包含γδT细胞的淋巴细胞系、其组合物及生产方法

包含γδT细胞的淋巴细胞系、其组合物及生产方法
【专利摘要】本发明涉及包含γδT细胞的淋巴细胞细胞系、其组合物及生产方法，以及医学用途，即用于医学中，即用于癌症免疫疗法中。该细胞系包含表达功能性天然细胞毒性受体（NCR）的人外周血Vδ1+γδT细胞的样品。这些Vδ1+NCR+T淋巴细胞可以直接介导白血病细胞系和慢性淋巴细胞白血病患者瘤细胞的杀伤。本发明显示，当采用γδTCR激动剂和γc-家族细胞因子有规律地体外或离体刺激时，人Vδ1+NCR+T细胞可以从总γδ外周血淋巴细胞(PBL)分化和扩充。这种亚类令人惊讶地表达NKp30、NKp44和NKp46，以及高水平的粒酶B，其与高度增强的针对淋巴样白血病的细胞毒性相关。
【专利说明】包含Y S T细胞的淋巴细胞系、其组合物及生产方法
[0001]本发明的【技术领域】
[0002]本发明涉及包含Y 6 T细胞的淋巴细胞系、其组合物及生产方法，以及医学用途，即用于医学中，也就是用于癌症免疫疗法中。
[0003]背景
[0004]肿瘤在拥有高度复杂的免疫系统的宿主中形成，所述免疫系统包括能够识别和摧毁转化细胞的各种淋巴细胞亚类。现在广泛接受的是，尽管淋巴细胞可以持续侦查肿瘤形成，但是癌细胞形成了逃避免疫监视的分子策略，所述分子策略在宿主免疫系统的压力下被竞争性地选择。这种称作“癌症免疫编辑”的动态过程被认为构成癌症免疫疗法的主要障碍。 [0005]在多种免疫逃避机制当中，最近显示白血病和淋巴瘤原代样品经常下调非经典的MHC (主要组织相容性复合物)蛋白ULBPl，所述ULBPl对表达反受体NKG2D的Y S T-细胞识别血液肿瘤至关重要(Lanca, T.等人，“The MHC class Ib protein ULBPlis anonredundant determinant of leukemia/lymphoma susceptibility to gammadeltaT-cell cytotoxicity”，Bloodll5:2407-2411;2010)。
[0006]y 6 T细胞是占据1-10%健康个体外周血淋巴细胞(PBL)并且能够靶向实验室中所测试的大部分血液肿瘤细胞系的天然样淋巴细胞。然而，已证实许多淋巴样白血病原代样品对充分活化的V Y 9V S 2T-细胞(Y 6 PBL的优势亚类)有抗性(Lanca，T.等人，“TheMHC class Ib protein ULBPlis a nonredundant determinant of leukemia/lymphomasusceptibility to gammadelta T-cell cytotoxicity，，，Blood 115:2407-2411, 2010 ；Gomes, A.Q.等人，“Identification of a panel of ten cell surface protein antigensassociated with immunotargeting of leukemias and lymphomas by peripheralblood gammadelta T cells”，Haematologica95:1397-1404，2010)。另外，涉及体内施用V Y 9V 6 2T细胞的激活物的临床试验已经显示有限的成功，客观响应仅限于10-33%的血液瘤或实体瘤患者。由于未曾报道过客观响应，因此甚至更适宜的是涉及过继转移活化/扩充的V 6 2+细胞的试验的结果。实际上，当重复注射入患者时，单纯离体扩充肿瘤在体内试图逃避其监视的自体V 6 2+T细胞可以被判定为治疗作用甚微。
[0007]癌症免疫疗法依赖于细胞毒性淋巴细胞识别肿瘤细胞。Y S T细胞是在各种动物肿瘤模型中发挥至关重要作用的MHC非限制性杀伤淋巴细胞群体。尽管如此，已显示了大比例的人血液肿瘤对用特定激动剂活化的Y 6外周血淋巴细胞(PBL)有抗性，其中所述的特定激动剂针对高度优势的V Y 9V S 2T细胞受体(TCR)。这可能构成对当前Y 6 -T细胞介导的免疫疗法的重要限制。
[0008]因此，至关重要的是研究这样的策略，所述策略赋予Y S T细胞以额外的识别手段以探测抵抗体内存在的天然组分的肿瘤。
[0009]天然细胞毒性受体由A.Moretta和合作者在十多年前鉴定，并且显示在天然杀伤(NK)细胞的抗肿瘤功能中发挥关键性协同作用。实际上，NKp30和NKp46被公认为是两种最特异的NK细胞标记。[0010]von Li I ienfeld-Toal, Μ.，J.Nattermann 等人撰写的文献(2006)."Activatedgammadelta T cells express the natural cytotoxicity receptor naturalkiller p44and show cytotoxic activity against myeloma cells."Clin ExpImmunoll44(3):528-533公开了 NK受体在外周血y δ T淋巴细胞上的表达。然而，公开的Y S T细胞不同于本发明中所述的那些。与本发明相反，该文献也揭示ΝΚρ30不在这类
YST细胞中表达。其中一些差异是:
[0011]?处理(IFN-Y，TNF-a +抗 CD3 单克隆抗体+IL-1e+IL-2+IL-15)；
[0012].Y δΤ细胞的表型(ΝΚρ30_和ΝΚρ46_ ;另外，62%的Y δ T细胞属于V δ 2+亚型；
[0013].少于 20% 的 Y δ T 细胞是 CD56+ ；
[0014].少于20%的Y δ T细胞是CD8+ ；
[0015].ΝΚρ44的表达水平不受Y δ TCR/⑶3复合物的刺激作用调节(因此，涉及在那些细胞上诱导ΝΚρ44表达的不同分子机制)
[0016]该文献描述了表达ΝΚρ44的外周血Y δ T细胞。ΝΚρ44是有功能的并且参与肿瘤细胞(骨髓瘤细胞)的识别和消除。然而，仅8±7%的Y δΤ细胞表达ΝΚρ44，并且大部分的(62%) Y δ T细胞属V δ 2+亚型(它们是V δ 1-)。ΝΚρ30和ΝΚρ46不由Y δ T细胞表达，并且少于20%的这些细胞是⑶8+或⑶56+。
[0017]因此，所述的Y δ T细胞系完全不同于我们鉴定的Y δ T细胞系:通常在我们的细胞系中多于95%的Y δΤ细胞属于νδ 1+亚型，并且高百分比的这些νδ 1+Υ δΤ细胞(一般多于30%)表达有功能的ΝΚρ44。重要地，ΝΚρ44显示与ΝΚρ30发挥协同作用，以大大增强识别和杀伤肿瘤细胞的能力(图5Β)。NCR之间的这种合作对获得所需的效果(消除癌疾病)至关重要，但其并不存在于先前鉴定的ΝΚρ44+y δ T细胞中。
[0018]由Rey, J.，C.Veuillen 等人撰写的文献(2009)."Natural killer andgammadelta T cells in haematological malignancies: enhancing the immuneeffectors."Trends Mol Medl5 (6): 275-284 公开 NKG2D 受体在 NK 细胞上和 Y δ T 细胞上的共同表达。该文献也宣称Y S T细胞的扩充和活化可以产生抗肿瘤反应。然而，与本发明相反，这些Y δ细胞是ΝΚρ30-和ΝΚρ46'
[0019]文献W000/44893 (Palmetto Richland Memorial Hos)公开一种基于施用基本上纯化的Y ST淋巴细胞来治疗白血病的方法。该方法包括产生淋巴细胞活化及其扩充。主要差异是:
[0020].处理(平板结合的固定化抗TCR抗体+照射的“饲养”肿瘤B细胞)；
[0021].y δ T 细胞(NKp30\ NKp44\ NKp46\ CD8)。
[0022]文献W02011/053750(埃默里大学)公开了一种减少患者中癌症的方法，所述方法包括步骤:分离细胞毒细胞群体如Y S T细胞；施用治疗药和所述细胞毒细胞。其与本发明的主要差异在于Y ST细胞经基因修饰而抵抗化疗药。
[0023]概述
[0024]本发明涉及外周血淋巴细胞系，所述外周血淋巴细胞系包含表达功能性天然细胞毒性受体(NCR)的νδ1+y δΤ细胞或由其组成。在一个更优选的实施方案中，所述天然细胞毒性受体包括ΝΚρ30或由其组成。
[0025]在一个更优选的实施方案中，所公开的细胞系还包含V δ 2+Y δ T细胞。[0026]在公开的细胞系的另一个更优选的实施方案中，所述天然细胞毒性受体可以还包括NKp44、NKp46或其混合物。
[0027]在公开的细胞系的另一个优选的实施方案中，该细胞系可以表达粒酶B。
[0028]所公开的主题还包括具有所述细胞系的组合物。在一个优选实施方案中，该组合物是可注射的。在一个优选实施方案中，所述可注射组合物包含由多于80% (即多于80%、85%、90%、95%)表达功能性天然细胞毒性受体的功能性V δ 1+ δ T细胞组成的细胞群体，更优选地，所述天然细胞毒性受体包括ΝΚρ30或由其组成，并且其中该组合物包含多于I亿个表达功能性天然细胞毒性受体的νδ 1+ δΤ细胞。优选地，该组合物也包含可药用物质或载体，以及更优选地，稳定剂，即如人血清白蛋白。所述细胞优选地是自体的，也就是说，源自相同生物制备物(或来自相同的供体)。更优选地，它们通过一种方法如通过公开的主题所描述的方法获得。
[0029]所公开主题的另一个方面是包含本发明中公开的细胞系的细胞的组合物在医学中的用途。
[0030]在一个更优选的实施方案中，本发明中公开的组合物可以用于自体或异源过继细胞疗法、肿瘤或癌症治疗、肿瘤或癌症免疫疗法和/或白血病治疗中，或用于治疗急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、Burkitt淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾细胞癌、或皮肤黑色素瘤，等等。
[0031]在一个更优选的实施方案中，本发明中公开的组合物可以用于治疗病毒性感染。即，当所治疗的病毒来自疱疫病毒科(Herpesviridae)或逆转录病毒科(Retroviridae)之
时，等等。
[0032]所公开的主题还包括产生所述细胞系的方法，所述方法括分离Y SPBL。在一个优选实施方案中，起始样品可以是包括外周血样品的血液或其级分，所述级分包括暗黄层细胞、单个核细胞和低密度单个核细胞。所述细胞可以使用本领域已知的技术如密度梯度离心，从起始血液样品获得。总Y S PBL可以采用磁标记的抗TCR Y δ +抗体借助阳性选择或通过耗尽/消除TCR δ (-1)细胞进行分离。Υ δ PBL可以维持在任何适合的哺乳动物细胞培养基如RPMI1640或MDM中。
[0033]所公开的主题还包括在Y STCR激动剂存在下、优选地通过有规律添加(更优选地连续添加)所述激动剂(其优选地是可溶或固定的)并且在至少一种Y C-细胞因子存在下，优选地通过有规律添加(更优选地连续添加)所述细胞因子或多种细胞因子，在适当的培养基中培育这些细胞的方法。将所述Y S TCR激动剂和Y C-细胞因子在培养时并且还在整个培养时期自始至终(优选地每3-6日)添加至所述细胞培养物，从而Y STCR激动剂和Y C-细胞因子在所述培养物中的浓度通常总是大于零。
[0034]在一个优选实施方案中，可以实施所述Y δ TCR激动剂和Y C-细胞因子的添加直到至少40%、更优选地至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、95%的细胞表达天然细胞毒性受体。在一个优选实施方案中，可以实施所述Y S TCR激动剂和Y C-细胞因子的添加直到实现多于五千万个、多于一亿个、多于两亿个有活力和有功能的表达天然细胞毒性受体的细胞，即天然细胞毒性受体包括ΝΚρ30或由其组成。
[0035]在所公开的方法的一个更优选的实施方案中，可以实施所述Y STCR激动剂和YC-细胞因子的添加直到至少40%、更优选地至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、95%、100%的细胞表达NKp30。 [0036]在所公开的方法的其他优选实施方案中，所述Y STCR激动剂可以是任何可溶性或固定化的能够激活、刺激或触发在全部νδ 1+Y SPBL中表达的Y STCR/⑶3受体复合体的分子或化合物，包括但不限于植物凝集素(包括植物血凝素-ΡΗΑ)、抗CD3单克隆抗体(包括0KT3mAb)、抗y δ TCR单克隆抗体或其混合物。可以使用针对V δ 1+ y δ TCR的其他激动剂抗体。术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、单链抗体、单链可变片段和重组产生的结合配偶物。更优选地，Y STCR激动剂浓度的范围可以在0.01-1OOyg/ml之间、甚至更优选地在1-5 μ g/ml之间变动。
[0037]在所公开的方法的一个更优选的实施方案中，所述“Y C-细胞因子”意指细胞因子的常见细胞因子受体Y链家族，所述细胞因子优选地是白介素，即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21或其混合物，等等。所用的白介素可以是人或动物源的，优选地是人源的。它可以是野生型蛋白或任何具有生物活性的片段或变体，也就是说，能够在本发明方法的条件下结合其受体并且诱导Y ST细胞的活化。更优选地，所述细胞因子可以处于可溶性形式、与另一种分子(如例如肽、多肽或生物活性蛋白)融合或与之复合。优选地，使用人重组Yc细胞因子。更优选地，白介素浓度的范围可以在l-10000U/mL之间，甚至更优选地在100-1000U/mL之间变动。
[0038]在所公开的方法的其他优选实施方案中，所述Y δ TCR激动剂和Y C-细胞因子的有规律添加可以进行2-60日、更优选地在9-25日之间、甚至更优选地在10-15日之间，SP
11、12、13、14 日进行。
[0039]发明概述
[0040]本发明描述了包含Y δ T细胞的外周血淋巴细胞系、其组合物及生产方法，所述细胞系优选地表达ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46，其用于医学，即用于癌症免疫疗法中。
[0041]本发明公开了表达天然细胞毒性受体(NCR)的νδ2(_)νδ1+Υ STOL的新亚类，所述新亚类直接介导杀伤白血病细胞系和慢性淋巴细胞白血病患者的瘤细胞。已显示NCR+V δ I+T细胞可以在采用Y C-细胞因子和泛TCR激动剂刺激时，借助需要功能性ΡΙ-3Κ/AKT信号传导的过程，从总Y SPBL中分化并扩充。令人惊讶地，这种亚类稳定地表达ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46，以及高水平的粒酶B，所述粒酶B以增强的针对淋巴样白血病细胞的细胞毒性结合。特异的功能获得和功能丧失实验表明，ΝΚρ30和ΝΚρ44在TCR非依赖性白血病细胞识别中发挥非冗余和协同作用，但是ΝΚρ46不是如此。因此，NCR+V δ I+T细胞构成用于人癌症过继细胞免疫疗法的诱导性和特化的杀伤淋巴细胞群体。
[0042]附图简述
[0043]以下图提供说明本说明书的优选实施方案，其不应当被视为限制发明范围。
[0044]图la、lb、Ic-用泛T细胞促分裂原活化的Y δ PBL培养物的增强的抗白血病细胞毒性。(A) y δ外周血淋巴细胞(Y 5PBL)从健康志愿者外周血经MACS分选(左小图)，并且用HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2刺激4_19日。通过流式细胞术针对⑶69上调(中部小图；将新鲜分离的对照细胞中的水平加阴影表示)和CFSE稀释物(右小图；点线指示初始CFSE水平)评价活化。(B-C)预活化(持续14日，如A中那样)的Y δ PBL与DDAOse-标记的白血病细胞共孵育3小时。使用流式细胞术通过膜联蛋白-V染色评价肿瘤细胞溶解。(B)6个不同供体对Bvl73白血病细胞系的代表性结果。百分比指膜联蛋白-V+肿瘤细胞。基础肿瘤细胞凋亡(在不存在Y S PBL的情况下)〈5%。(C)6位不同供体与4个白血病靶细胞系的结果汇总。误差线代表SD(n=6，*p〈0.05 ;**p〈0.01)。(D)在新鲜分离、HMB-PP/IL-2-活化和PHA/IL-2-活化的Y δ PBL中GzmBmRNA水平的实时PCR定量。这个图中的数据是具有相似结果的2-3个独立实验的代表。
[0045]图2a、2b、2c_诱导用泛T细胞促分裂原活化的Y δ PBL中的天然细胞毒性受体表达。将Y SPBL如图1中所述那样培养4-19日，并且通过流式细胞术分析各种NK受体的表面表达。(A)在源自6位独立健康供体的用HMB-PP/IL-2 (灰色)或PHA/IL-2 (黑色)活化的10 H培养物中NKG2D、2B4和DNAM-1的结果。误差线代表SD(n=6 ；p>0.05)。(B)NKp30在(A)的相同培养物中的表达。FACS图对应于源自3位独立供体的培养物。百分比指ΝΚρ30+ SPBL0图7中提供同种型对照染色。(C-D)在新鲜分离、HMB-PP/IL-2-活化和PHA/IL-2-活化的 δ PBL 中 Nkp44 (C)和 Nkp46 (D)mRNA 水平的实时 PCR 定量。(E)在(A)中所述的培养物中NKp30+细胞的百分比演进，分析至多到第19日。误差线代表SD(n=5)。(F)在总Y SPBL中或从PHA/IL-2-活化的y SPBL培养物(如B中)中经FACS分选(>99%纯)的ΝΚρ30Η δ PBL中ΝΚρ30表达的诱导。细胞用PHA/IL-2刺激14日。这个图中的数据是具有相似结果的2-4个独立实验的代表。 [0046]图3a、3b_天然细胞毒性受体在正增殖的νδ I+T细胞上选择性表达。(A)将
YS PBL用CFSE标记和如图1中所述那样或在不存在T细胞促分裂原的情况下(即，单独的IL-2)培养。在培养7日之后对CFSE稀释物和V δ 2TCR表达进行流式细胞术分析。(B)与PHA/IL-2 —起培养至多到19日的总 δ PBL当中V δ 1+或V δ 2+细胞的百分比。误差线代表SD(n=3)。(C)PHA/IL-2-活化的 δ PBL亚类中的NKp30表达。将V δ 1+或V δ 2+细胞从外周血经FACS分选，用CFSE标记并且与PHA/IL-2 —起培养7日。百分比指每次细胞分裂内的ΝΚρ30+细胞(根据CFSE水平并且由竖直矩形指示)。(D)在PHA/IL-2刺激19日后的V S I+T细胞中ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46的表达。也显示了同种型mAb对照染色。这个图中的数据是具有相似结果的2-3个独立实验的代表。
[0047]图4a，4b_AKT依赖性Y c细胞因子和TCR信号诱导V δ I+T细胞中的ΝΚρ30表达。(A-B)在单独或与PHA或0ΚΤ3(抗⑶3mAb)组合的IL-2或IL-15存在下7日后，在来自
Yδ PBL培养物的预设门的V δ I+T细胞上ΝΚρ30表达的流式细胞术分析。(C)阻断性抗TCRy SmAb对PHA/IL-2活化的 δ PBL中ΝΚρ30诱导的影响。带阴影的灰色是7-日对照培养物中的预设门的ΝΚρ30+细胞。(D)化学抑制剂LY294002和U0126对PHA/IL-2活化的、用CFSE预标记的Y SPBL中ΝΚρ30诱导的影响。这个图中的数据是具有相似结果的2-3个独立实验的代表。
[0048]图5_ΝΚρ30和ΝΚρ44介导NCR+ Y δ PBL的肿瘤细胞杀伤。(A)使用特异性单克隆抗体，在经PHA/IL-2活化并扩充的Y SPBL对Fe Y R+P815靶细胞系的4小时51Cr释放重定向杀伤测定法(以2:1效应子:靶比率)中对ΝΚρ30，ΝΚρ44和ΝΚρ46的功能性评价。数据表述为一式三份进行的8个独立实验的平均值和SD (*p〈0.05，#*p〈0.001 ;ns=统计上不显著)。(B)针对NKp30、NKp44和NKp46 (或对照IgGl同种型对照)的阻断性抗体对Y δ PBL杀伤白血病细胞系Molt-4测定法的影响，其中所述Y SPBL经PHA/IL-2活化并扩充。在指出的情况下，还添加阻断性抗TCR Y SmAb(TCR)。通过如图1中所述的膜联蛋白-V染色评估肿瘤细胞死亡。误差线代表SD(n=3, **p〈0.01 ;***p〈0.001)。
[0049]图6a，6b-NCR+ Y δ PBL是被赋予针对原发性淋巴细胞白血病的增强细胞毒性的稳定亚类。ΝΚρ30+和ΝΚρ30Η gamma δ PBL从14日的PHA/IL-2活化的培养物经FACS分选。(A)纯化群体中ΝΚρ30表达的再分析。⑶与新鲜分离的Y SPBL相比，在ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+gamma δΤ细胞中Nkp44 (左)mRNA水平和Nkp46 (右)mRNA水平的实时PCR定量。误差线代表SD (n=3)。
(C)在IL-2存在下培养分选的ΝΚρ30+gamma δ PBL0 14日后分析ΝΚρ30、ΝΚρ44和ΝΚρ46表达。(D)在采用白血病细胞系Βν173的杀伤测定法(如图1中)中使用ΝΚρ30(_)或ΝΚρ30+gamma δ T细胞，或新鲜分离的Y δ PBL0通过膜联蛋白-V染色评价肿瘤细胞死亡(η=3, *ρ〈0.05)。
(E)在新鲜分离的ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+gamma δ T细胞中GzmB mRNA水平的实时PCR定量。误差线代表SD(n=3)。(F-G)在采用、δ PBL的杀伤测定法(如图1中)中使用的5份原发性B-细胞慢性淋巴细胞白血病样品的代表性图(F)和数据汇总(G)，其中所述Y SPBL获自6位不同供体并且经HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2活化。来自HMB-PP/IL-2-活化的培养物的NCRh gamma δ PBL (灰色棒)与来自PHA/IL-2-活化的培养物的NCRw gamma δ PBL (黑色棒)比较。误差线代表 SD (η=6, *ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;_ρ〈0.001)。
[0050]图7-PHA/IL-2活化的Y δ PBL中针对ΝΚρ30的同种型对照染色。在来自图1-2中所述的PBL培养物的设门TCR gamma δ +细胞中的流式细胞术IgGl染色。数据是6个独立实验的代表。
[0051]图8-Vy9VS 2PBL并不偏好地易感于PHA诱导的凋亡。如图1和图3所述，将
YSPBL随HMB-PP/IL-2或PHA/IL-2—起培养。在培养7日之后，通过流式细胞术分析在预设门的V δ 2+细胞内部的凋亡性膜联蛋白-V+细胞。
[0052]图9-用PHA/IL-2活化的Y δ PBL培养物中V δ I+T细胞富集。如图1和图3所述，将Y δ PBL与PHA/IL-2 —起培养19日，并且通过流式细胞术对V δ ITCR和⑶3表达进行分析。
[0053]图10-新鲜分离的Y SPBL不表达ΝΚρ30。从两位健康供体新鲜分离的Y δ PBL中针对ΝΚρ30和V δ ITCR表达的流式细胞术数据。数据是15位不同健康供体的代表。
[0054]图1l-TCR加上IL-2信号诱导了增殖νδ I+T细胞中的ΝΚρ30表达。V δ I+T细胞中的ΝΚρ30表达，所述V δ I+T细胞从外周血经FACS分选，用CFSE标记并且随同或不随同0KT3mAb和IL-2 —起培养7日。
[0055]图12-NCR+V δ I+PBL中增加的CD56表达。V δ I+PBL中CD56和CD27表达的流式细胞术数据，所述V δ I+PBL经PHA/IL-2活化19日并且对ΝΚρ30Η或ΝΚρ30+细胞设门。
[0056]图13_B7h6在大部分淋巴样白血病样品中不过量表达。在(A)急性淋巴母细胞性白血病细胞系；(B)T细胞急性淋巴母细胞性白血病患者样品；(C)B-细胞慢性淋巴细胞白血病患者样品上，对B7h6表达的实时定量PCR数据。健康新鲜的PBMC作为参考显示(短划线)。将B7h6水平针对持家基因Gusb和Psmb6归一化并且以任意单位表述。误差线代表三次重复测量的SD。
[0057]图14-PHA/IL-2活化的培养物中的Y δ PBL的表型。如图1和图3所述，将Y δ PBL随PHA/IL-2 —起培养19日，并且通过流式细胞术对(A) V δ ITCR和⑶3表达；(B)⑶I Ic和⑶8表达进行分析。PHA/IL-2活化的细胞以实线描述。
[0058]图15-ΝΚρ30+Y SPBL针对来自多种组织来源的癌细胞具有高度细胞毒性。gammaδ外周血淋巴细胞(Y δ PBL)从健康志愿者外周血经MACS分选，并且用PHA/IL-2刺激2周。将ΝΚρ30+ y δ PBL进一步经FACS-分选，并且在采用以下一系列肿瘤细胞系的3小时杀伤测定法中使用:急性淋巴母细胞性白血病-ALL(RS4-11)、急性髓细胞白血病-AML(HL-60)、慢性髓性白血病-CML(K562)、慢性淋巴细胞白血病-CLL(MEC-1)、骨髓瘤(KMMl)、Burkitt淋巴瘤(RAJI)、滤泡淋巴瘤(D0HH2)、乳腺癌(MDA231)、肺癌(NC1-H520)、前列腺癌(PC3)、结肠癌(HCT116)、膀胱癌(UM-UC-3)、肾细胞癌(VMRC-RCW)、皮肤黑色素瘤(MEL-1)。通过膜联蛋白-V染色评价肿瘤细胞死亡(n=3，*p〈0.05)。
[0059]发明详述
[0060]公开的主题涉及了包含Y δ T细胞的外周血淋巴细胞细胞系、其组合物及生产方法以及在医学中(即在癌症治疗中)的用途。这些Y S T细胞表达V δ I+T细胞受体(TCR)和功能性天然细胞毒性受体(NCR)。NCR在V δ I+T细胞中被由Y C-细胞因子和V δ I+TCR协同提供的AKT依赖性信号所上调。
[0061]本发明公开了新的V δ I+PBL亚类，所述亚类能够靶向对充分活化的VY 9V δ 2PBL有高度抗性的血液学肿瘤。这种VS1+群体所拥有的特化杀伤细胞功能归因于天然细胞毒性受体的诱导表达，所述天然细胞毒性受体已经大多被视为NK特异性标记。已显示，虽然V5 1+或V δ 2+细胞均不以组成型方式表达NCR，但这些NCR可以在V δ 1+细胞中被y。-家族细胞因子和V δ I+TCR协同提供的AKT依赖性信号所选择性上调。还显示ΝΚρ30和ΝΚρ44均在NCR+V δ I+PBL中有功能，并且对它们增强的淋巴细胞性白血病细胞靶向作用作出关键贡献。[0062]公开的主题涉及Y c细胞因子和促有丝分裂(PHA或0ΚΤ3)刺激物的组合在可大小选择的V δ I+PBL亚类中诱导NCR表达，其中所述V δ I+PBL亚类被赋予增加的针对血液学肿瘤的溶细胞活性。虽然PHA是非生理性的T细胞促分裂原，但是已证实通过在V δ I+PBL上交联TCR/CD3复合物，完全模拟了它对NCR诱导的作用。因此，NCR诱导与TCR介导的
Vδ I+细胞增殖耦合，同时还需要Y c细胞因子信号。
[0063]在诱导性NCR当中，基于以下事实而言，ΝΚρ30对V δ I+T细胞的抗肿瘤活性是最重要的:表达ΝΚρ30的细胞比例(图3D);当ΝΚρ30触发时V δ I+T细胞的细胞毒性有更多增强(图5Α);和当阻断ΝΚρ30时，白血病细胞杀死显著减少(图5Β)。尽管如此，ΝΚρ44(而不是ΝΚρ46)也在NCR+V δ I+细胞中有功能(图5Α)，并且似乎与ΝΚρ30协同用于增强的肿瘤靶向作用(图5Β)。
[0064]ΝΚρ30和ΝΚρ44均已经涉及人NK细胞对病毒感染细胞的识别。对肿瘤而言，抗体介导的阻断实验展示在骨髓瘤和黑色素瘤细胞靶向方面的重要作用。另外，缺少NCR表达已经在临床上与AML患者中的不良存活关联起来了。
[0065]V δ I+T细胞是胎儿/早期生活期间的优势Y δ T细胞亚类，此时它们已经能够响应于病毒性感染。在成人中，V δ I+T细胞扩充已经与CMV感染、HIV-1感染和上皮源来源或造血来源的肿瘤相关。过继转移活化的VS δΤ细胞的一个诱人方面在于，它们可以显示特别良好的组织归巢能力，因为与它们的循环型V δ 2+对应物相反，V δ I+细胞是偏好组织结合的淋巴细胞(Groh，Spies, Sciencel998)。有趣地，粘膜表面处V δ I+T细胞的丰度已经被归因于IL-15，后者诱导控制TCR基因重排的染色质修饰。
[0066]本发明描述了 NCR+V δ 1+细胞能够靶向原发性淋巴样白血病细胞，考虑到先前已经报导V δ Τ细胞是原发性白血病或淋巴瘤细胞的无效杀伤者，这是特别有意义的。本发明也公开了在体外PHA处理时V δ I+T细胞(在 δ PBL当中)的偏好扩充(图3Β)。因为这不归因于优势V δ 2+对应物的选择性凋亡(图8)，所以它肯定源自接收PHA依赖性TCR信号时V δ 1+细胞的增殖优势(图3Α-Β)。先前观察到V δ I+T细胞表达明显更高水平的⑶27辅助受体(与νδ 2+细胞相比时)。在人类和小鼠中，CD27刺激增强细胞周期蛋白D2表达并且促进Y δT细胞在体外和体内增殖。
[0067]本发明描述了 νδ 1+细胞上NCR表达的有效诱导取决于TCR刺激；在TCR不存在的情况下，Y。细胞因子可以仅实现非常温和的NCR表达上调(图4Α-Β)。因此，TCR信号位于的NCR+V δ I+淋巴细胞的NCR介导肿瘤细胞识别上游。 [0068]从临床角度，本发明描述了离体诱导NCR的方法，并且描述了一种非常可行的将大量细胞扩充并注射至患者中的方式。可以通过施用低剂量IL-2(这似乎足以支持NCR表达)，潜在地在体内维持这些细胞的活化状态。
[0069]PHA/IL-2活化的ΝΚρ30+ Y δ T细胞偏好地表达⑶Ilc和⑶8。⑶Ilc是通常在其他淋巴细胞中表达的黏附分子，并且已经显示参与肿瘤细胞的识别。
[0070]材料和方法
[0071]人外周血Y δ T细胞的分离。外周血采自匿名健康志愿者，用PBS (优选地，Invitrogen Gibco)稀释1:1(ν/ν),并且优选地在Ficol_Paque(优选地，Histopaque-1077, Sigma)以体积比 1:3 (I 份 ficol 对 3 份稀释的血液)在 1500rpm和 25°C时离心30分钟。将含有单个核细胞的界面收集并(在PBS中)洗涤，并且借助正选择(优选地，采用FITC-标记的抗TCRy§抗体)或借助负选择(采用生物素标记抗体的混合物；优选地，Miltenyi Biotec),通过磁性细胞分选法分离Y δ T细胞(至高于95%的纯度)。
[0072]细胞培养物。将分离的Y δ PBL以IO6个细胞/ml在37°C，5%C02于含有RPMI1640的圆底96孔平板中培养，所述RPMI1640具有2mM L-谷氨酰胺(优选地，InvitrogenGibco),补充有 10% 胎牛血清(优选地,Invitrogen Gibco)、ImM 丙酮酸钠(InvitrogenGibco), 50mg/ml 青霉素 / 链霉素(优选地，Invitrogen Gibco)。在 100U/mL rhIL-2 (优选地，Roche Applied Science)存在时，在具有或没有IOnM HMB-PP(4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯；优选地,Echelon Biosciences)和1μ g/ml植物凝集素(PHA ;优选地，Sigma-Aldrich)的情况下扩充细胞。洗涤细胞并且每5_6日更换培养基培养基。为研究 NKp30 表达的诱导，将 Y 3PBL 在 100U/mL rhIL2 (优选地,Roche Applied Science)、
Iμ g/ml 可溶性抗 CD3 抗体(优选地，eBioscience,克隆 OKT3)和 20ng/ml rhIL-15 (优选地，Biolegend)存在或不存下培养。为了 TCR阻断，将新鲜分离的 δ PBL用CFSE标记，并且随后与1:20稀释于补充有I μ g/ml PHA和100U/mL rhIL2的完全培养基中的抗TCRy δ (优选地，Beckman Coulter，克隆IMMU510)孵育7日。为研究信号转导化学抑制剂的作用，将MEK抑制剂U0126和P1-3K抑制剂LY294002 (优选地，二者均来自Calbiochem)以IOmM添加，持续2-小时孵育时间，并且随后在含有100U/mL rhIL2和I μ g/ml PHA的培养物中维持7日。
[0073]流式细胞术细胞分选。为了基于NKp30和νδ I+TCR的表达分选Y SPBL，将源自PHA/1L-2活化的培养物中的细胞用抗ΝΚρ30 (优选地，B i ο I egend，克隆Ρ30-15)、抗
Vδ I (优选地,Thermo Fisher Scientif ic,克隆TS8.2)染色并且在FACSAria细胞分选仪(优选地，BD Biosciences)上分选。
[0074]白血病患者样品。B-细胞慢性淋巴细胞性白血病细胞从出席、知情同意及机构审查委员会批准后(Instituto Portugues de Oncologia de Lisboa, Portugal)患者的外周血获得。样品通过在Ficol-Paque上密度离心进行富集，并且随后在(如上文的)10%RPMI1640中洗涤2次。
[0075]体外肿瘤杀伤测定法。将全部肿瘤细胞系均培养于(如上文的)10%完全RPMI1640中，通过稀释和每3-4日1:3分瓶以105至多到106个细胞/ml维持。对于细胞毒性测定，将经磁力纯化的Y δ PBL在IL-2(100U/mL)和1 μ g/mL PHA或IOnM HMB-PP存在下预活化7-19日。对于受体阻断，将Y SPBL与阻断性抗体抗NKp30(克隆F252)、抗NKp44(克隆 KS38)、抗 NKp46 (克隆 KL247)或抗 TCR y δ (Beckman Coulter,克隆 IMMU510)孵育 2 小时。在杀伤测定法期间在培养基中维持所述阻断性抗体。肿瘤细胞系或白血病原代样品用CellTrace Far Red DDA0-SE 染色(I μ M ;Molecular Probes,优选地，Invitrogen),并且将每种3xl04个肿瘤细胞与RPMI中的3xl05个yδ T细胞在37°C和5%C02下于圆底96孔平板上孵育3小时。细胞随后用膜联蛋白V-FITC(优选地，BD Biosciences)染色并且由流式细胞术分析。对于重定向杀伤测定法，将经PHA/IL-2活化的y SPBL在标准51Cr释放测定法期间与NCR激动剂抗NKp30 (克隆AZ20)、抗Nkp44 (克隆Z231)或抗NKp46 (克隆Bab281)孵育4小时。
[0076]流式细胞术分析。细胞用以下荧光单克隆抗体标记:抗⑶3-PerCP_Cy5.5(优选地，eBioscience，克隆 0KT3)、抗 TCRy δ-FITC(优选地，eBioscience，克隆 BL I)、抗CD69-PE (优选地，BD Pharmingen,克隆 FN50)、抗 NKG2D_PE/Cy7 (Biolegend，克隆 IDl I)、抗 2B4-APC (优选地，Biolegend,克隆 Cl.7)、抗 DNAM-l-Alexa-Fluor647(Biolegend,克隆 DXlI)、抗 NKp30-APC(优选地，Biolegend,克隆 P30-15)、抗 V δ 2TCR-PE (优选地，Biolegend,克隆 B6)、抗 NKp44_APC(优选地，Biolegend,克隆 P44-8)、抗NKp46-AlexaFluor647(优选地，Biolegend,克隆 9E2)、抗 V δ 1TCR-FITC(优选地，ThermoFisher Scientific,克隆 TS8.2)、抗 NKp30-PE (优选地，Biolegend,克隆 P30-15)、抗小鼠IgGl K -APC同种型对照(优选地，Biolegend,克隆M0PC-21)、抗小鼠IgGl κ -PE同种型对照(优选地，Biolegend,克隆 M0PC-21)、抗 CD27_APC/Cy7 (优选地，Biolegend，克隆 0323)、抗⑶56-APC (优选地，Biolegend,克隆HCD56)。通过遵循标准CFSE染色方案(优选地，CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒， Invitrogen ;终浓度0.5mM)测量细胞增殖，通过膜联蛋白(优选地，BD Pharmingen)染色法评估凋亡。在FACSCanto流式细胞仪(优选地，BDBiosciences)上分析细胞。
[0077]RNA分离和cDNA产生。使用RNeasy微量试剂盒，根据制造商的方案(优选地，Qiagen，希尔登，德国)提取总RNA。通过分光光度法确定浓度和纯度，并且使用AgiIent2IOOBioanalyzer,以 RNA6000Nano 测定法(优选地，Agilent Technologies, PaloAlto, CA)证实完整性。使用随机六聚物和Superscript II第一链合成试剂(优选地，Invitrogen),将总 RNA 逆转录成 cDNA。
[0078]实时定量PCR(qPCR)在ABI Prism7500FAST序列检测系统上使用SYBR Green检测系统(优选地，二者均来自Applied Biosystems)进行qPCR。使用Primer3v.0.4.0在线程序(http://primer3.sourceforRe.net)设计引物。对于每种转录物，使用校正曲线方法进行定量。使用β 2-微球蛋白(b2m)、葡糖醒酸酶β (Glucoronidase beta,Gusb)和蛋白酶体亚基β类型6(Psmb6)作为持家对照用于基因表达归一化。使用以下引物:
[0079].b2m-正向 CTAT CCAG CGTA CTCC AAAG ATTC,反向 CTTG CTGA AAGA CAAG TCTGAATG ；
[0080].Psmb6-正向 GGCG GCTA CCTT ACTA GCTG,反向 AAAC TGCA CGGC CATG ATA ；
[0081].Gusb-正向 TGCA GCGG TGTA CTTC TG,反向 CCTT GACA GAGA TCTG GTAA TCA ；
[0082].B7-H6-正向 TCAC CAAG AGGC ATTC CGAC CT,反向 ACCA CCTC ACAT CGGT ACTCTC ；
[0083].Nkp44-正向 CCGT CAGA TTCT ATCT GGTG GT,反向 CACA CAGC TCTG GGTC TGG ；
[0084].Nkp46-正向 AAGA CCCC ACCT TTCC TGA,反向 TGCT GGCT CGCT CTCT AGT ；
[0085].Gzmb-正向 GGGG GACC CAGA GATT AAAA,反向 CCAT TGTT TCGT CCAT AGGA G。
[0086]全部样品一式三份运行并重复3次。使用ABI SDS vl.1序列分析软件(AppliedBiosystems)进行qPCR结果的分析。
[0087]统计分析。使用Student’s t_检验评估亚群之间的差异，并且在显著时显示为*p〈0.05 ;#p〈0.01 ;*#ρ〈0.0Olo
[0088]结果
[0089]用泛T细胞促分裂原活化的Y SPBL培养物的增强的细胞毒性。
[0090]比较了用PHA (充当强力T细胞促分裂原的植物凝集素)或特异性VY9V5 2TCR激动剂HMB-PP活化的Y δ PBL培养物(总是在IL-2存在下维持)的抗肿瘤杀伤能力(Morita, C.T., Jin, C., Sarikonda, G.和 Wang, H.2007.Nonpeptideantigens,presentation mechanisms, and immunological memory of humanVgamma2Vdelta2T cells:discriminating friend from foe through the recognition ofprenyl pyrophosphate antigens.Tmmunol Rev215:59-76)。虽然两种方案在活化 δ PBL方面类似地有效，如通过细胞增殖和⑶69上调所评价的(图1Α)，但是要指出的是，用PHA活化的样品是比经HMB-PP刺激的(供体来源相同的)样品一致更好的造血系统肿瘤细胞系杀伤者(图1B-C)。这在测试的全部供体之间有效(图1Β)，并且与粒酶B (淋巴细胞溶细胞机制的关键组分)的较高表达相关(图1D)。注意，如先前报道，缺少粒酶B表达的新鲜分离的Y 5PBL(图1D)显示十分低的抗白血病细胞毒性(〈10%杀伤)。
[0091]PHA刺激的Y SPBL培养物的优越细胞毒功能是一个令人惊讶的发现，因为已显示HMB-PP是高度优势的V Y 9V δ 2PBL亚类的十分强力的激活物(Morita，C.T., Jin, C., Sarikonda, G.和 Wang, H.2007.Nonpeptide antigens, presentationmechani sms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2Tcells:discriminating friend from foe through the recognition of prenylpyrophosphate antigens.Tmmunol Rev215:59-76)。与 HMB-PP 活化的 Y δ PBL 相比，PHA刺激的培养物显示改进的针对各种抗性白血病细胞系的细胞毒性，如Bv-173、REH或HPB-ALL (图1B-C)，所述抗性白血病细胞系已经显示缺少关键性NKG2D配体ULBPl的表达。这些数据表明，泛T细胞促分裂原PHA能够增加中期(1-3周) δ PBL培养物的溶细胞潜力，这可能对过继细胞免疫疗法具有巨大价值。
[0092]在用泛T细胞促分裂原活化的Y δ PBL上诱导NCR表达[0093]研究了 PHA活化的Y SPBL培养物的增强细胞毒性潜在的机制。以上数据可以由受体如NKG2D或DNAM-1或2B4的差异性表达解释。先前显示这些受体均参与杀伤淋巴细胞对肿瘤细胞的识别。然而，这些候选者均不在PHA-和HMB-PP活化的y δ PBL培养物之间差异性表达(图2Α)。相反并且出乎意料地，天然细胞毒性受体NKp30 (NK细胞细胞毒性的一种重要触发物)在PHA刺激的y δ PBL上特异性存在(图2Β ;图7)。另外，其他NCR家族成员，ΝΚρ44和ΝΚρ46，也在这些样品中选择性地表达(图2C-D ;见下文)。
[0094]ΝΚρ30+细胞的比例随培养时间稳定增加(图2Ε)，表明ΝΚρ30诱导与细胞增殖之间的关联。虽然不太可能归因于新鲜样品中十分低的背景(图2Ε)，但可能的是，组成型方式表达ΝΚρ30的某个微小亚类可能在PHA刺激的Y SPBL培养物中优先被扩充。为解决这个问题，采用经FACS高度纯化(>99%)的ΝΚρ30Η细胞进行实验，所述试验证实了在PHA+IL-2刺激时，ΝΚρ30(_)细胞能够与未分选细胞同样有效地获得ΝΚρ30表达(图2F)。另外，在这类条件下，ΝΚρ30(_)和ΝΚρ30+细胞以相似的程度增殖，这进一步反驳ΝΚρ30+细胞在这类条件下的优先扩充。这些结果表明当通过PHA/IL-2处理活化Y δ PBL时，从头诱导ΝΚρ30表达，这与细胞增殖耦合。
[0095]NCR由增殖的V δ I+T细胞选择性表达
[0096]考虑到HMB-PP已经证实是V Y 9V δ 2细胞的最佳激动剂，不过与HMB-PP相反，PHA处理偏好地扩充Y SPBL当中的νδ2(_)细胞(图3Α)。这不归因于在两种实验条件下νδ2+细胞凋亡的差异(图8)。如此显著扩充的最可能V δ 2(_)群体(图3Α)是V δ 1+细胞，因为其他亚类在健康成人的外周血中极为罕见。当评估νδ I相比较VS2TCR的使用时，在经PHA活化的培养物中发现V δ I+细胞大幅度富集(19日后，占全部y δ T细胞的>80%)(图3Β ;图9)。相反，并且如所述，经HMB-PP活化的培养物逐渐由V δ 2+细胞占优势(图3Α)。
[0097]在用PHA+IL-2刺激的分离的V δ 1+或V δ 2+细胞的平行培养物中检查ΝΚρ30表达的诱导。尽管新鲜分离的νδ 1+和νδ2+细胞均不表达ΝΚρ30(图10)，但是在V δ 1+细胞中而不在V δ 2+细胞中强烈诱导了这种NCR(当PHA+IL-2处理时)(图3C)。另外，通过进行CFSE稀释，证实了 NKp30+细胞的惊人积累，伴随V δ I+细胞的逐步分裂(图3C)。这些数据表明PHA/IL-2培养物中V δ I+细胞的活化诱导了 ΝΚρ30表达，同时伴有细胞增殖。
[0098]在培养物中2-3周之后通常检测到高百分比(>50%)的ΝΚρ30+细胞情况下，而ΝΚρ44(约30%)和ΝΚρ46 ?20%)在较低比例的V δ I+细胞中表达(图3D)。另外，大部分的ΝΚρ44+或NKp46+V δ I+细胞也表达ΝΚρ30 (图3D)。因此将ΝΚρ30视为诱导性NCR+V δ 1+亚类的提供信息最多的标记。
[0099]NCR诱导需要AKT依赖性Y c细胞因子和TCR信号
[0100]剖析了 NCR+V δ I+T细胞分化所需要的特定信号。首先，拆开活化方案的两个组分IL-2和PHA。IL-2或其相关的Y c细胞因子IL-15单独即足以诱导一些ΝΚρ30表达，但是与PHA/1L-2(或PHA/1L-15)组合相比较而言这种作用是轻微的(图4A)。在另一方面，PHA单独使用不能够使培养物保持活力，这与Y c细胞因子在Y S T细胞存活中、尤其当活化/增殖时的关键作用一致。
[0101]虽然PHA已经是广泛使用的T细胞促分裂原，但是它也是一种能够交联一系列表面受体(包括TCR)的非生理性化合物。因此，PHA刺激作用的分子介体可能是V δ I+TCR复合物。比较了 PHA和特异性交联TCR复合物的⑶3 ε链的0KT3mAb (与IL-2或IL-15组合时)在V δ 1τ细胞中诱导ΝΚρ30表达的能力。0ΚΤ3在这些测定法中完全能够模拟PHA (图4八-8)，因此在增殖的￥3 1+1'细胞中诱导爾?30(图11)。另外沖撤/几-2培养物中的1'0^ δ阻断作用防止ΝΚρ30诱导(图4C)。这些数据表明，PHA处理提供了 TCR信号以诱导V δ I+PBL上的NCR表达。另外，单独或与0KT3(或PHA)组合的细胞因子处理之间的差异凸显出这个过程中Y。细胞因子和TCR信号之间的明显协同作用(图4Α-Β)。
[0102]为了进一步探索NCR诱导的分子机制，使用Y。细胞因子受体和/或TCR信号传导下游的关键信号转导途径的化学抑制剂。尽管阻断JAK信号传导在任何NCR诱导之前触发了广泛的细胞死亡，但是与ΡΙ-3Κ/ΑΚΤ抑制剂LY294002的共孵育特异性阻止了增殖的νδ I+T细胞中的ΝΚρ30诱导(图4D)。AKT参与转导Y。细胞因子信号和TCR信号，包括TCR gamma δ信号。相反，MAPK/Erk抑制剂U0126对增殖的νδ I+T细胞中的ΝΚρ30诱导没有可检测的影响(图4D)。重要地，LY294002的选择性影响将NCR诱导与细胞增殖作用拆分开了，因此证实了 νδ I+T细胞增殖是诱导ΝΚρ30表达必需的(图3C ;图11)，但不是足够的(图4D)。综上，这些数据表明AKT依赖性Y。细胞因子和TCR信号协同作用以诱导V δΤ细胞中的ΝΚρ30表达。
[0103]有功能的ΝΚρ30和ΝΚρ44通过V δ I+PBL触发肿瘤细胞杀伤。
[0104]采用功能获得实验和功能丧失实验来评价NCR调节作用对V δ 1+富集(>80% ；图9Α)的PBL培养物的影响，所述PBL培养物以与图3D中相似的水平表达NCR。首先，通过使用反向Ab依赖性细胞毒性测定法，显示出NKp30或NKp44的交联(而不是NKp46的交联)产生高度明显的P815肿瘤细胞靶溶解增加(图5A)。这些数据证实了诱导的NKp30和NKp44是有功能的并且介导肿瘤细胞杀伤。为了评估它们是否在靶向白血病细胞中发挥非冗余作用，使用NCR特异性mAb进行受体阻断实验。当阻断NKp30和NKp44时观察到肿瘤细胞溶解的显著增加(图5B)。如从图5A中的结果所预期，NKp46阻断不影响肿瘤细胞杀伤。有趣地，还清楚地观察到NKp30和NKp44之间的协同效应。应当指出，在杀伤测定法期间，TCRy δ阻断在任何情形下(单独或与抗NCR mAb组合)均是中性事件(图5B)。这些数据暗示，NCR+V δ I+PBL对白血病细胞的靶向是一个大多通过ΝΚρ30和ΝΚρ44的协同功能所介导的TCR非依赖性事件。
[0105]NCR+V δ I+PBL是靶向耐药性原发性淋巴细胞性白血病的特化杀伤细胞。
[0106]为了充分表征NCR+V δ I+PBL的抗肿瘤潜力，将ΝΚρ30+细胞经FACS分选成高纯度099%)(图6Α)并且进行一系列功能测定。如预期(图3D)，分选的ΝΚρ30+细胞也表达ΝΚρ44和ΝΚρ46 (图6Β)，而且，当仅用IL-2培养2周时，这三种NCR在纯化细胞的表面上大体上稳定(图6C)。这些数据证实了稳定NCR+V δ Τ细胞亚类的便利扩充。
[0107]当评估ΝΚρ30+细胞的细胞毒功能时，观察到对耐药性白血病细胞系Βν173(连同其他)的靶向作用增加(与ΝΚρ30(_)对应物相比)(图6D)。这与粒酶B的更高表达相关(图6Ε)。另外，ΝΚρ30表达也与⑶56表达的较高程度相关(图12)，所述⑶56表达先前已经与人淋巴细胞(包括V δ 2+Τ细胞)的细胞毒性关联。
[0108]最后，采用从慢性淋巴细胞性白血病患者获得的原代样品，进行功能性杀伤测定。重要地，HMB-PP/IL-2活化的Y SPBL不表达NCR(图2B)。将它们的抗肿瘤溶细胞活性与分离自经PHA/IL-2活化的Y SPBL培养物的NCR+细胞比较。观察到从6位不同供体获得的NCR+ gamma δ PBL在消除原代B-CLL细胞方面一致地更高效(图6F-G)。[0109]本发明当然不以任何方式限于所述的实施方案，并本领域技术人员能预见到其修改的许多可能性，而不背离如所附权利要求书中所定义的本发明基本构思。
[0110]以下权利要求阐述本发明的具体实施方案。
【权利要求】
1.一种淋巴细胞细胞系，其中包含表达功能性天然细胞毒性受体的vsrY St细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其由表达功能性天然细胞毒性受体的VS1+Y ST细胞组成。
3.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中还包含VS 2+Y S T细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述天然细胞毒性受体包括NKp30。
5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述淋巴细胞来自外周血样品。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述天然细胞毒性受体包括NKp44。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述天然细胞毒性受体包括NKp46。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中包含表达粒酶B的细胞。
9.组合物，其中包含根据前述权利要求中任一项所述的细胞系的细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是可注射用的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于医学中。
12.根据前述权利要求所述的组合物，其用于自体或异源过继细胞疗法、肿瘤或癌症治疗、肿瘤或癌症免疫疗法和/或白血病治疗中。
13.根据权利要求11所述的组合物，其用于治疗急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、Burkitt氏淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾细胞癌或皮肤黑色素瘤。
14.根据权利要求11所述的组合物，其用于治疗病毒性感染。
15.根据前述权利要求所述的组合物，其中所述病毒来自疱疹病毒科(Herpesviridae)或逆转录病毒科(Retroviridae)。
16.生产权利要求1-8中任一项所述的细胞系的方法，所述方法包括分离YS PBL和在适当的培养基中培育这些细胞，同时添加Y S TCR激动剂和至少一种Y。-家族细胞因子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中实施所述YS TCR激动剂和Y。-细胞因子的有规律添加，直至至少40%的细胞表达天然细胞毒性受体。
18.根据前述权利要求所述的方法，其中实施所述YS TCR激动剂和Y。-细胞因子的有规律添加，直至至少40%的细胞表达NKp30。
19.权利要求16-18中任一项所述的方法，其中YS TCR激动剂是植物凝集素PHA、抗⑶3单克隆抗体、抗Y S TCR单克隆抗体或其混合物。
20.根据前述权利要求所述的方法，其中YS TCR激动剂浓度的范围是0.01-1OOiig/ml 。
21.权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述￥。-细胞因子是11-2、11-4、11-9、IL-12、IL-15、IL-21 或其混合物。
22.根据前述权利要求所述的方法，其中Y。-细胞因子浓度的范围是l-10000U/mL。
23.根据前述权利要求所述的方法，其中Y。-细胞因子浓度的范围是100-1000U/mL。
24.根据权利要求16-23所述的方法，其中添加所述YS TCR激动剂和Y。-细胞因子的时间范围是2-60日。
25.根据前述权利要求所述的方法，其中添加所述Yδ TCR激动剂和Yc-细胞因子的时间范围是9_25日。
26.根据前述权利要求所述的方法，其中添加所述Yδ TCR激动剂和Yc-细胞因子的时间范围是10-15日。
【文档编号】C12N9/64GK103635573SQ201280024189
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年5月21日 优先权日:2011年5月19日
【发明者】B·M·德卡瓦洛埃斯尔瓦桑托斯, D·瓦加斯考雷拉 申请人:分子医学研究所