磷脂酸磷酸酶基因的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供磷脂酸磷酸酶基因。上述课题通过提供包含序列号1、序列号4或序列号5的碱基序列的核酸及包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质以及这些的突变体来解决。
【专利说明】磷脂酸磷酸酶基因
【技术领域】
[0001]本发明申请涉及新型磷脂酸磷酸酶基因及其利用。
【背景技术】
[0002]包含2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA polyunsaturatedfatty acid),已知有花生四烯酸、二高Y亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。该多不饱和脂肪酸中包含在动物体内无法合成的多不饱和脂肪酸，对于此种多不饱和脂肪酸，作为必需脂肪酸需要从食物中摄取。多不饱和脂肪酸分布广泛，例如花生四烯酸可从由动物的肾上腺、肝脏中提取的脂质中分离。但是，动物脏器中所包含的多不饱和脂肪酸为少量，仅从动物脏器中提取或分离多不饱和脂肪酸，不足以进行大量供给。因此，不断在开发培养各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物作为生产含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的脂质的微生物而广为人知。
[0003]此外，还进行了在植物中生产多不饱和脂肪酸的尝试。已知多不饱和脂肪酸构成三酰甘油(也称为甘油三酯、TG)等的贮藏脂质，在微生物的菌体内或植物种子中积累。
[0004]作为贮藏脂质的三酰甘油在生物体内如下生成。通过甘油一3—磷酸酰基转移酶向甘油一 3—磷酸转移酰基而生成溶血磷脂酸，通过溶血磷脂酸酰基转移酶向溶血磷脂酸转移酰基而生成磷脂酸，磷脂酸通过磷脂酸磷酸酶脱磷酸化而生成二酰甘油，通过二酰甘油酰基转移酶向二酰甘油中转移酰基而生成三酰甘油。
[0005]在上述途径中，磷脂酸(phosphat idic acid,以下也有时记为“PA”。此外，也有时记为1，2-二酰基一sn—甘油一3—磷酸。)在为三酰甘油的前体的同时，还为二酰基型甘油磷脂的生物合成的前体。在酵母等中，由PA和胞嘧啶核苷5’ —3磷酸(CTP)通过磷脂酸胞苷酰转移酶合成CDP 二酰甘油(CDP-DG)，生物合成各种磷脂。
[0006]如上所述，已知将PA脱磷酸化而生物合成二酰甘油(diacylglycerol,以下有时也记为“DG”。)的反应由磷脂酸磷酸酶(E.C.3.1.3.4>phosphatidic acid phosphatase,以下也记为“PAP”。)催化。已知该PAP存在于从细菌到脊椎动物的所有的生物中。
[0007]已知在作为真菌类的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevi siae))中，有2种类型的PAP (非专利文献1、2、7)。一个类型为Mg2+依赖性的PAP(PAPl)，另一类型为Mg2+非依赖性的PAP (PAP2)。作为编码PAPl的基因，已知有PAHl基因(非专利文献3~5)，由于pah I Λ突变株具有PAPl活性，所以，认为还有其他承担PAPl活性的基因。已知在pahl Δ突变株中，核膜、ER的膜异常扩张，进而成为磷脂生物合成的关键的基因表达异常增高(非专利文献6)。
[0008]另一方面，作为编码PAP2的基因，已知有DPPl基因和L PPl基因，这些基因基本承担了酵母的PAP2活性。已知这些基因所编码的酶的底物特异性广泛，作用于二酰甘油焦憐酸酯(DGPP)、溶血憐脂酸、sphingoid base phosphate、isoprenoid phosphate等而进行脱磷酸化。
[0009]在作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)中，作为Mg2+依赖性的PAPl同源物，已知有MaPAHl.1和MaPAHl.2的2种(专利文献I)。此外，还已知作为Mg2+非依赖性的PAP2同源物的MaPAPl基因(专利文献2)。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献I国际公开公报第W02011/081135号公报
[0013]专利文献2国际公开公报第W02009/008466号公报
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献IBiochem.Biophys.Acta, 1348,45-55,1997
[0016]非专利文献2Trends Biochem Sc1.，31 (12)，694-699，2006
[0017]非专利文献3EMB0 J.，24，1931-1941，2005，
[0018]非专利文献4J.Biol.Chem.，281 (14)，9210-9218，2006
[0019]非专利文献5J.Biol.Chem.，281 (45)，34537-34548，2006
[0020]非专利文献6J.Biol.Chem.，282 (51)，37026-37035，2007
[0021]非专利文献 7J.Biol.Chem.，284 (5)，2593-2597，2009
【发明内容】
[0022]至今为止已报道了一些PAP基因，但对导入宿主细胞使其表达时可使该宿主所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸组成发生改变进行研究的例子非常少。期望导入如下新型基因，通过导入宿主细胞或使其表达，可制造目标脂肪酸组成的油脂或使目标脂肪酸含量增加。
[0023]本发明的目的在于提供新型磷脂酸磷酸酶基因及由其编码的蛋白质以及这些利用法。
[0024]本
【发明者】为解决上述课题而进行了深入研究。首先，分析脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组,从中提取与已知的Mg2+非依赖性的磷脂酸磷酸酶(PAP2)基因具有同源性的序列。进而为获得编码PAP的开放阅读框(ORF)的全长，通过cDNA文库的筛选或通过PCR克隆全长cDNA。将该基因导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞，确认出由经过克隆的eDNA编码的蛋白质具有磷脂酸磷酸酶活性。由此，成功地克隆了与新型磷脂酸磷酸酶(PAP)有关的基因，从而完成了本发明。即在其方式之一中，本发明可如下。
[0025](I) 一种核酸，其特征在于，为以下(a)~(g)中任一项所述的核酸:
[0026](a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0027](b)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0028](c)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0029](d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0030](e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的喊基序列；
[0031](f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
[0032](g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
[0033](2) 一种核酸，其特征在于，为以下(a)~(g)中任一项所述的核酸:
[0034](a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1~110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0035](b)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0036](c)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0037](d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；
[0038](e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSt、50°C的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的喊基序列；
[0039](f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；
[0040](g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
[0041](3) 一种核酸，其特征在于，为以下(a)~(d)中任一项所述的核酸:
[0042](a)核酸，其包含序列号I表示的碱基序列或其部分序列；
[0043](b)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；
[0044](c)核酸，其包含序列号4表示的碱基序列或其部分序列；
[0045](d)核酸，其包含序列号5表示的碱基序列或其部分序列。
[0046](4)根据⑴或⑵中所述的核酸，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。
[0047](5) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质:
[0048](a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；
[0049](b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
[0050](6) 一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质:
[0051](a)蛋白质，其由序列号2中1~110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；[0052](b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
[0053](7)根据(5)或(6)中所述的蛋白质，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。
[0054](8) 一种蛋白质，其特征在于，由序列号2表示的氨基酸序列组成。
[0055](9) 一种重组载体，其特征在于，含有(I)~(4)中任一项所述的核酸。
[0056](10) 一种转化体，其特征在于，由(9)中所述的重组载体转化。
[0057]本发明提供新型PAP基因及由其编码的蛋白质以及这些的利用法。与未导入PAP的宿主所产生的脂肪酸组合物相比，可期待本发明的PAP可在宿主中产生组成不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所需特性、效果的脂质，所以，可作为适用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的脂质而有用。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1-1表示MaPAP2.2的基因组序列及⑶S的碱基序列。
[0059]图1-2为图1-1的延续。
[0060]图2为MaPAP2.2的氨基酸序列与来自双色蜡蘑的推定蛋白质及来自酵母的ScDPPl (YDR284C:注册号AAS56070))的氨基酸序列的比对。
[0061]图3为MaPAP2.2的氨基酸序列与作为来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的Mg2+非依赖性PAP(PAP2)而已知的MaPAPl (W02009/008466)的氨基酸序列的比对。双下划线表示Mg2+非依赖性的磷脂酸磷酸酶2型(PAP2)家族酶的3个保守区(从N末端侧开始按顺序为结构域1、结构域2及结构域3)。*表示PAP活性中必须的氨基酸。
[0062]图4为表示涉及MaPAP2.2将18:2_PA转变为18:2_DG的活性，并对Mg2+依赖性进行研究的结果图(H=I)。A表示添加Mg2+时的结果。B表示添加EDTA时(不含Mg2+)的结果。纵轴表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18:2的量(μ g/mg.蛋白质)。
[0063]图5为表示对不含Mg2+的反应液中的MaPAP2.2⑷及MaPAPl⑶将18:2_PA转变为18:2-DG的活性进行研究的结果图(n=3)。纵轴表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18:2的量(μ g/mg.蛋白质)。
[0064]图6A为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中不添加作为底物的磷脂酸时，对18 =1-DG量进行研究的结果图(n=3)。图6B为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中添加作为底物的18 =1-PA时，对反应后18 =1-DG量进行研究的结果图(n=3)。纵轴均表示在DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18:1的量(μ g/mg.蛋白质)。
[0065]图7为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中添加作为底物的17 =O-PA时，对反应后17 =O-DG量进行研究的结果图(n=3)。纵轴均表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中17:0的量(μ g/mg.蛋白质)。
【具体实施方式】
[0066]本发明涉及来自被孢霉属(Mortierella)的新型磷脂酸磷酸酶基因、由其编码的蛋白质、及这些的利用法，其特征在于，使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油。[0067]本发明的磷脂酸磷酸酶为催化使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油的反应的酶。本发明的PAP的底物通常为磷脂酸，但不限于此。
[0068]编码磷脂酸磷酸酶的核酸
[0069]本发明的磷脂酸磷酸酶(PAP)中包含MaPAP2.2及其突变体。将编码MaPAP2.2核酸的cDNA、⑶S、ORF及氨基酸序列的对应关系整理记入以下表1中。
[0070]表1
【权利要求】
1.一种核酸，其特征在于，为以下(a)~(g)中任一项所述的核酸: (a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列； (g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有70%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
2.—种核酸，其特征在于，为以下(a)~(g)中任一项所述的核酸: (a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中I~110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (b)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (c)核酸，其包含与由序列号I组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列； (e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的喊基序列； (f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列； (g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。
3.—种核酸，其特征在于，为以下(a)~(d)中任一项所述的核酸: (a)核酸，其包含序列号I表示的碱基序列或其部分序列； (b)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列； (c)核酸，其包含序列号4表示的碱基序列或其部分序列； (d)核酸，其包含序列号5表示的碱基序列或其部分序列。
4.根据权利要求1或2中所述的核酸，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。
5.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质: (a)蛋白质，其由序列号2中I个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有70%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
6.一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质: (a)蛋白质，其由序列号2中I~110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性； (b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。
7.根据权利要求5或6中所述的蛋白质，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷 脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。
8.一种蛋白质，其特征在于，由序列号2表示的氨基酸序列组成。
9.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求1~4中任一项所述的核酸。
10.一种转化体，其特征在于，由权利要求9中所述的重组载体转化。
【文档编号】C12N1/15GK103703132SQ201280036981
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2011年7月29日
【发明者】落合美佐 申请人:三得利控股株式会社