调控毒素和抗毒素基因用于生物防范的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及对基因工程微生物(例如蓝藻菌或真核藻类株系)中的毒素和/或抗毒素基因的调控，具体地用于防止所述微生物的无意和/或不受控制的扩散。本发明还包括控制所述工程微生物的生长和/或存活的方法。
【专利说明】调控毒素和抗毒素基因用于生物防范
[0001]相关申请案交叉参考
[0002]本申请案主张2011年6月30日提出申请的标题为“调控毒素和抗毒素基因用于生物防范(Regulation of Toxin and Antitoxin Genes for Biological Containment) ”的美国临时申请案61/503，306的优先权权益，所述案件的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0003]序列表参考
[0004]本申请案含有对作为序列表文本文件“60977590_1.txt”与此同时提交的氨基酸序列和/或核酸序列的参考，所述文本文件的文件大小是76千字节(KB)并且在2012年6月27日创建。依据37C.F.R.§ 1.52(e) (5)，上述序列表的全部内容以引用的方式并入本文中。
【技术领域】
[0005]本发明涉及对微生物中的毒素和/或抗毒素基因表达的调控，具体地用于防止微生物的无意或不受控制的扩散。本发明还涉及控制微生物(例如基因工程原核或真核藻类)的生长和/或存活的方法。
【背景技术】
[0006]近来，基因修饰微生物作为产生食物、生物活性化合物及生物燃料的生物工厂已引起极大关注。然而，基因修饰微生物从预期的培养场所扩散出来进入自然生态系统中是主要的监管考虑问题(regulatory concern)。一些生物防范策略可导致基因修饰微生物通过表达编码致命蛋白质的异源基因而自毁。已考虑若干种细菌毒素作为用于细菌防范系统的优良候选者，包括膜失稳或孔形成蛋白以及攻击细胞的遗传物质的酶。然而，在许多情况下，引入微生物中的毒素基因的突变导致毒素基因的功效随时间降低。
[0007]II型毒素-抗毒素系统广泛分布在原核生物中(万.梅德仁(Van Melderen)及得.巴斯特(De Bast) (2009) PLoS 遗传学(PLoS Genetics) 5:el000437 ;马扎科娃(Marakova)等人(2009)生物学指南(Biology Direct) 4:19)。这些毒素基因通常编码干扰转录(例如，通过抑制DNA促旋酶)或转译(通过干扰核糖体功能或通过使RNA转录物降解)的蛋白质。具有内切核糖核酸裂解活性(endoribonucleolytic activity)的毒素有时称为“RNA干扰酶”，并且包括例如细菌毒素MazF、pemK、RelE、HicB、HipA、Doc、VapC、yafQ、yhaV及tasB以及其它。毒素基因的表达紧密地受驻留在具有毒素基因的操纵子中的抗毒素基因控制。通常，抗毒素是转录物的第一基因并且与毒素基因重叠I到10个核苷酸，从而容许抗毒素相对于毒素更有效地转译。抗毒素与毒素形成稳定的复合物，从而导致毒素失活。抗毒素-毒素复合物还结合到TAS的启动子,从而阻抑转录。因此，在通常情况下，TAS的表达停止-以更大丰度产生的抗毒素结合到毒素并使其失活，并且阻止毒素操纵子进一步转录。然而，抗毒素蛋白在不与毒素缔合时是不稳定的，并且如果系统通过例如抗毒素的周转增加而变得失衡，那么毒素可持续存在于不含抗毒素的细胞中，其中其内切核糖核酸裂解活性(在毒素是“RNA干扰酶”的情况下)能够使转译停止。
[0008]用于限制内源系统中的毒素表达的详细机制(对于彻底处理或parDE TAS调控，参见例如蒂亚戈.纳伍若(Diago Navarro)等人(2009)欧洲生物化学学会联合会杂志(FEBS J.) 277:3097-3117)强调紧密控制引入细胞中的外源毒素基因的表达的重要性。使毒素突变成无活性形式的选择性压力限制毒素基因在生物防范中的潜力。此外，近年来，若干个团队已提出，天然TAS可用于在生长限制条件下促进细胞生长抑制(cytostasis)而非细胞生长，并且在许多情况下至少一部分毒素激活群体随后恢复(参见例如，卡陶戴勒(Cataudella)等人(2012)核酸研究(Nucl Acids Res))。当外源基因在异源系统中表达时还看到细胞幸免于活性毒素表达的能力(例如，克瑞斯特福森(Kristofferesen)等人(2000)应用与环境微生物(Appl Environ Microbiol) 66:5524-5526)，这同样引起关于在生物防范策略中使用II型TAS的实用性的疑问。
[0009]微生物响应营养物损耗作出各种代谢调节，包括例如容许对外部营养物源的摄取增加以及清除内部源的转录反应。许多对营养物应激的反应是基于对转译机构的转运蛋白、酶、蛋白质等的转录调控。依赖于光提供化学能并进行碳固定的光合微生物具有额外挑战，在于必须调整光合机构以便防止在不能将光合电子转运或碳固定维持在最佳水平时过量光损害细胞。不能调整光收获和光系统功能可导致这些系统持续受损害。毫不为奇，许多研究已发现，光合机构的改变是所见的微藻中对氮(米勒(Miller)等人(2010)植物生理学(Plant Physiol) 154:1737-1752)、磷酸盐(叶胡埭-瑞氏富(Yehuda1-Resheff)等人，(2007)植物细胞(The Plant Cell) 19:1023-1038 ;武迟(Wurch)等人(2011)环境微生物(Environ Microbiol) 13:468-481)、硫(姆斯利(Moseley)等人(2009)遗传学(Genetics) 181:889-905))、铁(莫查特(Merchant)等人(2006)生物化学与生物物理学报(Biochim Bioophys Acta) 1763:578-594)、铜(卡斯苑塔(Castruita)等人(2011)植物细胞(The Plant Cell) 23:1273-1292)和 C02 (王(Wang)等人(2011)光合作用研究(Phototsynth Res) 109:115-122)限制的转录反应的变化之一,并且已发现,不能调整营养物限制导致微藻培养物死亡(姆斯利(Moseley)等人(2006)真核细胞(Eukaryot.Cell) 5:26-44)。·
【发明内容】
[0010]在一些方面中，本发明提供包括至少一种编码II型毒素的外源核酸分子的重组原核或真核微生物，其中，编码II型毒素的核酸序列可操作地连接到异源启动子。重组微生物可为例如细菌、古原细菌、蓝藻菌、真菌、不等鞭毛类或藻类物种。重组原核或真核微生物可为光合微生物，例如蓝藻菌，例如单细胞蓝藻菌(Acaryochloris)、阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、组囊藻属(Anacystis)、丝囊藻属(Aphanizomenon)、节螺藻属(Arthrospira)、星球藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶藻属(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、发毛针藻属(Crinalium)、蓝藻菌(Cyanobacterium)、双色藻属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、蓝螺菌属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、拟筒孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒抱藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、
【权利要求】
1.一种重组微生物，其经基因工程化用于受控的生物防范，其中所述微生物包含编码具有核糖核酸酶活性的毒素且可操作地连接到调控型启动子的外源II型毒素基因，其中所述毒素基因经修饰以排除所述毒素的一个或一个以上内切核酸酶靶位点。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述II型毒素基因编码CcdB毒素家族、RelE毒素家族、MazF毒素家族、ParE毒素家族、PIN毒素家族、AhaI毒素家族、MNT毒素家族、Doc毒素家族、VapC毒素家族、zeta毒素家族、HipA毒素家族或HigB毒素家族的毒素。
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述II型毒素基因编码RelE、MazF、ParE、PIN、Aha1、MNT、Doc、pemK、VapC、zeta、HipA、HigB、Chp1、StbE、YafQ 或 YoeB 毒素。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述可操作地连接到所述II型毒素的调控型启动子受光、温度、pH、培养基中存在或不存在化合物或营养物或其组合调控。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述可操作地连接到所述II型毒素的调控型启动子对培养基中存在或不存在化合物或营养物有反应。
6.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述可操作地连接到所述II型毒素的调控型启动子受以下物质调控:糖、有机酸、脂肪酸、氨基酸、脂质、烃、磷酸盐、硝酸盐、铵、氮、硫、二氧化碳、金属、群体敏感化合物、酚类化合物、类黄酮、蛋白质或肽或其任一组合。
7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包含编码与所述II型毒素同源的抗毒素的基因。
8.根据权利要求7所述 的重组微生物，其中所述编码与所述II型毒素同源的抗毒素的基因可操作地连接到不受所述培养基中存在或不存在化合物或营养物调控或受其相反地调控的启动子，所述培养基中存在或不存在化合物或营养物调控可操作地连接到所述II型毒素基因的所述启动子。
9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述可操作地连接到所述II型毒素的调控型启动子受所述微生物的生长培养基或环境中营养物的损耗调控。
10.根据权利要求9所述的重组微生物，其中所述可操作地连接到所述II型毒素的调控型启动子受所述微生物的所述生长培养基或环境中氮、磷酸盐、硫、铁、铜或CO2中的一者或一者以上的损耗调控。
11.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物是光合微生物。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述光合微生物是真核微藻。
13.根据权利要求12所述的重组微生物，其中所述真核微藻是以下物种:曲壳藻属(Achnanthes)、苗形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Asteromonas)、黄金色藻属(Boekelovia)、包特氏菌属(Borodinella)、葡萄藻属(Botryococcus)、片球藻属(Bracteococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、四鞭藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、球钙板藻属(Cricosphaera)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、杜氏藻属(Dunaliella)、后棘藻属(Ellipsoidon)、球石藻属(Emiliania)、独球藻属(Eremosphaera)、衣迪斯藻属(Ernodesmius)、眼虫藻属(Euglena)、被刺藻属(Franceia)、脆杆藻属(Fragilaria)、_ 丝藻属(Gloeothamnion)、红球藻属(Haematococcus)、嗜盐古菌（Halocafeteria)、膜胞藻属（Hymenomonas)、鞭金藻属（Isochrysis)、鳞孔藻 属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、单针藻属(Monoraphidium)、微绿球 藻属（Nannochloris)、微拟球藻属（Nannochloropsis)、舟形藻属（Navicula)、新绿 藻属（Neochloris)、肾鞭藻属（Nephrochloris)、肾藻属（Nephroselmis)、菱形藻属 (Nitzschia)、掠鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、卵囊藻属(Oocystis)、 青绿藻属（Ostreococcus)、巴夫藻属（Pavlova)、拟小球藻属（Parachlorella)、杜 氏亚属盐藻(Pascheria)、褐指藻属(Phaeodactylum)、嗷菌体属(Phagus)、混营性 微藻属（Picochlorum)、扁藻属（Platymonas)、颗石藻属（Pleurochrysis)、肋球藻 属（Pleurococcus)、原壁菌属（Prototheca)、拟绿球藻属（Pseudochlorella)、拟新 绿藻属(Pseudoneochloris)、塔胞藻属(Pyramimonas)、桑葚藻属(Pyrobotrys)、栅 藻属(Scenedesmus)、裂衣藻属(Schizochlamydella)、骨条藻属(Skeletonema)、水 绵藻属(Spyrogyra)、裂丝藻属(Stichococcus)、四球藻属(Tetrachorella)、四爿藻 属（Tetraselmis)、海链藻属（Thalassiosira)、小球藻微藻（Viridiella)或团藻属 (Volvox)0
14.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述光合微生物是蓝藻菌。
15.根据权利要求14所述的重组微生物，其中所述蓝藻菌是单细胞蓝藻 菌（Acaryochloris)、阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈 藻属（Anabaenopsis)、组囊藻属（Anacystis)、丝囊藻属（Aphanizomenon)、节 螺藻属（Arthrospira)、星球藻属（Asterocapsa)、博氏藻属（Borzia)、眉藻属 (Calothrix)、管孢藻属（Chamaesiphon)、拟绿胶藻属（Chlorogloeopsis)、拟色球藻 属（Chroococcidiopsis)、色球藻属（Chroococcus)、发毛针藻属（Crinalium)、蓝藻 菌（Cyanobacterium)、双色藻属（Cyanobium)、蓝囊胞菌属（Cyanocystis)、蓝螺菌属 (Cyanospira)、蓝杆藻属（Cyanothece)、拟筒孢藻属（Cylindrospermopsis)、筒孢藻属 (Cy 1 indrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、皮果藻属(Dermocarpe 11 a)、费 氏藻属（Fischerella)、夫列藻属（Fremyella)、吉特勒氏藻属（Geitleria)、吉特勒氏 线状藻属（Geitlerinema)、粘杆菌属（Gloeobacter)、粘球藻属（Gloeocapsa)、粘杆藻 属（Gloeothece)、盐螺旋藻属（Halospirulina)、英加藻属（Iyengariella)、痩鞘丝藻属 (Leptolyngbya)、湖丝藻属（Limnothrix)、鞘丝藻属（Lyngbya)、微鞘藻属（Microcoleus)、 微胞藻属（Microcystis)、粘囊藻属（Myxosarcina)、节球藻属（Nodularia)、念珠藻属 (Nostoc)、拟念珠藻属（Nostochopsis)、颤藻属（Oscillatoria)、席藻属（Phormidium)、浮 丝藻属（Planktothrix)、宽球藻属（Pleurocapsa)、原绿球藻属（Prochlorococcus)、原绿 菌属（Prochloron)、原绿发菌属（Prochlorothrix)、假鱼腥藻属（Pseudanabaena)、胶须藻 属（Rivularia)、裂须藻属（Schizothrix)、双歧藻属（Scytonema)、螺旋藻属（Spirulina)、 斯塔尼尔氏菌属（Stanieria)、斯塔尔氏菌属（Starria)、真枝藻属（Stigonema)、束藻 属（Symploca)、聚球藻属（Synechococcus)、集胞藻属（Synechocystis)、热集胞藻属 (Thermosynechocystis)、单歧藻属（Tolypothrix)、束毛藻属（Trichodesmium)、常丝藻属 (Tychonema)或异球藻属（Xenococcus)物种。
16.根据权利要求14所述的重组微生物，其中所述重组蓝藻菌进一步包含编码与由所 述外源II型毒素基因编码的毒素同源的抗毒素的外源基因。
17.根据权利要求14所述的重组蓝藻菌，其中所述II型毒素基因相对于所述蓝藻菌是同源的。
18.根据权利要求14所述的重组蓝藻菌，其中所述重组蓝藻菌包含编码与由所述外源II型毒素基因编码的毒素同源的抗毒素的内源基因。
19.根据权利要求18所述的重组原核蓝藻菌，其中所述抗毒素基因包括RelB抗毒素家族、MazE抗毒素家族、ParD抗毒素家族、RHH抗毒素家族、ArsR抗毒素家族、HEPN抗毒素家族、Phd抗毒素家族、VapB抗毒素家族、epsilon抗毒素家族、HipB抗毒素家族或HigA抗毒素家族的抗毒素。
20.根据权利要求19所述的重组蓝藻菌，其中所述抗毒素基因编码Axe、CcdA,RelB,MazE、ParD、RHH、ArsR、HEPNΛ Pem1、KiS、yfaN、stbD、dinj、yoeM、PIN、Phd、VapB、epsilon、HipB家族或HigA抗毒素。
21.—种包含内源毒素-抗毒素系统的原核微生物，其中至少一种异源调控元件可操作地连接到所述内源毒素-抗毒素系统的毒 素基因。
【文档编号】C12N15/31GK103635571SQ201280032775
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】文森特·A·别林斯基, 尼古拉斯·鲍曼, 凯特·莱昂斯·博伊德, 史利维迪亚·阿克拉, 斯坦利·鲍尔, 保罗·G·罗斯勒 申请人:艾克森美孚研究与工程公司