包含csp-b5’-sar因子的动物细胞表达载体及利用该载体的重组蛋白质的制备方法

包含csp-b5’-sar因子的动物细胞表达载体及利用该载体的重组蛋白质的制备方法【专利摘要】本发明涉及动物细胞用表达载体及利用该载体制备重组蛋白质的方法，上述动物细胞用表达载体包含：（a）细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架结合区；（b）在动物细胞中进行操作的启动子；以及（c）多聚腺苷酸化序列。本发明的载体作为包含细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架结合区的载体，具有克服基于向动物细胞导入的外源基因的位置的基因表达抑制现象的效果，且大大提高靶蛋白的表达率。本发明的载体在动物细胞中有效地表达医药品用重组蛋白质或抗体。本发明的载体及利用该载体的重组蛋白质的制备方法能够非常有用地使用于产业上的批量生产。【专利说明】包含CSP-B5’-SAR因子的动物细胞表达载体及利用该载体的重组蛋白质的制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种包含CSP-B(CytotoxicSerineProtease-B,细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B)的5’-核骨架结合区(SAR，ScaffoldAttachmentRegion)因子的动物细胞表达载体及利用上述载体制备重组蛋白质的方法。【
背景技术：
】[0002]若将对重组蛋白质进行加密的外源基因导入如中国仓鼠卵(CH0，ChineseHamsterOvary)细胞之类的动物细胞，则可以生产用于临床治疗的蛋白质医药品。[0003]作为红细胞生长因子的新型红细胞生成刺激蛋白(NESP,NovelErythropoiesisStimulatingProtein)也被称为达依泊汀a(Darbepoetinalfa),它是以在天然型促红细胞生成素(erythropoietin)中生成两个N-连接糖链部位的方式进行基因操作的蛋白质医药品(EgrieandBrowne,Br.J.Cancer,84Suppl.1:3-10(2001))0新型红细胞生成刺激蛋白刺激造血干细胞，促进向红细胞类的分化，从而增加红细胞的生成。新型红细胞生成刺激蛋白的血清半衰期相比于现有的重组促红细胞生成素长3倍，因此在慢性肾功能衰竭患者的贫血治疗中，少量的给药也能期待相同的治疗效果。[0004]作为抗恶性肿瘤剂的曲妥珠单抗(Trastuzumab)是利用基因重组技术制备的人源化单克隆抗体(humanizedmonoclonalantibody),其选择性地对存在于细胞表面的人表皮生长因子受体2(HumanEpidermalgrowthfactorReceptor2,HER2)产生作用。在原发性乳腺癌的25~30%中确认了人表皮生长因子受体2的超表达，且曲妥珠单抗抑制由人表皮生长因子受体2进行超表达的人类肿瘤细胞的生长。[0005]随着外源基因向动物细胞染色体的某个位置插入，外源基因将具有不同的表达率，这是因为，根据周边的调节因子或染色质(chromatin)的结构，外源基因的表达会受到影响(Zahn-Zabaletal.,J.Biotechnol,87,29-42(2001))。[0006]若使用周围的染色质对外源基因的表达不产生影响的染色质因子，就能克服基于这种位置的基因表达抑制现象(positioneffect),提高能够分离对重组蛋白质进行高表达的动物细胞克隆的机会，从而能够缩短制备医药品生产细胞株的时间。正在试图进行使用能够克服基于位置的基因表达抑制现象的染色质因子，来制备稳定的细胞株(stablecellline),而这些因子包含边界元素(BE,BoundaryElement)、核骨架结合区或基质结合区(SAR/MAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)以及基因座控制区(LCR，LocusControlRegion)等。[0007]SAR是一种也被称为MAR的长度为300~3000bp的DNA，其被认为使染色体上的染色质与核基质(nuclearmatrix)的蛋白质相结合，并调苄基因的表达((Makrides(Ed.),GeneTransferandExpressioninMammalianCells.Elsevier.ChapterlO(2003))，并且能够在转化的细胞株中提高外源基因的表达(Poljaketal.,NucleicAcidsRes,22,4386—4394(1994)；KalosandFournier,Mol.Cell.Biol,15,198-207(2005))。[0008]茨恩-嘉宝(Zahn-Zabal)等将鸡溶菌酶(chickenIysozyme)5’-MAR向突光素酶(luciferase)表达载体导入，并利用该载体对中国仓鼠卵细胞进行转化，来制备了稳定细胞(stablecell)(Zahn-Zabaletal.，J.Biotechnol,87，29-42(2001))。当与利用不包含MAR的载体进行转化的稳定细胞相比较时，利用包含溶菌酶5’MAR的载体进行转化的稳定细胞呈现更高的荧光素酶表达率。并且，相比于包含I副本的溶菌酶5’MAR的载体的情况，在包含2副本的载体的情况下呈现出更高的荧光素酶表达率。这种结果表明，向动物细胞表达载体导入MAR可以提高靶蛋白的表达率。[0009]韩国专利申请第2000-0043996号在动物细胞表达载体中包含人类β珠蛋白(human-globin)MAR，来克服了向动物细胞导入外源基因时所产生的基因表达抑制现象。该专利除了人类β珠蛋白MAR之外，还使用了登录于基因银行Μ83137的人干扰素inhumaninterferon-β)MAR和登录于基因银行Μ62716的人类CSP-B3’-SAR，并记述了上述三种SAR/MAR提高作为靶蛋白的β半乳糖苷酶(β-galactosidase)的表达率。并且，上述专利公开有β珠蛋白MAR比干扰素PMAR或CSP-3’SAR具有更优秀的效果的研究结果。[0010]韩国专利申请第2001-0079227号中，向动物细胞表达载体导入人干扰素βMAR，来增加外源基因的表达，并有效地表达了重组蛋白质。并且，韩国专利申请第2007-0108451号记述了在动物细胞表达载体中包含2副本的人类β珠蛋白MAR，与β珠蛋白MAR为I副本的情况相比，更优秀地提高靶蛋白的表达率。该专利记述了MAR因子I副本和MAR因子2副本的比较研究结果，但并没有记载MAR因子2副本和MAR因子3副本的比较研究内容。[0011]汉森(Hanson)和雷伊(Ley)从大约70kb的人类染色体14qll.2造血丝氨酸蛋白酶基因族(hematopoieticserineproteasegenecluster)中找出CSP-B5，-SAR和CSP-B3’-SAR，来表明了碱基序列，并在体外试验(invitro)中确认了上述SAR与来自细胞核中的核骨架(scaffold)相结合(HansonandLey,Blood,79,610-618(1992))。[0012]CSP-B5’-SAR和CSP_B3’_SAR的碱基序列分别登录于基因银行M62717和M62716，且长度分别为2429dp和1233dp，CSP-B5’-SAR相比于CSP-B3’-SAR要长2倍左右。基因银行AL136018登录了人类染色体14基因组(genome)的碱基序列，而在该序列上对CSP-B蛋白质进行加密的基因的翻译开始密码子(codon)和位于该密码子的上游(upstream)的5’-SAR之间的长度为1195bp，对CSP-B蛋白质进行加密的基因的翻译终结密码子和位于该密码子的下游(downstream)的3’-SAR之间的长度为4543bp。[0013]本说明书全文中参照了多篇对比文件及专利文献，并显示了其引用。所引用的文献及专利的公开内容作为参照全部插入本说明书中，从而更加明确地说明本发明所属【
技术领域：
】的水准及本发明的内容。【
发明内容】[0014]要解决的问题[0015]本发明人为了研发能够在动物细胞中有效地生产重组蛋白质的载体而努力。其结果，查明了在载体中包含(incorporated)细胞毒性丝氨酸蛋白酶(CSP-B,CytotoxicSerineProtease—B)的5，-核骨架结合区(5，-SAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)来使用的情况下，能够以非常优秀的生产效率来生产重组蛋白质，从而完成了本发明。[0016]因此，本发明的目的在于，提供动物细胞用表达载体。[0017]本发明的再一目的在于，提供通过上述的表达载体进行转化的动物细胞。[0018]本发明的另一目的在于，提供重组蛋白质的制备方法。[0019]本发明的其他目的及优点将根据【
发明内容】、权利要求书及附图更加明确。[0020]解决问题的手段[0021]根据本发明的一实施方式，本发明提供动物细胞用表达载体，上述动物细胞用表达载体包含:Ca)细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架结合区；(b)在动物细胞中进行操作的启动子；以及(C)多聚腺苷酸化序列。[0022]本发明人为了研发在动物细胞中能够有效地生产重组蛋白质的载体而努力。其结果查明，在载体中包含(incorporated)细胞毒性丝氨酸蛋白酶(CSP-B,CytotoxicSerineProtease-B)的5，-核骨架结合区(5，-SAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)来使用的情况下，能够以非常优秀的生产效率来生产重组蛋白质。[0023]本发明的动物细胞用表达载体包含CSP-B的5’_SAR、在动物细胞中进行操作的启动子以及多聚腺苷酸化序列。[0024]本发明的最大特征在于，利用包含CSP-B的5’-SAR的载体。优选地，在本发明中所利用的CSP-B5’-SAR包含登录于基因银行M62717的核苷酸序列，并在序列表第I位中记载有其例示性的核苷酸序列。[0025]CSP-B的5’-SAR在表达载体中大大增加重组蛋白质的生产效率。[0026]CSP-B的5’-SAR可位于对所要表达的蛋白质进行编码的核苷酸序列的上游或下游，优选地，位于下游。`[0027]如在下述实施例中所证明，相比于现有的CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子，CSP-B5’-SAR在动物细胞中提高靶蛋白的表达率。例如，在中国仓鼠卵(CHO)动物细胞中，分别将每I副本的CSP-B5’-SAR,CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子导入使作为靶蛋白的β半乳糖苷酶发生表达的载体的情况下，相比于未导入SAR因子的情况，测定出β半乳糖苷酶的活性分别提高了10.0倍、2.2倍及8.7倍(图7)。即，CSP-B5’-SAR因子相比于其他因子，呈现相对优秀的靶蛋白的表达率。[0028]并且，将靶蛋白作为新型红细胞生成刺激蛋白来确认SAR因子的效果时，导出了类似的结果。在向载体导入CSP-B5’-SAR和CSP-B3’-SAR因子，并对中国仓鼠卵细胞进行转化的情况下，相比于未导入SAR因子的情况，测定出新型红细胞生成刺激蛋白的表达率分别提高了11.2倍及3.2倍(表3及图9)。当向载体导入CSP-B5’-SAR因子时，在其转化的细胞中表达新型红细胞生成刺激蛋白的阳性克隆(positiveclone)的形成频率会增加，且随机选择的多个克隆的新型红细胞生成刺激蛋白的表达率也有增加(表4、表5、图10及图11)。[0029]将靶蛋白作为抗-HER2抗体来确认了CSP-B5’-SAR因子的效果。在将2副本的CSP-B5’-SAR因子向载体导入，并对CHO细胞进行转化的情况下，相比于未导入SAR因子的情况，测定出相对高的抗-HER2抗体的表达率(表6及图13)。当向载体导入SAR因子时，随机选择的多个克隆显示出较高的抗-HER2抗体的表达率(图14及图15)。[0030]根据本发明的优选实施例，5’-SAR在表达载体中以多个副本的方式存在，在此情况下，相比于以I副本的方式存在的情况，增加重组蛋白质的生产效率。更优选地，5’-SAR在表达载体中以2副本的方式存在。如在下述的实施例中的论证，5’-SAR在表达载体中以2副本的方式存在的情况相比于以3副本的方式存在的情况，重组蛋白质的生产效率更优秀。[0031]如在下述实施例中的论证，将CSP-B5’-SAR因子向载体导入I副本、2副本及3副本，来确认了基于副本数的效果，结果发现，将SAR因子连续导入2副本时，所检测到的β半乳糖酸酶的活性最高(图8)。即，可视为载体内SAR因子的副本数对靶蛋白的表达率产生影响，且最优选为2副本的SAR。[0032]5’_SAR在表达载体中以多个副本的方式存在的情况下，上述多个副本可以连续或分隔。优选地，上述多个副本连续存在，且更优选地，连续存在于对所要表达的蛋白质进行编码的核苷酸序列的下游。[0033]根据本发明的优选实施例，在上述动物细胞中进行操作(operable)的启动子为巨细胞病毒(CMV,Cytomegalovirus)启动子(Promoter)、腺病毒(adenovirus)后期启动子、痘苗病毒(vacciniavirus)7.5K启动子、猿猴病毒40(SV40,SimianVirus40)启动子、SV40E1启动子、单纯疱疫病毒(HSV,Herpessimplexvirus)的胸苷激酶(tk,thymidinekinase)启动子、呼吸道合胞体病毒(RSV,Respiratorysyncytialvirus)启动子、延伸因子-1a(EF1,elongationfactor-1alpha)启动子、金属硫蛋白(metallothionein)启动子、β-肌动蛋白(β-actin)启动子、人类白细胞介素-2(IL-2,interluekin_2)基因的启动子、人类干扰素(IFN，interferon)基因的启动子、人类白细胞介素_4(IL-4,interluekin-4)基因的启动子、人类淋巴霉素(humanlymphotoxin)基因的启动子或人类粒细胞巨曬细胞集落刺激因子(GM-CSF,Granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor)基因的启动子，更优选为巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、SV40E1启动子、延伸因子-1a(EFlα)启动子、金属硫蛋白启动子或β-肌动蛋白启动子,最优选为巨细胞病毒(CMV)启动子。`[0034]根据本发明的优选实施例，本发明的载体还包含用于编码所要表达的蛋白质的核苷酸序列，并优选为激素、细胞因子、抗体、肽核酸适体、纤连蛋白(AdNectin)、亲合体(affibody,美国专利第5831012号)、高亲和性多聚体(Avimer,Silverman,J.etal,NatureBiotechnology23(12):1556(2005))或库尼兹域(Kunitzdomain,ArnouxBetal.,ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.58(Pt7):12524(2002)及Nixon,AE,Currentopinionindrugdiscovery&development9(2):2618(2006))。更优选地，利用本发明的载体进行表达的蛋白质为促红细胞生成素(ΕΡ0,erythropoietin)、促红细胞生成素类似物或抗-HER2抗体。最优选为促红细胞生成素、作为促红细胞生成素类似物的新型红细胞生成刺激蛋白(NovelErythropoiesisStimulatingProtein,A30N,H32T,P87V,W88N,P90T)或抗-HER2抗体。[0035]上述促红细胞生成素类似物包含在人类促红细胞生成素的氨基酸序列中变异的一个或一个以上。促红细胞生成素类似物能够以通过氨基酸残基的增加(addition)、删除(deletion)或置换(substitution)来发生变异(mutagenesis)的方式制备，由此能够增加糖链化(glycosylation)位置(site)或置换糖链化位置。促红细胞生成素类似物相比人类促红细胞生成素具有更多数量的糖链(carbohydratechain),且包含追加一个以上的糖链化位置。并且，促红细胞生成素类似物根据所追加的糖链化位置，相比于自然(naturaloccurring)人类促红细胞生成素,显示更高的唾液酸(sialicacid)等级,但不会因此而改变对生物学活性非常重要的蛋白质二级或三级结构。促红细胞生成素类似物可具有一处、二处或三处对N-糖链化(N-glycosylation)或O-糖链化(O-glycosylation)的追加位置。例如，若第69个亮氨酸(leucine)置换为天冬酰胺(asparagine),则上述亮氨酸会起到N-糖链化的第4个位置的作用。[0036]本发明的载体中所要表达的促红细胞生成素类似物的例为，选自促红细胞生成素序列(例如，基因银行M11319的序列)中第30、51、57、69、88、89、136及138位置中的至少一个位置导入追加的糖链化位置。最优选地，促红细胞生成素类似物为包含A30N、H32T、P87V、W88N及P90T变异的新型红细胞生成刺激蛋白。[0037]根据本发明的优选实施例，上述多聚腺苷酸化序列包含牛生长激素终止子、单纯疱疫病毒(HSV,Herpessimplexvirus)来源胸苷激酶(TK,Thymidinekinase)或猿猴病毒40(SV40,Simianvirus40)来源多聚腺苷酸化序列。[0038]在本发明的载体中，优选的结构为按5’至3’的顺序在动物细胞中进行操作的启动子-表达蛋白质基因-多聚腺苷酸化序列-CSP-B5’-SAR，更优选的结构为，在动物细胞中进行操作的启动子-表达蛋白质基因-多聚腺苷酸化序列-CSP-B5’-SAR-CSP-B5’_SAR。[0039]本发明的载体还能包含选择标记。上述选择标记的例子包含针对作用于真核细胞的抗生素的抗性基因，优选为针对新霉素、遗传霉素(G418)及卡那霉素的抗性基因。[0040]根据本发明的优选实施例，本发明的载体用于在动物细胞中表达靶蛋白。上述动物细胞为哺乳类、啮齿目、鸟类或昆虫细胞，更优选地，包含中国仓鼠卵细胞(CH0，Chinesehamsterovary)、非洲绿猴肾细胞(VERO)、海拉(HeLa)细胞、WI38、幼仓鼠肾细胞(BHK，Babyhamsterkidney)、COS细胞或马丁达比狗肾上皮细胞(MDCK,Madin-DarbyCanineKidney),更优选为中国仓鼠卵细胞、非洲绿猴肾细胞、海拉细胞或马丁达比狗肾上皮细胞，最优选为中国仓鼠卵细胞。[0041]根据本发明的优选实施例，本发明的载体包含二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)编码序列。上述序列对载体的扩增有用。[0042]根据本发明的再一实施方式,本发明提供由上述本发明的表达载体进行转化的动物细胞。[0043]根据本发明的另一实施方式，本发明提供重组蛋白质的制备方法，上述重组蛋白质的制备方法包括对上述本发明的转化的动物细胞进行培养的步骤。[0044]根据本发明的优选实施例，本发明的重组蛋白质的制备方法包括:(i)培养本发明的转化的动物细胞的步骤；以及(ii)获得在上述培养过程中所生产的重组蛋白质的步骤。[0045]在本发明中所使用的CSP-B5’-SAR因子为未使用于在现有技术中向动物细胞表达载体导入来试图提高医药品用重组蛋白质的生产率的因子。从下述实施例中可知，若将CSP-B5’-SAR向载体导入，则可在动物细胞中提高靶蛋白的表达率。若为了重组蛋白质的生产，将当前未曾使用过的新的CSP-B5’-SAR向载体导入，来研发出能够更加提高靶蛋白的表达效率的方法，则可以增加蛋白质医药品的产业上的生产率。[0046]在现有技术中，未曾试图将CSP-B5’-SAR向动物细胞表达载体导入来提高医药品用重组蛋白质的生产率。并且，也未曾研究过当将SAR向载体导入I副本、2副本或3副本来利用该载体对动物细胞进行转化时，使用包含几副本的SAR的载体是否最能提高重组蛋白质的生产率。并且，也未公开对基于SAR因子的位置的靶基因的表达率增加效果的详细的现有研究结果。[0047]在将本发明的表达载体向细胞导入来制备已被转化的动物细胞的情况下，能够利用多种方法将载体向细胞导入。例如，能够通过显微注射法(Capecchi，M.R.，Cell,22:479(1980))、磷酸钙沉淀法(Graham,F.L.etal.,Virology,52:456(1973))、电穿孔法(Neumann,E.etal.,EMBOJ.,I:841(1982))、脂质体-介导转染法(Wong,T.K.etal.,Gene,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖转染法(Gopal，Mol.CellBiol.，5:1188-1190(1985))及基因枪法(Yangetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.,87:9568-9572(1990))等向动物细胞内注入载体。[0048]被转化的动物细胞的培养能够利用本发明所属领域公知的多种方法的实验方案进行实施。本发明中能够利用的培养基只要是通常利用于动物细胞的培养中的任何培养基即可，例如，能够利用伊格尔氏最低基础培养基(Eagles’sMEM,Eagle’sminimumessentialmedium,Eagle,H.Sciencel30:432(1959))>a-MEM(Stanner,CP.etal.,Nat.NewBiol.230:52(1971))、Iscove，sMEM(Iscove,N.etal.,J.Exp.Med.147:923(1978))、199培养基(Morganetal.,Proc.Soc.Exp.Bi0.Med.,73:1(1950))、CMRL1066、RPMI1640(Mooreetal.,J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967))、F12(Ham,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA53:288(1965))、FlO(Ham,R.G.Exp.CellRes.29:515(1963))、DMEM(DulbeccoJsmodificationofEagle’smedium,Dulbecco,R.etal.,Virology8:396(1959))、DMEM与F12的混合物(Barnes,D.etal.,Anal.Biochem.102:255(1980))、Way-mouth’sMB752/1(ffaymouth,C.J.Natl.CancerInst.22:1003(1959))、McCoy’s5A(McCoy,T.A.,etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))及MCDB系列(Ham,R.G.etal.,InVitrol4:ll(1978))等。对动物细胞的培养及培养基的说明已在R.1anFreshney,CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique,AlanRLiss,Inc.,NewYork中进行了详细记载,且该文献作为参照插入本说明书中。[0049]发明的效果`[0050]归纳本发明的特征及优点如下:[0051](a)本发明的载体为包含CSP-B5’-SAR的载体，具有克服随着向动物细胞导入的外源基因的不同位置而发生的基因表达抑制现象的效果，且大大提高靶蛋白的表达率。[0052](b)本发明的载体在动物细胞中有效地表达医药品用重组蛋白质(例如，促红细胞生成素)或抗体(例如，抗-人表皮生长因子受体2抗体)。[0053](C)本发明的载体及利用该载体的重组蛋白质的制备方法能够非常有用地使用于医药品的产业性批量生产。【专利附图】【附图说明】[0054]图1为表示β半乳糖苷酶表达载体的结构的简图。IacZ为β半乳糖苷酶基因，BGHPA为牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列，以及TKPA为胸苷激酶基因的多聚腺苷酸化序列。[0055]图2为表示包含I副本的SAR/MAR因子的β半乳糖苷酶表达载体的结构的简图。[0056]图3为表示包含2副本的SAR因子的β半乳糖苷酶表达载体的结构的简图。[0057]图4为表示包含3副本的CSP-B5’_SAR因子的β半乳糖苷酶表达载体的结构的简图。[0058]图5为表不新型红细胞生成刺激蛋白表达载体的结构的简图。[0059]图6为表示包含SAR/MAR因子的新型红细胞生成刺激蛋白表达载体的结构的简图。[0060]图7为表示利用导入I副本的SAR/MAR因子的载体进行转化的细胞的相对β半乳糖苷酶活性的图表。[0061]图8为表示利用导入I副本、2副本及3副本的SAR因子的载体进行转化的细胞的相对β半乳糖苷酶活性的图表。[0062]图9为表示利用导入SAR因子的载体进行转化的细胞的相对新型红细胞生成刺激蛋白(红细胞刺激因子)的表达率的图表。[0063]图10为表示在利用未导入SAR因子的pCLS07Al载体进行转化的细胞中随机选择的24个克隆的新型红细胞生成刺激蛋白的表达率的图表。[0064]图11为表示在利用导入CSP-B5’_SAR因子的pCLSlOAlfl载体进行转化的细胞中随机选择的24个克隆的新型红细胞生成刺激蛋白的表达率的图表。[0065]图12为表示抗-HER2抗体表达载体的结构的简图。[0066]图13为表示利用`导入2副本的载体进行转化的细胞的相对抗-HER2抗体的表达率的图表。[0067]图14为表示在利用未导入SAR因子的pCLS05H2载体进行转化的细胞中随机选择的19个克隆的抗-HER2抗体的表达率的图表。[0068]图15为表示在利用导入2副本的CSP-B5’-SAR因子的pCLS05H2f2载体进行转化的细胞中随机选择的19个克隆的抗-HER2抗体的表达率的图表。【具体实施方式】[0069]以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不会受限于以下实施例，这对于所属领域技术人员来说是显而易见的。[0070]实施例[0071]实施例1:SAR/MAR因子的准备[0072]人类CSP-B5’-SAR及3’-SAR因子的准备[0073]为了将登录于基因银行M62717及AL136018的人类CSP-B5’-SARDNA通过聚合酶链式反应(PCR,PolymeraseChainReaction)进行扩增,准备了人类自然杀伤细胞(naturalkiller细胞、NK细胞及ATCCCRL-2407)的基因组(genomic)DNA。使用DNA分离试剂盒(DneasyBlood&TissueKit,Qiagen,Cat.N0.69504)从NK细胞中准备了基因组DNA,并将这些基因组DNA使用为SARDNA聚合酶链式反应的模板。[0074]以NK细胞的基因组DNA作为模板,使用Cs5S300F引物(attcttcagcacctccttaatttttctccc;序列表第5序列)及Cs5S300R引物(ccaggcagccaaagatcagtagttgtgttg;序列表第6序列)执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、在60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行35次，从而执行了聚合酶链式反应。[0075]接着，将该聚合酶链式反应的产物克隆于pGEM-T载体(普洛麦格公司，Cat.N0.A3600)，来制备pGEMT-CS5S.3.0k载体。[0076]为了准备登录于基因银行M62716及AL136018的人类CSP-B3’-SARDNA，以NK细胞的基因组DNA作为模板,使用2kCspSF引物(tggttccttcattggaaaaggaaaacac;序列表第7序列)及2kCspSR引物(tccgctgaggctgtgcccacagccacc;序列表第8序列)执行了聚合酶链式反应。然后，以第一次聚合酶链式反应产物作为模板，使用CspSF引物(ggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第9序列)及CspSR弓丨物(gaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第10序列)执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下5分钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。将第二次聚合酶链式反应产物克隆于PGEM-T载体，来制备了pGEMT-CS3S.1.2k载体。[0077]人类β珠蛋白MAR因子的准备[0078]为了利用聚合酶链式反应来对登录于基因银行L22754和NW-001838021的人类β珠蛋白MARDNA进行扩增，准备了人类G-2细胞的基因组DNA。使用DNA分离试剂盒从G-2细胞中准备基因组DNA，并将这些基因组DNA使用为5’MARDNA聚合酶链式反应的模板。以G-2细胞的基因组DNA作为模板,使用Bg5MF-100F_NheI引物(aattgctagcttgtattctgtttcgtgaggcaaggttt;序列表第11序列)及Bg5MR-100R_XhoI引物(aattctcgagttcctctctatgttggctcaaatgtcct;序列表第12序列)执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下3分20秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于pcDNA3.3-T0P0载体(英杰公司，Cat.N0.K8300-01)，来制备了pcDNA3.3_Bg5M载体。[0079]实施例2:β半乳糖苷酶表达载体的制备`[0080]pC06载体的制备[0081]为了制备依次包含巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子、多克隆位点(MultipleCloningSites,MCS)及牛生长激素(BovineGrowthHormone,BGH)多聚腺苷酸化序列(polyadenylationsequence,pA)的pC06载体,执行了如下实验。首先，以pcDNA3.1(_)载体(英杰公司，Cat.N0.V795-20)作为模板，使用V6-F引物(aagcttggatccgaattcatcgatggccggccggtaccctcgagctgtgccttctagttgccagc;序列表第13序列)及V6-R引物(gctagctagagccccagctggttctttccg;序列表第14序列)执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下I分钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于pcDNA3.3-T0P0载体(英杰公司)，来制备了PC06载体。[0082]pC04’载体的制备[0083]为了制备依次包含猿猴病毒(SV40，SimianVirus40)启动子、科扎克序列(Kozaksequence,gccatc)、二氢叶酸还原酶(dhfr,dihydrofolatereductase)基因及单纯疱疫病毒胸苷激酶(TK,herpessimplexvirusthymidinekinase)pA的pC04’载体,进行了如下实验。首先，以pcDNA3.3载体作为模板,使用PsvApaDraF引物(aaaattgggccccactacgtgctgtggaatgtgtgtcagttagggt;序列表第15序列)及PsvKzDHR引物(tggtcgaaccatgatggcgcgaaacgatcctcatcctgtctct;序列表第16序列)执行了聚合酶链式反应，并以pOptiVEC-TOPO载体(英杰公司，Cat.N0.12744-017)作为模板，使用DHKzPsvF引物(ggatcgtttcgcgccatcatggttcgaccattgaactgcatcg;序列表第17序列)及TKNheNdeR弓丨物(tgtgtgcatatggctagcgataacaatttcacacaggaaacag;序列表第18序列)执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下I分钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将上述两种聚合酶链式反应产物通过重叠(overlapping)聚合酶链式反应相连接,并克隆于pGEM_T载体的Apal及NdeI限制性内切酶部位，来制备了pC04’载体。[0084]pC04载体的制备[0085]为了制备在pC04’载体所包含的猿猴病毒启动子中除去(SV40dEl启动子)72bp(ggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacca;序列表第19序列)的一个增强子(enhancer)的pC04载体,进行了如下实验。首先，利用限制性内切酶切断PC04’载体，然后使大DNA切片进行自身连接(self-ligation)，来制备了PC04载体。[0086]pCLS07载体的制备[0087]为了制备在pC06载体的BGHpA和猿猴病毒启动子之间插入SV40dEl启动子、科扎克序列、dhfr基因及TKpA的pCLS07载体，进行了如下实验。首先，以pC04载体作为模板，使用PsvApaDraF引物及TKNheNdeR引物执行了聚合酶链式反应。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下I分20秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，利用DraIII及NheI限制性内切酶分别切断上述聚合酶链式反应产物和pC06载体，并连接由此获得的两个大DNA切片，来制备了PCLS07载体。[0088]pCLS08载体的制备[0089]为了向pCLS07载体的NheI限制性内切酶部位插入多克隆位点来制备pCLS08载体，进行了如下实验。首先，以克隆于PGEM-T载体的促红细胞生成素基因作为模板，使用NhAsElF引物(aattgctagcatatagcgatcgcgcaggacagcttccgacagcagggccagg；序列表第20序列)及BbPsSbNhEIR引物(aattgctagcatatacctgcaggtatatgggcccatatagctgaggttgaatgagaatatcactgtcccagacac;序列表第21序列)执行聚合酶链式反应，从而制备了多克隆位点。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下15秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS07载体的NheI限制性内切部位，来制备了pCLS08载体。[0090]pCLS08Gl载体的制备[0091]为了向pCLS08载体的HindIII和XhoI限制性内切酶部位之间插入IacZ及IacY基因，来制备PCLS08G1载体，进行了如下实验。首先，以pSV-β-半乳糖苷酶载体(普洛麦格公司，Cat.N0.TB094)作为模板，使用galHinF引物(aattaagcttctcgcgcaacctattttcccctcgaac;序列表第22序列)及galXhoR引物(aattctcgagccgagtttgtcagaaagcagaccaaac;序列表第23序列)执行了聚合酶链式反应，从而扩增了IacZ及IacY基因。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下3分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS08载体的HindIII及XhoI限制性内切酶部位，来制备了pCLS08Gl载体。[0092]pCLS09Gl载体的制备[0093]为了将位于pCLS08Gl载体的两个NheI限制性内切酶部位之间的多克隆位点换成其他多克隆位点来制备PCLS09G1载体，进行了如下实验。首先，以克隆于pGEM-T载体的促红细胞生成素基因作为模板，使用NhSbElF引物(aattgctagcatatacctgcaggttgaatgagaatatcactgtcccagaca;序列表第24序列)和NhAsSfPsEIR引物(aattgctagcatatagcgatcgctatatggccatgatggccatatagggcccaggacagcttccgacagcagggccaggc;序列表第25序列)来执行聚合酶链式反应，来制备了多克隆位点。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下15秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，除去位于PCLS08G1载体的两个NheI限制性内切酶部位之间的现有的多克隆位点，并在此克隆利用聚合酶链式反应重新制备的多克隆位点，来制备PCLS09G1载体。pCLS09Gl载体的遗传图(map)表示在图1中。[0094]实施例3:包含SAR/MAR的β半乳糖苷酶表达载体的制备[0095]pCLS09Gltl载体的制备[0096]为了在pCLS09Gl载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位之间插入CSP-B3’-SAR因子来制备pCLS09Gltl载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS3S.1.2.k载体作为模板，使用cs3sSbfIF引物(aattcctgcaggggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第26序列)及cs3sPsplR引物(aattgggcccgaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第27序列)来执行聚合酶链式反应，从而扩增了CSP-B3’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS09G1载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Gltl载体。[0097]pCLS09Glfl载体的制备[0098]为了在pCLS09Gl载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位之间插入CSP-B5’-SAR因子来制备pCLS09Glfl载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k载体作为模板，使用cs5sSbfIF引物(aattcctgcagggaattcctaaacagagcaattaggtaag序列表第28序列)及cs5sPsplR引物(aattgggcccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第29序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS09G1载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glfl载体。[0099]pCLS09Glgl载体的制备[0100]为了在pCLS09Gl载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位之间插入β珠蛋白MAR因子来制备pCLS09Glgl载体，进行了如下实验。首先，以pcDNA3.3_Bg5M载体作为模板，使用glmSbfIF引物(aattcctgcaggttgtattctgtttcgtgaggcaaggttt;序列表第30序列)及glmPsplR引物(aattgggcccttcctctctatgttggctcaaatgtcct;序列表第31序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了β珠蛋白MAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下3分20秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS09G1载体的SbfI及PspOMI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glgl载体。[0101]pCLS09Glt2载体的制备[0102]为了在pCLS09Gltl载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位之间插入CSP-B3，-SAR因子来制备pCLS09Glt2载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS3S.1.2k载体作为模板，使用cs3sPsp2F引物(aattgggcccggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第32序列)及cs3sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第33序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B3’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于pCLS09Gltl载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glt2载体。[0103]pCLS09Glf2载体的制备[0104]为了在pCLS09Glfl载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位之间插入CSP-B5’-SAR因子来制备pCLS09Glf2载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k载体作为模板，使用cs5sPsp2F引物(aattgggcccgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第34序列)及cs5sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第35序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS09G1H载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glf2载体。[0105]pCLS09Gltf载体的制备[0106]为了在pCLS09Gltl载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位之间插入CSP-B5’-SAR因子来制备pCLS09Gltf载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k载体作为模板，使用cs5sPsp2F引物(aattgggcccgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第34序列)及cs5sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第35序列)来`执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于pCLS09Gltl载体的PspOMI及SfiI限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Gltf载体。[0107]pCLS09Glf3载体的制备[0108]为了在位于pCLS09Glf2载体的CMV启动子及bla启动子之间的BgIII限制性内切酶部位插入CSP-B5’-SAR因子来制备pCLS09Glf3载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k载体作为模板，使用cs5sBgl3F引物(aattagatctgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第36序列)及cs5sBgl3R引物(aattagatctgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第37序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于pCLS09Glf2载体的BgIII限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glf3载体。[0109]pCLS09Glf4载体的制备[0110]为了在位于pCLS09Glfl载体的CMV启动子及bla启动子之间的BgIII限制性内切酶部位插入CSP-B5’-SAR因子，来制备位于以SAR作为靶基因的IacZ及IacY基因的两侧的pCLS09Glf4载体，进行了如下实验。首先，以pGEMT-CS5S.3.0k载体作为模板，使用cs5sBgl3F引物(aattagatctgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第36序列)及cs5sBgl3R引物(aattagatctgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第37序列)来执行聚合酶链式反应，扩增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C温度下10秒钟、60°C温度下30秒钟及72°C温度下2分30秒钟的条件反复进行30次，从而执行了聚合酶链式反应。然后，将该聚合酶链式反应产物克隆于PCLS09G1H载体的BgIII限制性内切酶部位，来制备了pCLS09Glf4载体。[0111]实施例4:使用SAR/MAR导入载体的β半乳糖苷酶的表达[0112]使用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl载体的转化[0113]为了向载体中导入CSP-B5’-SAR、CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子各I副本来了解如下效果，以如下方法对CHODG44细胞(英杰公司，Cat.N0.12609)进行了转化。[0114]将附着培养形态的DG44细胞在6-孔板中以每孔4XIO5细胞进行分注。在24小时之后，确认了细胞完全附着于板底面。将欧赔-最低基础培养基(Opt1-MEM)(吉克公司(Gibco)7Cat.N0.31985-070)在已被灭菌的3个管中分别分注500μI之后，混合预先准备的pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl及pCLS09Glgl载体各2μg，并略微进行了移液管移动。将Opt1-MEM培养基在已被灭菌的3个管中分别分注500μI。在此，分别取10μI的Lipofectamine2000(英杰公司，Cat.N0.11668-027)进行混合，并在略微进行移液管移动之后，在常温中放置5分钟。混合DNA和试剂溶液，并在常温中放置20分钟，且将该混合液放入各个DNA的已准备的6-孔板的孔中均匀地进行了混合。[0115]确认利用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl载体进行转化的细胞池(pool)的β半乳糖苷酶的活性[0116]利用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl载体对DG44细胞进行转化，并在24小时之后交换为包含10%FBS和50μg/ml遗传霉素(Geneticin)的培养基。每3-4日交换一次培养基，并在37°C、5%CO2条件下培养3周，来制备稳定的细胞池。[0117]使用β半乳糖苷酶分析试剂盒(Stratagen,Cat.N0.200383)来确认针对转化的稳定细胞的β半乳糖苷酶活性，并求得了以基于载体的β半乳糖苷酶活性和PCLS09G1载体作为基准的相对(relative)β半乳糖苷酶活性。如表1及图7所示,相比于未导入SAR/MAR因子的PCLS09G1载体，导入SAR/MAR因子的载体均增加了β半乳糖苷酶的活性。并且，相比于导入β珠蛋白MAR因子的pCLS09Glgl载体，导入CSP-B5’_SAR因子的pCLS09GlfI载体的情况显示出更高的β半乳糖苷酶活性的增加。因此，优选地，为了增加靶蛋白的表达率，应向载体导入CSP-B5’-SAR因子。[0118]表1[0119]使用于转化的被导入的β半乳糖苷酶的活性P半乳糖苷酶的载体__SAR/MAR__(units/mg)__相对活性PCLS09G1__^__3A__LO_pCLS09GlflCSP-B5，-SAR__343__10,0pCLS09GltlCSP-B3，-SAR__TA__22_pCLS09Glglβ珠蛋白MAR29.88.7[0120]确认利用pCLS09Glfl,pCLS09Glf2,PCLS09Glf3或pCLS09Glf4载体进行转化的细胞池的β半乳糖苷酶的活性[0121]为了确认CSP-B5’-SAR因子会使靶蛋白的表达率增加，并了解根据向载体导入的SAR因子的副本数如何使靶蛋白的表达率的增加产生变化而进行了如下实验。利用pCLS09Glf1，pCLS09Glf2,PCLS09Glf3或pCLS09Glf4载体对DG44细胞进行转化，并利用遗传霉素培养基进行选择，来获得细胞池。对转化的稳定细胞确认β半乳糖苷酶的活性，并求得基于载体的β半乳糖苷酶的活性。如表2和图8所示，相比于将SAR因子导入I副本或3副本的载体，将SAR因子导入2副本的载体显示更高的β半乳糖苷酶的活性。即，确认了基于SAR因子的靶蛋白的表达率的增加会根据SAR因子的副本数而不同，且将SAR因子向载体导入副本，可使靶蛋白的表达率增加至最大。[0122]表2[0123]【权利要求】1.一种动物细胞用表达载体，其特征在于，包含:(a)细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架结合区；(b)在动物细胞中进行操作的启动子；以及(C)多聚腺苷酸化序列。2.根据权利要求1所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述载体还包含核苷酸序列，上述核苷酸序列用于编码所要表达的蛋白质。3.根据权利要求1所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述5’-核骨架结合区以2副本的方式存在。4.根据权利要求1所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，在动物细胞中进行操作的上述启动子为巨细胞病毒启动子、腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、猿猴病毒40启动子、SV40E1启动子、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子、呼吸道合胞体病毒启动子、延伸因子-1a启动子、金属硫蛋白启动子、肌动蛋白启动子、人类白细胞介素-2基因的启动子、人类干扰素基因的启动子、人类白细胞介素-4基因的启动子、人类淋巴霉素基因的启动子或人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的启动子。5.根据权利要求1所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述多聚腺苷酸化序列为牛生长激素、单纯疱疹病毒来源胸苷激酶或猿猴病毒40来源多聚腺苷酸化序列。6.根据权利要求1所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述动物细胞为中国仓鼠卵细胞、非洲绿猴肾细胞、海拉细胞、WI38、幼仓鼠肾细胞、COS细胞或马丁达比狗肾上皮细胞。7.根据权利要求2所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述蛋白质为激素、细胞因子、抗体、肽核酸适体、纤连蛋白、亲合体、高亲和性多聚体或库尼兹域。8.根据权利要求7所述的动物细胞用表达载体，其特征在于，上述蛋白质为促红细胞生成素、促红细胞生成素类似物或抗-人表皮生长因子受体2抗体。9.一种动物细胞，其特征在于，根据权利要求1至8中的任一项所述的表达载体来进行转化。10.一种重组蛋白质的制备方法，其特征在于，包括对上述权利要求9的转化的动物细胞进行培养的步骤。【文档编号】C12N5/10GK103797123SQ201280029037【公开日】2014年5月14日申请日期:2012年5月21日优先权日:2011年6月13日【发明者】高丽旭,李相瑢,金秀娟,文昇基申请人:株式会社钟根堂