物的叶片表面，其中该RNA是单链RNA，并且是从该植物叶片的外部叶片表面被吸收至该植物叶片的细胞中。[0020]本发明的配制品和方法中的用以协助双链RNA进入植物细胞以沉默植物内源基因的植物激素也是可以理解并且是在本发明的范围内的。[0021]本发明的一个方面针对将RNA整合至一种植物细胞中，该方面包括:提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、和一种植物激素油菜素类固醇以及将该配制品应用于一种活体植物的外部表面，其中该双链RNA是从该植物的外部叶片表面被吸收至该植物的细胞中。[0022]本发明的一个方面针对将RNA整合至一种植物细胞中，该方面包括:提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、和一种植物激素油菜素类固醇以及将该配制品应用于一种活体植物的外部叶片表面，其中该双链RNA是从该植物叶片外部叶片表面被吸收至该植物叶片的细胞中。[0023]本发明的一个方面针对将RNA整合至一种植物细胞中，该方面包括:提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、和一种植物激素，以及将该配制品应用于一种活体植物的外部表面，其中该双链RNA是从该植物外的部表面被吸收至该植物细胞中。[0024]本发明的另一方面包括一种配制品，该配制品包括一种浓度为约250ng/ul的双链RNA和配制品中的一种油菜素类固醇植物激素，该油菜素类固醇植物激素是在约0.8微摩尔至约1.6微摩尔的范围内。[0025]本发明的另一方面包括使用配制品中的双链RNA，该双链RNA的浓度约为250ng/Ulo[0026]本发明的另一个方面包括使用配制品中的油菜素类固醇植物激素，该油菜素类固醇植物激素是在约0.8微摩尔至约1.6微摩尔的范围内。`[0027]本发明进一步包括一种配制品，该配制品包括一种双链RNA、H20、以及一种植物激素，用于自发芽起约12天的活体植物。本发明的一个方面包括将该配制品应用于双子叶植物、玉米植物或烟草植物。[0028]本发明的另一方面是应用于植物外表面的一种配制品，该配制品包括双链RNA、H2O,以及一种植物激素油菜素类固醇。[0029]本发明的另一方面是一种配制品，其中，该配制品中的油菜素类固醇是在0.8微摩尔至约1.6微摩尔。[0030]本发明的又一方面是一种配制品，在该配制品中的双链RNA浓度约为250ng/ul。[0031]本发明的一个方面是生产植物、植物部分、或植物细胞的方法，该方法包括用以调制至少一种植物靶标内源基因的RNAi。[0032]本发明的一个方面是生产植物、植物部分、或植物细胞的方法，该方法包括用以调制至少一种植物靶标内源基因的RNAi。[0033]本发明包括多种方法和组合物，这些方法和组合物通过阻抑、延迟、或否则减少具体有害生物内的基因表达提供了对有害生物侵扰的控制。[0034]序列简述[0035]SEQIDNOl:描述了ZsGreen基因序列的600个核苷酸喊基。[0036]SEQIDN02:描述了玉蜀黍(Zeamays)谷氨酰胺合成酶cDNA序列的1071个核苷酸碱基。[0037]SEQIDN03:描述了普通烟草(Nicotianatabacum)叶绿体FtsH蛋白酶cDNA序列的395个核苷酸碱基。[0038]SEQIDN04:描述了普通烟草八氢番爺红素脱氢酶cDNA序列的1761个核苷酸碱基。[0039]发明详细说明[0040]本说明不意在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域内的普通技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明意在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有变更、组合与变体。[0041]除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明属于的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此处的本发明的说明中使用的术语是仅用于描述具体实施例的目的并且不意在限制本发明。[0042]在此提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合在此。[0043]如在此使用的，“一种/一个(a/an)”或“该(the)”可以表示一或多于一。例如，一个细胞可以意指单个细胞或多个细胞。[0044]如在此使用的，“和/或”指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(或)解释时组合的缺少。[0045]另外，当提及可计量值(例如化合物或试剂、剂量、时间、温度等等的量)时，如在此使用的，术语“约(about)”意图包括所指值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。[0046]如在此使用的，过渡短语“基本上由……组成”意指一项权利要求的范围将要解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在解释为等同于“包括(comprising)”。[0047]应当理解:尽管术语“第一(first)”、“第二(second)”等等在此可以用来描述不同要素，但是这些要素不应该受这些术语限制。这些术语仅用以将一个要素与另一个要素进行区分。因此，在此描述的“第一”要素(例如，第一启动子序列)还可以称作“第二”要素(例如，第二启动子序列)，这不背离本发明的传授内容。[0048]术语“RNA”包括任何含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括具有以下碱基的一个或多个天然核糖核苷酸的那些:腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、以及尿嘧啶；分别地缩写为A、C、G、和U，经修饰的核糖核苷酸，以及非核糖核苷酸。“核糖核苷酸”是指在D-呋喃核糖部分的2’位置上有羟基的核苷酸。[0049]如在此使用的，术语以及短语“RNA”、“RNA分子”、以及“RNA序列”可互换使用，以便指代介导RNA干扰的RNA。这些术语和短语包括单链RNA、双链RNA、分离的RNA、部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组RNA、细胞内的RNA，以及也包括通过添加、删除、置换、和/或改变天然发生的RNA的一个或多个核苷酸而与天然发生的RNA不同的RNA。[0050]“干扰RNA”(例如SiRNA和miRNA)是能够进行转录后基因沉默或抑制、RNA沉默、和/或减少基因表达的RNA分子。干扰RNA通过与靶标核酸的mRNA序列的碱基配对而影响动物和植物中的序列特异性的、转录后的基因沉默。因此，SiRNA至少部分地与沉默基因互补。部分互补的siRNA可以包括一个或多个错配、凸起、内部环、和/或非沃森-克里克碱基对(即G-U摇摆碱基对)。[0051]术语“沉默”和“抑制”可互换使用以便一般地描述在细胞中可获得的由核糖体结合并解码的靶标mRNA实质地和可测量地减少量。经转录的RNA可以处于有义方向而发挥作用，称为共抑制，处于反义方向而发挥作用，称为反义抑制，或在两个方向上产生双链RNA而发挥作用，称为RNA干扰。“沉默”基因包括其本身定义内的基因，该基因是指经受由基因编码的mRNA的沉默或抑制的基因。[0052]微RNA由基因编码，该基因被转录但是不被翻译成蛋白(非-编码DNA)，尽管一些miRNA是由与蛋白编码基因部分重叠的序列编码的。通过背景的方法，miRNA从称为初级mirna(pri_miRNA)的初级转录本被加工为被称为前miRNA(pre_miRNA)的短的莖环结构，该前miRNA进一步由一种或多种切丁酶作用进行加工，以产生功能性siRNA/miRNA。典型地，前体miRNA的一部分被切割以产生最终的miRNA分子。茎环结构的范围可以是从例如约50至约80个核苷酸、或约60个核苷酸至约70个核苷酸(包括miRNA残基，与miRNA配对的那些、以及任何介入区段)。茎环结构的二级结构不是完全碱基配对的；错配、凸起、内部环、非沃森-克里克碱基配对(即G-U摇摆碱基对)、以及其他的特征频繁地在前miRNA中观察到，并且认为此类特征对于加工是重要的。成熟的miRNA分子与一个或多个mRNA分子部分地互补，并且它们作用是调苄基因表达。本发明的siRNA具有内源miRNA的结构和功能特性(即，基因沉默和抑制功能)。因此，本发明的多方面中，本发明的siRNA能从miRNA、从靶标基因序列信息得到，或能基于本领域已知的预测模型合成地生产。[0053]短语“靶标特异性小干扰RNA”、“靶标特异性siRNA”、“靶标特异性微RNA”、“靶标特异性miRNA”、“靶标特异性amiRNA”、以及“靶标特异性核苷酸序列”是指已经被设计为选择性地与靶标生物中但不是非靶标生物(例如宿主生物-表达或产生miRNA的生物)，或者宿主生物的消费者中的核酸杂交的干扰RNA。因此，“靶标特异性siRNA”仅仅在靶标生物中产生表型而在非靶标生物中不产生表`型。在本发明中，靶标特异性siRNA选择地与对于宿主生物体而言是内源的核酸杂交,该宿主生物体是植物。[0054]微RNA(miRNA)是非蛋白编码RNA，一般地在约19至约25个核苷酸之间(通常地在植物中约20-24个核苷酸)。miRNA直接反式切割靶标转录本，以调节涉及各种调节和发育途径的基因表达(Bartel(巴特尔)，Cell(《细胞》)，116:281-297(2004);Zhang(张)等?Dev.Biol.(《发育生物学》)289:3-16(2006))。已经显示miRNA涉及植物生长和发育以及信号转导和蛋白降解中的不同方面。另外，日益增长的证据说明:小内源mRNA(包括miRNA)还可以参与生物胁迫响应，比如寄生体袭击。自从第一个miRNA在植物中被发现(Reinhart(莱因哈特))等GenesDev.(《基因和发育》)16:1616-1626(2002)，Park(帕克)等.Curr.Biol.(《当代生物学》)12:1484-1495(2002))，成千上万的miRNA已经被鉴定。此外，许多植物miRNA已经显示出跨十分趋异的分类群的高度保守性。(Floyd(弗洛伊德)等，Nature(《自然》)428:485-486(2004);张等，PlantJ.(《植物学杂志》)46:243-259(2006))。许多微RNA基因(MIR基因)已经被鉴定并且在数据库("miRBase,"可在以下网站获得，microrna.sanger.ac.uk/sequences)中公开地可获得。miRNA还在美国专利公开2005/0120415和2005/144669A1中被描述，其全部内容通过引用被结合在此。[0055]如在此使用的，“异源的”指一种核苷酸序列，该序列来源于另一种物种或来自相同物种或生物体，但是对其原初形式或在细胞中表达的初始形式进行了修饰。因此，衍生自与将其引入的细胞所属的有机体或物种不同的有机体或物种的核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的子代而言是异源的。另外，异源核苷酸序列包括这样的一种核苷酸序列，它衍生自或插入相同的天然原初细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在自然界中天然发现的那些所不同的调节序列的控制下。[0056]如在此使用的，术语“增力卩(increase)”、“增加的(increased)”、“增强(enhance)”、“增强的(enhanced)”、“增强的(enhancing)”以及“增强(enhancement)”(及其语法上的变体)描述了一种植物对一种寄生体抗性的增加(例如,对大豆胞囊线虫具有增加的抗性的大豆植物)，这是通过将本发明的异源miRNA核苷酸序列引入该植物来进行的，由此产生一种对该寄生体具有增加的抗性的转基因植物。这一增加可以通过将经本发明的异源miRNA核苷酸序列转化的植物的抗性与未经本发明的异源miRNA核苷酸序列转化的植物(例如，大豆)相比较而观察到(例如，经异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物与未经异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物相比较)。[0057]如在此使用的，术语“核酸(nucleicacid)”、“核苷酸分子(nucleicacidmolecule)”和/或“核苷酸序列(nucleotidesequence)”指核一种核苷酸杂聚物或来自一种核酸分子的5'至3'末端的这些核苷酸的序列并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段、基因组DNA、合成(例如，化学合成)的DNA、质粒DNA、mRNA以及反义RNA，其中的任一项都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在此也可互换用来指核苷酸的杂聚物。在此提供的核酸序列以5’至3’方向、从左至右存在，并且使用如在美国专利商标局(U.S.PatentandTrademarkOffice),37CFR§§1.821-1.825以及世界知识产权组织标准ST.25(WorldIntellectualPropertyOrganization(WIPO)StandardST.25)中所阐明的用于表示核苷酸字符的标准编码来示出。[0058]如在此使用的，术语“基因”指能够用来产生mRNA、反义RNA、miRNA等的核酸分子。基因可以能或不能使用来产生功能蛋白或基因产物。基因可以包括编码与非编码的区域(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'以及3'非翻译区域)。基因可以是“分离的”，这意指一种核酸，其实质上或基本地不含正常情况下发现的在其天然状态下与这种核酸结合的组分。此类组分包括其他细胞物质、来自重组生产的培养基和/或在化学合成所述核酸时所用的各种化学品。[0059]如在此使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配发生天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两单链分子之间的互补性可以是“部分的(partial)”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有明显影响。[0060]术语“核酸片段(nucleicacidfragment)”应理解为意为一种相对于参考核酸或核苷酸序列长度减少的核苷酸序列并且包括与该参考核酸或核苷酸序列一致或几乎一致(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%,99%同一性)的连续核苷酸的核苷酸序列，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种核酸片段可以包含于它作为组分的较大多核苷酸内。在一些实施例中，此类片段可以包含具有根据本发明的核酸或核苷酸序列的至少大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、或1000个连续核苷酸长度的寡核苷酸，或基本上由其组成和/或由其组成。[0061]本发明的“分离的”核酸大体上没有该核酸衍生自其中的生物体的基因组DNA中的该感兴趣的核酸的侧翼核酸序列(比如存在于5'或3'末端的编码序列)。然而，本发明的该核酸可以包括一些另外的碱基或部分，它们不会有害地影响该核酸的碱基结构和/或功能特征。“分离”不意指制备物在技术上是纯的(同质的)。[0062]因此，“分离的核酸”以一种不同于其在自然界中发现的那样的形式或背景存在并且并不与它在其中衍生自的生物体的天然发生的基因组中紧密连续(一个在5'末端并且一个在3'末端)的核苷酸序列紧密连续。因此，在一个实施例中，一个分离的核酸包括一些或全部的5'非编码(例如，启动子)序列，这些序列紧接编码序列。该术语因此包括，例如，一种重组核酸，它结合进入一种载体、进入一种自我复制的质粒或病毒、或进入一种原核生物或真核生物的基因组DNA，或者它作为独立于其他序列的一种单独分子(例如，一种cDNA或一种利用PCR或限制性内切核酸酶处理所得到的基因组DNA片段)而存在。因此，在自然界中发现的、从其原生环境中移除并且转化进入植物的核酸仍被认为是“分离的”，甚至当其结合进入所产生的转基因植物的基因组中的时候。它还包括重组核酸，该重组核酸是编码额外多肽或肽序列的杂交核酸的部分。[0063]术语“分离”可以进一步指基本上不含细胞物质、病毒物质和/或培养基(例如，通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学品(例如，化学合成时)的核酸、核苷酸序列、多肽、肽或片段。此外，“分离的片段”是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，该片段不天然地作为片段存在并且不会按照原样以天然状态被发现。“分离”不意指制备物在技术上是纯的(同质的)，但它充分纯，以提供处于一种可以用于预期目的之形式的多肽或核酸。[0064]术语“多肽(polypeptide)”、“蛋白(protein)”和“肽(peptide)”指一种共价地连接的氨基酸链。总体上，术语“(P印tide)”可以指更短的氨基酸链(例如，2-50个氨基酸)；然而，所有三个术语在该氨基酸链长度方面重叠。如在此所用，术语“蛋白”与“多肽”是互换地使用并且包括肽，除非另外说明。多肽、蛋白以及肽可以包括自然发生的氨基酸、非自然发生的氨基酸、或两者的一种组合。这些多肽、蛋白以及肽可以分离自它们自然发生于其中的来源(例如细胞或组织)，可以在活体内或体外细胞中或者在体外试管中进行重组生产，或者进行化学合成。此类技术对于该领域的技术人员是已知的，参见举例，Sambrook(萨姆布鲁克)等，MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.(《分子克隆:实验室手册第二版》)(ColdSpringHarbor,NY,1989(冷泉港，纽约，1989)));Ausubel(奥苏贝尔)等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《分子生物学实验指南》)(GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnffiley&Sons,Inc.,NewYork(格林出版联合公司以及约翰威利父子公司，纽约))。[0065]术语“片段(fragment)”，如适用于多肽，应理解为意为一种相对于参考多肽或氨基酸序列长度减少的氨基酸序列并且包含与该参考多肽或氨基酸序列一致的连续氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明，在适宜的情况下，这种多肽片段可以包含于它作为组分的较大多多肽内。在一些实施例中，这类片段可以包含以下肽、基本上由其组成和/或由其组成，其中所述肽具有本发明的多肽或氨基酸序列的至少约4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或更多个连续氨基酸的长度。可以通过本领域内熟知的方法与路径来产生多肽或蛋白的片段，比如，通过天然发生的肽或多肽的酶切或其他切割或者通过熟知的合成方案。[0066]多肽片段可以是生物活性片段。“生物活性片段”或“活性片段”指保留参考多肽的一种或多种生物活性的片段。可以根据本领域所述的方法(这些方法是用于测试多肽活性的例行方法)和/或根据本领域已知和例行的用于鉴定这类活性的任何方法测试这类片段的生物活性。多肽的生物活性片段的产生与鉴定测试会很好地处在本领域内的普通技术人员的范围之内并且会是常规的。如此，本发明进一步提供了多肽(比如感兴趣的多肽)的生物活性片段以及编码此类生物活性多肽片段的多核苷酸。[0067]如在此使用的，术语“转基因”指在植物、动物或其他有机体的转化中使用的任何核酸序列。因此，转基因可以是编码序列、非编码序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因组序列、调节元件等。“转基因”有机体，例如转基因植物、转基因微生物、或转基因动物，是已经向其中递送或导入转基因的有机体并且该转基因可以在这种转基因有机体中表达以产生一种产物，该产物的存在可以在这种有机体中赋予一种效果和/或表型。[0068]具有同源性的不同核酸或多肽在此称作“同源物”。术语“同源物”包括来自相同物种和其他物种的同源序列和来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”指就位置同一性(即，序列相似性或同一性)而言，两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。[0069]如在此使用的，“序列同一性”指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在比对整个组分(例如核苷酸或氨基酸)的窗口范围内不变动的程度。“同一性(identity)”可以通过已知方法容易地计算出，这些方法包括但不限于描述于以下文献中那些ComputationalMolecularBiology(《计算分子生物学》)(Lesk,A.M.(莱克斯，A.M.)编著)OxfordUniversityPress(牛津大学出版社)，NewYork(纽约)(1988)；Biocomputing:1nformaticsandGenomeProjects(《生`物计算信息与基因组预测》)(Smith,D.ff.(史密斯，D.W.)编著)AcademicPress(《学术出版社》)，NewYork(纽约)(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,PartI(《序列数据的计算分析,部分I》)(Griffin,A.M.(格里芬，A.M.),以及Griffin,H.G.(格里芬，H.G.)编著)HumanaPress(Humana出版社),NewJersey(新泽西州)(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology(《分子生物学中的序列分析》)(vonHeinje,G.(冯海杰，G.)编著)AcademicPress(学术出版社)(1987);以及SequenceAnalysisPrimer(《序列分析引物》)(Gribskov,M.(哥博斯科夫，M.)以及Devereux,J.(德福罗，J.)编著)StocktonPress(Stockton出版社)，NewYork(纽约)(1991)。[0070]检验序列和参比序列的所比对节段的同一性分数摂是由这两个比对序列共有的相同组分的数目除以参比序列节段(即完整的参比序列或参比序列的更小限定的部分)中组分的总数目。如在此使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在两个序列最佳比对(在比较窗口范围内具有总计小于参考序列20%的适当核苷酸插入、缺失或空位)时，与检验(“对象”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参比(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的直链多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“同一丨I"生百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。[0071]用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以由以下工具实施:如Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)的局部同源性算法、Needleman(尼德曼)和WunschWunsch(翁施)的同源性比对算法、Pearson(皮尔森)和Lipman(利普曼)的相似性搜索方法，并且任选地由这些算法的计算机化执行，如作为GCG⑧WisconsinPackage?(AccelrysInc.(材料科学软件公司)，Burlington(伯灵顿)，Mass.(马萨诸塞州))的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。检验序列和参比序列的所比对节段的“同一性分数”是由这两个比对序列共有的相同组分的数目除以参比序列节段(即完整的参比序列或参比序列的更小限定的部分)中组分的总数目。序列同一性百分数表述为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其部分，或相对于较长的多核苷酸序列。出于本发明的目的，还可以使用针对翻译的核苷酸序列的BLASTX2.0版以及针对多核苷酸序列的BLASTN2.0版，确定“同一性百分比”。[0072]可以使用序列分析软件包?(版本10;GeneticsComputerGroup,Inc.(基因计算集团公司)，Madison(麦迪逊)，Wis.(威斯康辛州))的“BestFit”或“Gap”程序确定序列同一性百分比。“Gap”使用Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，JMol.Biol.(《分子生物学杂志》)48:443-453,1970)来找到两个序列的使匹配数最大化并使空位数最小化的比对结果。“BestFit”执行两个序列之间最佳相似性区段的最佳比对并且使用Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)的局部同源性算法插入空位以使匹配数最大化(Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)，Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)，2:482-489，1981，Smith(史密斯)等，NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)11:2205-2220，1983)。[0073]用于确定序列同一1丨生的有用方法也在GuidetoHugeComputers(《大型计算机指南》)(MartinJ.Bishop(马丁J.毕夏普)编著，AcademicPress(学术出版社)，圣迭戈(1994))以及Carillo,H.(卡里略，H.)和Lipton,D.(立顿，D.)(AppliedMath(《应用数学》)48:1073(1988))中披露。更具体地，优选的用于确定序列同一性的电脑程序包括但不局限于:公共可获得的来自国家生物技术信息中心(NationalCenterBiotechnologyInformation,NCBI)的基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)，该NCBI是在美国国立卫生研究院(贝塞斯达，马里兰州，20894)的国家医学库中；参见BLAST手册，Altschul(阿尔丘尔)等，NCBI,NLM,NIH;(Altschul(阿尔丘尔)等，J.Mol.Biol.(《分子生物学期刊》)215:403-410(1990))；2.0版本或更高版本的BLAST程序允许缺口(缺失或插入)引入比对中；对于妝序列可以使用BLASTX对序列同一性进行确定；并且对于多核苷酸序列可以使用BLASTN对序列同一性进行确定。[0074]因此，本发明进一步提供了与本发明的核苷酸序列具有显著序列同一性的核苷酸序列。显著的序列相似性或同一性意为与另一个核苷酸序列至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%、99%和/或100%的相似性或同一丨I"生。[0075]在上下文中，所感兴趣的一种核苷酸序列(例如，miR164)的“引入(introducing)”意为将该感兴趣的核苷酸序列提供给该植物、植物部分和/或植物细胞，其方式为该核苷酸序列进入细胞内部。在有待引入一种以上的核苷酸序列的情况下，这些核苷酸序列可以作为一种单一的多核苷酸或核酸构建体的部分、或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中，或作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入到植物细胞中。因此，如在此使用的，术语“转化”指将异源核酸导入细胞中。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。[0076]如此，在一些具体实施例中，向植物、植物部分和/或植物细胞中的引入是通过细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙烯二醇介导的转化、以及其他的致使核酸引入该植物、植物部分和/或其细胞的电的、化学的、物理的和/或生物的机制，或其组合。[0077]如在此使用的，术语“减少(reduce)”、“减少的(reduced)”、“减少(reducing)”、“减少(reduction)”、“减小(diminish)”以及“降低(decrease)”(及其语法上的变体)描述了一种植物上(例如，大豆)的大豆胞囊线虫胞囊形成的降低，这是通过将本发明的miRNA引入该植物来进行的，由此产生一种在该转基因植物上具有降低的或减少的胞囊形成的转基因植物。可以通过将经该异源miR164核苷酸序列转化的植物上形成的胞囊数目与未经该异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物上形成的胞囊数目进行比较来观察胞囊形成方面的这一降低。[0078]在被引入细胞中的多核苷酸的背景下，“稳定转化(stablyintroducing)”或“稳定引入(stablyintroduced)”意在指稳定地结合进入该细胞的基因组的被引入的多核苷酸，并且由此该细胞经该多核苷酸进行了稳定转化。如在此使用的，“稳定转化(Stabletransformation)”或“被稳定地转化的(stablytransformed)”意为一种被引入细胞并且整合进入该细胞的基因组的核酸。按照这样，该整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如在此使用的，“基因组(genome)”还包括核基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸整合进入例如叶绿体基因组。如在此使用的，稳定转化也可以指以染色体外方式(例如，作为微型染色体)维持的转基因。[0079]瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，它们可以检测由一个或多个导入有机体的转基因编码的肽和多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与多种核酸序列(这些序列与导入有机体(例如,植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交)的DNA印记杂交测定法检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与多种核酸序列(这些序列与导入植物或其他有机体的转基因的核苷酸序列特异性杂交)的RNA印迹杂交测定法检测。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域内熟知的其他扩增反应来进行检测，这些反应采用与转基因的一个或多个靶标序列杂交的特异性引物序列，从而导致该转基因序列的扩增，这种扩增可以根据标准方法进行检测。转化也可以通过直接测序和/或本领域熟知的杂交方案进行检测。[0080]核酸(例如，ZsGreen)可以通过任何本领域普通技术人员已知的方法导入细胞中。在本发明的一些实施例中，细胞转化包括细胞核的转化。在其他实施例中，细胞的转化包括质体转化(例如，叶绿体转化)。[0081]用于转化植物的程序是熟知的并且在本领域内是常规的并且在文献中普遍描述。用于植物转化的方法的非限制性实例包括:通过以下的转化:细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)，病毒介导的核酸递送，碳化硅或核酸须介导的核酸递送，脂质体介导的核酸递送，微注射，微粒轰击，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，纳米颗粒介导的转化，声处理，浸润，PEG介导的核酸吸收，以及任何其他的致使核酸引入该植物细胞的电的、化学的、物理的(机械的)和/或生物的机制，包括其任何组合。在本领域内已知的不同的植物转化方法的一般指南包括Miki(米琪)等("ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants"inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology(在《植物分子生物学与生物技术》的方法中“用于将外来DNA引入植物的程序”)，Glick,B.R.(克里克，B.R.)与Thompson,J.E.(汤普森，J.E.)编著(CRCPress,Inc.，(CRC出版公司)BocaRaton(波卡拉顿)，1993),67-88页)以及Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.(《细胞分子生物学通讯》)7:849-858(2002))。[0082]因此，在一些具体实施例中，向植物、植物部分和/或植物细胞中的引入是通过细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙烯二醇介导的转化、以及其他的致使核酸引入该植物、植物部分和/或其细胞的电的、化学的、物理的和/或生物的机制，或其组合。[0083]农杆菌介导的转化是用于转化植物，尤其是双子叶植物的一种普遍使用的方法，因为它的高转化效率以及它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体转移到适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质体上或染色体地携带的vir基因的互补(Uknes(乌肯斯)等，(1993)PlantCell(《植物细胞》)5:159-169)。将该重组二元载体转移至农杆菌可以利用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株(该辅助菌株携带一种质粒，该质粒能够将该重组二元载体移动到IE标农杆菌菌株中)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(Hofgen&ffillmitzer(1988),NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)16:9877)。[0084]通过重组农杆菌转化植物通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的方法。将转化的组织在携带有位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上进行再生。[0085]另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性的或生物学活性的粒子。参见，例如，美国专利号4，945，050;5，036，006和5，100,792。总体上，这种方法涉及在有效穿透该细胞的外表面并提供结合进入其内部中的条件下在植物细胞处推进惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性粒子(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一个或多个力图导入的核酸)推入植物组织中。[0086]因此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域内已知的任何方法或如在此描述地进行转化并且可以使用多种已知技术中的任一种来从这些经转化的细胞再生出完整的植物。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生被描述于，例如，Evans(埃文斯)等,HandbookofPlantCellCultures(《植物细胞栽培手册》)第I卷,MacMilan出版公司，纽约(1983);和Vasil1.R.(瓦西尔1.R.)(编著)CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(《植物细胞培养和体细胞遗传》),Acad.Press(学术出版社)，Orlando(奥兰多)，第I卷，(1984)，和第II卷(1986))。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法是本领域常规的，并且可以用于在此提供的本发明方法中。[0087]同样地，工程化进入以上描述的本发明的转基因种子与植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长被传递，并且因此可以在子代植物中被维持和遗传。总体而言，维持和繁殖利用了已知的农业方法，这些方法被开发为适合特定目的(如收获、播种或耕作)。[0088]实例1:转基因玉米棺物中ZsGreen的沉默[0089]制造了ZsGreen-转基因玉米载体15779,并且显不在图1中。在名称为Reef-Coralproteinsasvisual,non-destructivereportersforplanttransformation(珊瑚礁蛋白，植物转化的直观的、无损的报告者)的公开中更全面描述了该ZsGreen荧光蛋白。PlantCellRep(《植物细胞报告》)(2003)22:244-251。该载体被转化入卸甲根癌农杆菌菌株LBA4404中，该根癌农杆菌菌株含有辅助质粒pSBl。[0090]双链RNA从已知的ZsGreen的序列产生。根据本发明可以使用从靶标基因衍生的各种不同长度的双链RNA。仅以举例的方式，下列序列被用于本发明的配制品中。这个序列是编码序列SEQIDNOI的DNA的双链RNA版本(version)。[0091]【权利要求】1.一种将双链RNA整合至植物细胞中的方法，该方法包括:a)提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、以及一种植物激素油菜素类固醇，b)将该配制品应用于一种活体植物的叶片表面，其中该双链RNA从该外部叶片表面被吸收至该植物叶片的细胞中。2.如权利要求1所述的方法，其中在该配制品中的油菜素类固醇是在0.8微摩尔至约1.6微摩尔。3.如权利要求1所述的方法，其中该双链RNA约为250ng/ul。4.如权利要求1所述的方法，其中，应用该配制品的步骤是对于从发芽起约12天的活体植物而言的。5.如权利要求1所述的方法，其中该植物是一种双子叶植物。6.如权利要求1所述的方法，其中该植物是一种玉米植物。7.如权利要求1所述的方法，其中该植物是一种烟草植物。8.如权利要求1所述的方法，其中该基因特异性双链RNA是由选自下组的基因衍生的，该组由以下各项组成:谷氨酰胺合成酶；八氢番茄红素脱氢酶；FtsH蛋白酶。9.应用于植物外表面的一种配制品，该配制品包括双链RNA、H20、以及一种植物激素油菜素类固醇。10.如权利要求9所述的配制品，其中在该配制品中的油菜素类固醇是在0.8微摩尔至约1.6微摩尔。11.如权利要求9所述的配制品，其中该双链RNA约为250ng/ul。12.—种将双链RNA整合至一种植物细胞中的方法，该方法包括:a)提供一种配制品，该配制品包括:一种基因特异性双链RNA、H20、以及一种植物激素，b)将该配制品应用于一种活体植物的叶片表面，其中该双链RNA从该外部叶片表面被吸收至该植物叶片的细胞中。【文档编号】C12N15/87GK103748230SQ201280039977【公开日】2014年4月23日申请日期:2012年8月14日优先权日:2011年8月16日【发明者】汤国庆申请人:先正达参股股份有限公司